המחברים רוצה להודות הת'ר Currey על תרומתה הראשונית תכנון המחקר, ד ר מיטרה סווארופ עבור שלו סקירה ביקורתית של כתב היד. אנחנו רוצים גם תודה ד ר מיכאל ב. האריס הערות, ליטושים, סיוע בהפקת ההדגמה של מתודולוגיה זו. הזנים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis הממומן ע י המשרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספרים UL1GM118991, TL4GM118992 או RL5GM118990 ועל ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר 5P20GM103395-15. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים. UA הוא AA/EO המעסיק ו מוסד חינוכי, אוסר על הפליה נגד כל אדם: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis מסננת בנייה ושימוש
<ol><li>
פרוטוקול בנייה
	<ol>
<li>רוכשים 2 מכסים משפופרות חרוט 50 מ ל (איור 1 א').</li>
		<li>להסיר את האזור מרכז בתוך השפה הפנימית של הכיסוי (כאשר צפו התחתון, איור 1B) באמצעות מבער בונזן, מכשיר בדיקה מתכת חמה או במלחם או דרך המקדחה. הערה: שימוש בחום כדי לחתוך את מכסה פלסטיק עדיפה על להב כי יש פחות סיכון של פציעה.</li>
		<li>לנקות לשייף את הקצוות לחתוך, להתעלות על פני השטח עם קובץ מעוקל או של רוטרי טחינת כלי (למשל, Dremel). ראה איור 1C.</li>
		<li>חותכים את מעגל monofilament רשת השינוי עד לקוטר המתאים (איור 1D). בשביל זה, לאתר את מכסה על גבי גיליון monofilament רשת ניילון וחותכים בתוך קו שצויר.</li>
		<li>חותכים חריצים/חתכים המשטח העליון של הכיסוי כדי לשפר את הידבקות של הכיסוי שני דבק מוחל על הפלסטיק (איור 1E).</li>
		<li>לנקות את המכסים עם אתנול ולתת להן להתייבש.</li>
		<li>דבק cyanoacrylate חלות על המשטח העליון של שני העפעפיים, שמירה על הקצה החיצוני. הערה: דבק קטן עובר דרך ארוכה.</li>
		<li>שכב monofilament רשת השינוי, על פי טבלה 1, על המכסה מודבק אחד (איור 1F). המקום השני המכסה הפוך על גבי רשת השינוי; מכסים שני חייב להיות מקסימום שלהם יחד. לחץ בחוזקה יחד (איור 1 ג'י). ודא רשת השינוי מתוח. הערה: כאמצעי בטיחות, שימוש פינצטה כדי למקם את רשת השינוי העפעפיים.</li>
		<li>לאחר השכבה הראשונית של הדבק התייבש, להחיל טבעת של דבק מגע דבק מסביב הפער החיצוני בין עפעפיו. להיות נדיב כמו זה מוסיף שלמות ומונעת כל פילינג בנפרד או דולף.</li>
		<li>תווית את המסנן עם רשת שינוי גודל הנקבוביות monofilament רשת השינוי. הערה: כאן, אנו משתמשים בשני גדלים נקבובית רשת — 20 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השתמש בפרוטוקול
	<ol>
<li>טרום רטוב המסננת.<ol>
<li>Pipette של תמיסת מלח, כגון M9 [5 g של NaCl, 6 גרם של נה2HPO4, דור 3 של ח'2PO4, 1 L של הנדסה גנטית H2O ו- 1 מ"ל של MgSO4 (1 מ')]17, דרך מרכז המסננת עד טפסים droplet , וידחוס ולאחר נוטפת את המרכז של מסנן התחתון (איור 2 א). באופן אופציונלי, החל נטולת מגבון (כגוןKimwipe) לתחתית לצורה או להפיץ droplet לחות על רשת השינוי.</li>
			<li>מניחים המסננת מעל צינור חרוטי 50 מ. לתייג את הצינור כמו 'צינור פסולת' (איור 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>רחץ אוכלוסיה של C. elegans את צלחת אגר.<ol>
<li>לשטוף את הצלחת עם המאגר M9 ומניחים המדיום המכיל תולעת על למעלה של monofilament רשת השינוי 1 מ"ל במועד (איור 2C). הקפד לפעול במרכז של רשת השינוי. לשטוף את כל התולעים מהצלחת. הערה: בדרך כלל, 3 מ"ל של M9 לצלחת 60 מ מ מספיקה.</li>
			<li>כדי למזער את מספר תולעים שקוע pipetting, להשתמש כוס פסטר פיפטה כדי להזיז את התולעים רלוונטי ו על המרכז רשת (החזרה לפי הצורך).</li>
			<li>יש לשטוף את המסנן עם המאגר M9 מלמעלה. שוב, ודא פועלים במרכז של רשת השינוי ולשטוף את כל התולעים באזור זה. רחץ פעמים רבות ככל שנדרש על מנת להבטיח כי כל חיידקים, תולעים קטנות עבר דרך רשת השינוי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הקציר החיות מתאימים לגודל של המסננת.<ol>
