פרוטוקול זה מספק שיטות סטנדרטיות לשחזור להערכת תגובות פרמקולוגיות בתרבויות אורגנואיד הערמונית. תרבויות אורגנואיד הערמונית לספק מערכת במבחנה המשמר היבטים רבים של ביולוגיה in vivo ותגובה פרמקולוגית על ידי מתן תאים לאמץ מבנה תלת מימדי מטריצת קרום במרתף. אנו נרגשים במיוחד להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך כיצד גנוטיפ מכתיב תגובה תרופתית בערמונית ולדגמן עמידות לתרופות.
ניתן ליישם שיטות אלה על מערכות תרבות אורגנואידיות שמשתמשות בשיטת ציפוי הכיפה. עם זאת, הרכיבים במדיה כגון גורמי גדילה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הרקמה. הדגמה חזותית תאפשר דיון ספציפי ומפורט יותר של שלבי הפרוטוקול וכיצד הם שונים מהמערכות הרבות האחרות לתרבות האורגנואידים שפורסמו העומדות לרשות החוקרים.
תרבות אורגנואידית היא בדרך כלל יותר זמן רב מאשר תרבות תאים דו מימדית. הקפד להקצות זמן נוסף עבור שיטות אלה. התחל על ידי בידוד אורגנואידים הערמונית מעכבר או רקמה אנושית.
טחון אנזימטי לעכל את הרקמה כדי לייצר השעיה תא יחיד, ולאחר מכן לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. לספור את התאים ולתלות אותם מחדש במטריצת קרום המרתף. ואז צלחת אותם בצפיפות המתאימה כיפות מטריקס על צלחות תרבות אורגנואידים מחומם מראש.
כיפות צריכות להיות שני מילימטרים זה מזה ומהסיד של הגם. לאחר ההתגבשות, הוסיפו בעדינות מדיה מהצד של באר כדי למנוע שיבוש של המטריצה. לאחר כיפות התגבשו, להוסיף מדיה על גבי הכיפה, כך שהם מכוסים לחלוטין.
הגדל אורגנואידים לכמות הרצויה עבור יישומים במורד הזרם הקובעים את מספר התא בשיטות ספירה סטנדרטיות. כאשר האורגנואידים מוכנים לשימוש, צייר את המדיום עם פיפטה Pten00 ו pipette אותו למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף. מעבירים את ההשעיה לצינור חרוט 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
שאפו את העל-טבעי ושטפו את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של PBS. חזור על הצנטריפוגה, ולאחר מכן resuspend את גלולה בארבעה מיליליטר של החלפת טריפסין ולאפשר לו לעכל במשך חמש עד 10 דקות תוך רועד ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד עם 10% FBS כדי לעכב את החלפת טריפסין צנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן מסננים את התאים עם מסנן 40 מיקרומטר כדי להבטיח השעיה של תא יחיד ולספירתם באמצעות המוציטמטר. לדלל את ההשעיה התא ל 100 תאים לכל 10 microliters באמצעות מדיום אורגנואיד עם 10 מעכבי micromolar rho kinase Y27632.
העבר 1, 100 תאים לצינור חרוט חדש ולהוסיף 285 microliters של מטריצת קרום מרתף אשר יגרום ריכוז מטריצה 70%. לאחר מכן, זרע את התאים ב 35 microliters של כיפות מטריצה בצלחת 24 באר מחומם מראש הקפדה צלחת שלושה עד חמישה שכפולים לכל מדגם. הפוך את הצלחת והצב אותה באינקובטור תאים כדי לחזק את מטריצת המרתף.
לאחר 10 דקות, להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף בינוני המכיל את מעכבי rho kinase. רענן את המדיום כל יומיים ולאחר שבעה ימים, לספור את מספר האורגנואידים הוקמה לכל כיפה ולחשב את אחוז האורגנואידים שנוצרו מתוך המספר הכולל של תאים. לאחר בידוד האורגנואידים כפי שתואר קודם לכן, זרע 1, 000 עד 10, 000 תאים בכיפת המטריצה באמצעות יעילות היווצרות אורגנואידים ומהירות צמיחה כנציג לקביעת מספר התא הסופי.
