אורגנואידים הערמונית הם מערכת במבחנה מרגשת לחקר התפתחות ומחלות. הם מתגברים על אתגרים של קווי תאים מונצחים ומציעים אלטרנטיבה זולה למודלים של בעלי חיים. הם יכולים להיות גדלים מתאים ערמונית אנושיים, כפי שהראינו בפרוטוקול זה, כמו גם תאי הערמונית של העכבר, כמערכת מודל פרה-קלינית רלוונטית למחלות.
מעבדות רבות תיארו שיטות תרבות שימושיות ונקודות קצה. אבל אנחנו מקווים לאחד את הפרטים האלה בפרוטוקול אחד ולהדגים את הצעדים המאתגרים במיוחד עבור משתמשים חדשים. ככל שהטכניקות משתפרות, אורגנואידים של סרטן הערמונית ניתן לגדל מדגימות המטופל כגישה רפואה מדויקת למחלות מודל ותגובה לטיפולים.
תנאי התרבות הם ספציפיים אורגנואידים הערמונית, אולם רבים של נקודות הקצה הותאמו מסוגי רקמות אחרים. משתמש יכול להתאים חלקים של פרוטוקול זה לסוג התא המעניין אותו. התחל ניסוי זה על ידי גידול תאי אפיתל במטריצה ג'ל מקודד 96 בארות צלחות כמתואר בכתב היד.
כדי לאסוף אורגנואידים מן הצלחות לאחר 12 ימים, להסיר בינוני מן בארות מבלי להפריע ג'ל מטריצה. לאחר מכן מוסיפים מיד כ-200 מיקרוליטרים של פרוטאז ניטרלי לכל באר ביחס של 1 ל-2 של ג'ל מטריצה לפרוטאז ניטרלי. דגירה את הצלחת במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
ואז פיפטה למעלה ולמטה כדי לנטרל מכנית את התערובת, ו דגירה שוב במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מעבירים את תערובת תאי הג'ל של מטריצת הפרוטאז הניטרלית מכמה בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך שלוש עד חמש דקות.
הסר את העל-טבעי, ושמור את גלולת האורגנואיד לניתוחים הבאים. כדי ליצור תבניות להטבעה, לגזור קטע קטן של קצה פיפטה 1,000 מיקרוליטר כדי להפוך גליל המכיל 50 microliters. ואז מהחלק הרחב יותר של אותו קצה, לעשות עובש רחב יותר שני שמתאים סביב התבנית הראשונה.
כדי ליצור בלוק קר, לעטוף חבילת קרח עם סרט הדבקה בצד למעלה. ואז לדבוק תבניות בניצב לקלטת. כדי להטמיע את האורגנואידים בתקע ג'ל היסטולוגיה לעיבוד, שטפו תחילה את גלולת האורגנואידים שהושגה בעבר עם מיליליטר אחד של תוסף המלח המאוזן של האנק.
לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך שלוש עד חמש דקות, להסיר את supernatant. לאחר מכן מוסיפים 30 עד 50 מיקרוליטרים של ג'ל היסטולוגיה נוזלי לכדור האורגנואידים, ומערבבים בעדינות על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה כדי לעכל מחדש את גלולה. מעבירים את התערובת לתבנית על הבלוק הקר, ומאפשרים לדגימה להתקרר ולהתחזק לתקע.
לאחר מכן, השתמשו בבוכנה כדי לדחוף את התקע אל מחוץ לתבנית הקטנה ולתוך מרכז התבנית הגדולה יותר, ולמלא אותו על ידי צינורות ברורים 2%agar סביב התקע. כדי לסמן את החלק העליון של המדגם, פיפטה היסטולוגי צבע כהה 2% אגר על גבי התקע. לאחר שהאגר התקרר, השתמש בבוכנה כדי להעביר את התקע לקלטת היסטולוגיה.
סמן את הקלטת בעיפרון והצב אותה בפורמלין במאגר ניטרלי של 10%עבור קיבעון לילה. למחרת, להעביר את הקלטת מ 10% ניטרלי מאגר פורמלין ל 70% אתנול כיתה היסטולוגית, ולעבד אותו עוד יותר להטמיע פרפין. התחל על ידי גיזום בסיס הבלוק בעובי של 10 מיקרומטר.
לאחר שיופיע מקטע המכיל את אזור התקע, הפסק את החיתוך. נעלו את רוטור המיקרוטום, והעבירו את הבלוק חזרה לקרח כדי לצנן. הזז את הלהב לחלק חדש שלא היה בו שימוש.