<li>לצרף צינור חרוטי 50 מ ל העליון של המסננת, עם תולעים בוגרות מהשלב 1.2.2.3 מול הפנימי של הצינור אוסף חדש (איור דו-ממדי).</li>
			<li>הסר את הצינור הראשון (צינור פסולת) והיפוך במהירות מעל מסננת את צינור חדש כדי למנוע העברת ה-droplet (2E איור). הערה: אם עקרות אינה נחוצה, להשתמש נטולת מגבון (כגוןKimwipe) wick נוזל התחתון של רשת השינוי לפני היפוך.</li>
			<li>יש לשטוף את רשת השינוי עם M9 לתוך הצינור 50 מ ל חדש מן החדש על הסיפון (2F איור). שוב, פועלים במרכז רשת ולתחזק droplet על החלק התחתון של הרשת.</li>
			<li>לאפשר את התולעים להתפשר או לסובב אותם בעדינות למטה (למשל, < 16 x g) עבור 1 דקות (2G איור).</li>
			<li>וארוקן את בופר מ בגדר של תולעים, אידיאלי למטה > 0.5 מ"ל, או להסיר כל הנוזל ככל האפשר מבלי להפריע בגדר.</li>
			<li>Pipette התולעים באמצעות כוס פסטר פיפטה על גבי צלחת NGM ולתת להן להתייבש. מרחב טיפות מרובות בחוץ על צלחת חדשה אז הם להתייבש מהר יותר (איור 2 H).</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניקוי המסננת.<ol>
<li>לשטוף המסננת ביסודיות ובעדינות עם אתנול וביו -אוסמוזה הפוכה מים. . תן לזה להתייבש.</li>
			<li>אחסן אותו במיכל נקי לשימוש בעתיד לא מוגדר.</li>
			<li>תבטל את זה, כאשר רשת השינוי מתפתח מראה 'סאג'.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אימות של Caenorhabditis ניפוי שיטת המיון
<ol><li>תחזוקה כללית
	<ol>
<li>עבור כל הניסויים, תרבות תולעים תולעים נימיות צמיחה מדיה סטנדרטי17 (L 1 של NGM מורכב מ 2.5 גר' peptone, 17 גרם אגר, דור 3 של NaCl, 975 מ ל מים מזוקק פעמיים, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 25 מ של 1 מ' KHPO4ו- 0.5 מ של סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל) ב 25 º C.</li>
	</ol></li>
	<li>מינהל טיפול ניסיוני
	<ol>
<li>להשוות את הטיפול שלוש הקבוצות: פיק, fluorodeoxyuridine (FUDR) ו Caenorhabditis מסננת.<ol>
<li>עבור קבוצת טיפול FUDR, להוסיף 100 מ"ג/מ"ל FUDR המדיה NGM ריכוז סופי של 100 μM כדי למנוע כל הפקה רומא, וכן להעביר את התולעים בכל יום צלחת NGM טריים כדי למנוע דלדול מזון.</li>
			<li>עבור הקבוצה לבחור, לבחור ולהעביר את התולעים באופן ידני באמצעות לולאה פלטינה.</li>
			<li>עבור קבוצת הטיפול Caenorhabditis מסננת, בצע צעד 1.2, pipette את התולעים על גבי צלחת NGM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis מסננת אחוז התשואה
	<ol>
<li>כדי לכמת את המסננת עד כמה יעיל זה-מיון C. elegans, לגדל חיות N2 גיל-סינכרונית ליום 1 של הבגרות 25 ° c (קרי, 48 שעות לאחר הנחת הביצה) ולאחר מכן להעביר אותם על-ידי בחירת אותם ללוחות NGM טריים (בהיקף של N = 50 או N = 100 בעלי חיים לכל טרה קבוצת atment).</li>
		<li>אחרי 24 שעות של התאוששות, העברת האוכלוסייה ללוחות NGM חדש עם המסננת Caenorhabditis בעקבות האמור לעיל פרוטוקול (ראה שלב 1.2), לספור את מספר בעלי החיים הועברו בהצלחה.</li>
		<li>לחשב את התשואה באחוזים כיחס של מספר בעלי חיים מועברים בהשוואה שהמספר הראשון בתחילת ההעברה מוכפלים ב- 100 (%).</li>
	</ol></li>
	<li>מבחני Healthspan הערה: ציון הפרמטרים healthspan של הכיתה תנועתיות, קצב משאבת לועי, ו הקדמי והן התגובה המגע העדין האחורי בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות לבעלי גיל-מסונכרנות N2 ומתוחזק על 25 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>תנועתיות מעקב<ol>
<li>להקצות תנועתיות שהתבססו על מערכת מבוסס-מחלקה (כיתות A, B ו- C) בעקבות שיטות חרנדון. et al. 18. להשוות את ההשפעות של שלוש קבוצות ניסיוני באמצעות מודל סטטיסטיקה לוגיסטיים הסודר בתוכנת ניתוח סטטיסטי. הערה: מדרגה ראשונה לאנשים להעביר באופן ספונטני בתבנית רגילה, sinusoidal. Class B לנוע בתנועות במידה ניכרת הלא-sinusoidal ויחידים עשויים לדרוש לדרבן ולעודד את התנועה. Class C יחידים להזיז הראש שלהם ו/או זנב בתגובה לדרבן, אך אינם מסוגלים לנוע על פני אגר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>קצב משאבת לועי<ol>