ואז זרעים 35 microliters של כיפות מטריקס בצלחת 24 היטב ולתת את הכיפה להתגבש. הוסף בינוני המכיל את מעכבי rho kinase ואת התרופה של בחירה. בצע יומן 10 מצטבר כדי לקבוע ריכוז מעכבות חצי מקסימלי באמצעות הרכב שבו התרופה הומסה כפקד.
רענן את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים ונתח את האורגנואידים ביום השביעי כדי לקבוע את התגובה הפרמקולוגית לתרופה על ידי ביצוע בדיקת כדאיות התא כמתואר בכתב היד. כדי צלחת שברי אורגנואיד ללא טריפסיניזציה, להשתמש Pten00 פיפטה כדי לשאוף את המדיום ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף. כאשר המטריצה משובשת לחלוטין, להעביר את ההשעיה לצינור חרוט 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
שאפו את העל-טבעי והוסיפו חמישה מיליליטר של PBS. לאחר הכביסה, תן שימוש חוזר באורגנואידים במיליליטר אחד של PBS ושבש את האורגנואידים על ידי טריטורציה עם פיפטה פסטר זכוכית. לכמת את מספר שברי אורגנואידים וזרע חמישה שכפולים עם 100 שברים כפי שתואר קודם לכן.
שבעה ימים לאחר מכן, בצע בדיקה של כדאיות התא בהתאם לכיווני כתב היד. תאים בזליים של הערמונית מסוג פראי הפגינו היווצרות אורגנואידית מעולה בהשוואה לתאי זוהר. עלייה קלה היווצרות אורגנואיד הושגה עם אובדן CRISPR-Cas9 מתווך של Pten או P53 ואובדן של שניהם גדל עוד יותר יכולת היווצרות.
ההשפעות של מולקולות אנטי אנדרוגנית על הצמיחה נבדקו אורגנואידים מורין עם גנוטיפים שונים. אובדן P53 לא גרם להתנגדות למולקולות האנטי אנדרוגניות, אך אובדן פנטן הגביר את ההתנגדות. אובדן כפול של P53 ו Pten, לעומת זאת, הביא להתנגדות מוחלטת.
עיכוב קולטן אנדרוגן גם שינה פנוטיפים. פרא סוג Pten נמחק P53 אורגנואידים שנמחקו הדגימו את הירידה בגודל לומן אורגנואיד בעוד אורגנואידים עם אובדן של Pten ו P53 לא הושפעו פנוטיפית. כצפוי, כאשר תאים אלה היו מושתלים תת עורית באגף, רק האורגנואידים Pten ו- P53 שנמחקו כפול גדלו.
שני אורגנואידים שונים של סרטן הערמונית האנושי MSKPCA2 ו MSKPCA3 נבדקו לתגובתם למולקולות אנטי אנדרוגניות. התפשטות האורגנואידים MSKPCA2 היה מעוכב מאוד ואילו אורגנואידים MSKPCA3 נשארו מושפעים. MSKPCA2 הביע רמות גבוהות של קולטני אנדרוגן ו FKBP5, כמו גם חלבונים זוהרים סימן ההיכר.
MSKPCA3 גם ביטא סמנים בסיסיים ומזנצ'ימליים ולא הראה שום ביטוי של FKBP5 המצביע על כך שאיברואידים אלה מודל פנוטיפ שאינו זוהר אנדרוגן עצמאי. אורגנואידים צריך להיות משובש מעת לעת או על ידי טריפסיניזציה או טריטורציה עם פיפטה זכוכית על מנת להישאר קיימא. התדירות תלויה במקור המינים ובגנוטיפ.
כל סוג של רצף הדור הבא או ניסוי פרוטומי ניתן לבצע בעקבות ההליכים המתוארים. ניסויים אלה יחקרו את הבסיס המולקולרי של הפנוטיפים והתגובות הפרמקולוגיות. טכניקת תרבות אורגנואידית תלת מימדית זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובות תרופתיות בהקשר גנטי מבוקר מאוד במבחנה.
זו יכולה להיות חלופה אמינה ללימודי vivo ארוכים.