ולהעביר את הבלוק בחזרה למהדק. בטל את נעילת המכונה והתחל לקצץ בחמישה מיקרומטרים לכל מקטע. השתמש פינצטה כדי להעביר את החלק לאמבט מים 40 מעלות צלזיוס, ולאפשר לו להתפשט.
טובלים מגלשה אנכית במים כדי להעביר את החלק אליו. לאחר מכן התבונן בשקופית תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להבטיח כי אורגנואיד קיים בסעיף. אופים לילה ב 45 עד 50 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להמשיך עם כתמים כמתואר בכתב היד.
התחל חלק זה של הניסוי עם בארות שאינן שימוש של צלחת 96 היטב מטריצה מצופה ג'ל עם אורגנואידים. על ידי צינורות בצד הבאר, משאיר מקום בין מדיה ג'ל מטריקס, להסיר בזהירות מדיה רבה ככל האפשר מבלי לשבש את התרבות organoid. השתמשו בקצה פיפטה קצוץ של 1,000 מיקרוליטר, רטוב מראש עם PBS כדי להכין טיפה אחת של ג'ל מטריצה המכילה את האורגנואידים המעניינים.
לוותר על הירידה על אמצע מגלשת תא. בעין בלתי, שאפו את המדיה העודפת ואת ג'ל המטריצה ממגלשת התא באמצעות פיפטה עדין. כדי לקדם דבקות אורגנואידית בזכוכית ולמנוע אובדן דגימות במהלך שלבי הכביסה הבאים.
מניחים את השקופית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות. צינורות לאט כדי למנוע ניתוק מן המנה, להוסיף 200 microliters של 1X PBS לשטוף את האורגנואידים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות. הסר בזהירות את ה-PBS 1X והוסף 200 מיקרוליטרים של 4%paraformaldehyde.
יש לתקן במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות. ב- PFA, לשטוף ולהמשיך עם צעדי permeabilization וכתמים הבאים כמתואר על ידי פרוטוקול זה. הר ותמונה באופן מיידי.
שקופית טריים שאינם מזוהמים מציגה בבירור אורגנואידים ראשוניים של הערמונית האנושית, ואילו בשקופית יבשה לא מזוהמת, אורגנואידים נראים שקופים וקשות יותר לגילוי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. המטוקסילין וכתמי אאוסין מראים אורגנואיד ערמונית ראשי אנושי שבור מניתוח לקוי, כגון צינורות אגרסיביים, פרוטוקול עיבוד שגוי בהשוואה לאברנואיד מטופל היטב. אורגנואיד הערמונית העיקרי האנושי היה פורמלין קבוע, מוטבע פרפין, חתוך, מוכתם ציטוקרטין בסיסי 5 ו cytokeratin luminal 8, בזלת p63 ו cytokeratin זוהר 8, ותמונה עם מיקרוסקופ confocal.
אורגנואיד הערמונית העיקרי האנושי כולו היה מוכתם ציטוקרטין בסיסי 5 או ציטוקראטין לומינאלי 8, והוכתם עם פאלודין ו DAPI, ותמונה עם מיקרוסקופ קונפוקל. אורגנואיד תאי הערמונית הראשי האנושי כולו היה מוכתם ב-Edu עם תווית פלואורסצנטית ומושפע מהוושט, ומדמיין אותו במיקרוסקופ קונפוקלי. חשוב לדמיין את האורגנואידים שלך לאורך כל ההליך.
לאחר איסוף המקטעים, הקפד לדמיין את הדגימות בשקופית, וודא שאתה מתבונן באורגנואידים במהלך הרכבה שלמה. לאחר איסוף האורגנואידים מג'ל המטריצה, ניתן להרכיב אותם לגמרי ולהשתמש בהמתזות מסחריות, או להתנתק לתאים בודדים לצורך ציטומטריית זרימה או רצף חד-תאי. תרבות תלת מימד מספקת לחוקרים דרך חדשנית ללמוד רקמה בהגדרת צלחת מעבדה.
זה יכול להיות מיושם על organogenesis, או להבנת הפתולוגיה של מחלת החולה. כאשר עובדים עם דגימות המטופל, תמיד לנקוט זהירות ולטפל בחומרים כפוטנציאל לחשיפה פתוגן המועבר בדם.