<li>לספור מטחנת תנועת הנורה החיה לועי מסוף חזותית תחת stereomicroscope על 600 X הגדלה הסופי עבור 1 דקות.</li>
			<li>לערוך ניתוח סטטיסטי עם אנובה בכיוון אחד עם α = 0.05 ובדיקות Bonferroni פוסט עם α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לגעת התגובה<ol>
<li>להקליט לתגובה המגע העדין ולהשוות בין קבוצות הטיפול שלוש. לבצע את מבחני המבוסס על שיטות מתוארת על ידי Calixto. et al. 19.</li>
			<li>הרשומה הקדמי ואת ישבנה לגעת התגובה על ידי ללטף בעדינות מכוש עפעף בניצב הזנב או בראש (5 x, מתחלפים בראש וזנב) של בעלי החיים.</li>
			<li>ציון כל תנועה בכיוון ההפוך של הקו באורך של 1 נקודה בסולם של 0 עד 5 עבור הקדמי והן התגובה האחורי.</li>
			<li>עריכת ניתוח סטטיסטי עם אנובה בכיוון אחד עם α = 0.05 ובדיקות Bonferroni פוסט עם α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>פוריות assay
	<ol>
<li>כדי לקבוע את השימוש של המסננת Caenorhabditis ההשפעה על רבייה, לגדל חיות N2 גיל-סינכרונית ליום 2 של הבגרות ב 25 º C.</li>
		<li>h 60 לאחר ביצה שכב, להעביר חיות לוחיות הרישוי NGM עם מעדר פלטינה או מסננת Caenorhabditis ולתת להם 4 שעות להתאושש (לייבש את הצלחות sieved למשך 20-30 דקות).</li>
		<li>לאחר התאוששות, בנפרד צלחת החיות באמצעות עפעף לבחור NGM צלחות, לתת להם 24 שעות להטיל ביצים, ולהסיר את החיות. לאפשר הוא צאצא שהלוח לפתח בתנאים רגילים 25 ° c עבור עוד 24 שעות ביממה. הערה: מכוש עפעף היא עפעף האנושי מאובטחות לסוף פיפטה פסטר עם לק ולא מעוקר עם אתנול.</li>
		<li>לספור את מספר יחידים בדור F1 קיימא. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן T של α = 0.05. הערה: הצאצאים קיימא נחשבים ביצים בהצלחה לבקוע, מתחילים את הפיתוח שלהם דרך מחזורי הזחל קבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחני התגובה מתח כתב פלורסנט
	<ol>
<li>לבצע שלושה מבחני כתב פלורסנט נפוץ כדי לזהות סמנים פוטנציאלי של מתח: התקה הדף היומי-16::GFP לתוך הגרעינים של תאים ב- זן [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; ביטוי hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; ביטוי השתילות-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>עבור כל assay, תרבות בעלי חיים גיל-סינכרונית מקבוצות הטיפול שלוש ב- 20 ° C ולבחון אותם בכל יום 3 של בגרות: להשתמש בפקד שלילי (על בסיס יומי, העברת קבוצת בעלי חיים באופן ידני עם מעדר פלטינה), פקד חיובי (על בסיס יומי העברת קבוצת בעלי חיים באופן ידני עם מעדר פלטינה פלוס של הלחץ הוקמה), ואת המסננת Caenorhabditis (להעביר את החיות דרך המסננת, לאפשר להם לשחזר למשך 30 דקות על NGM לפני הדמיה).</li>
		<li>ב וזמינותו הדף היומי-16::GFP, חום לחשמל החיות בקרה חיובית של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הדמיה20. עבור hsp-16.2 וזמינותו, חום לזעזע את החיות בקרה חיובית במשך 90 דקות, 20 h לפני הדמיה21. עבור וזמינותו השתילות-3, מטפלים החיות בקרה חיובית עם 100 מ מ paraquat במשך 4 שעות לפני הדמיה22.</li>
		<li>לקצור את התולעים מיד עם דוקרן עפעף והר אותם coverslip עם μL 1 של 36% poloxamer 407 חומרים פעילי שטח פתרון על מנת לשתק את התולעים.</li>
		<li>כריך תולעים נטען עם coverslip אחרת. הר על coverslips שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה, התמונה התולעים באמצעות של 8 X הגדלה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה (עבור רמת ההגדלה הכוללת של 80 X) וחשיפה מתמדת עם מסנן FITC.</li>
		<li>כדי לזהות את כל ההבדלים בין הקבוצות שלוש וזמינותו הדף היומי-16::GFP, לסווג את החיות בהתבסס על המיקום של הכתב הדף היומי-16::GFP (גרעינית אם הכתב translocated את הגרעינים, cytosolic אם הכתב נמצא ציטוזול, ואם ביניים הכתבת ממוקם הגרעינים והן ציטוזול).</li>
		<li>להשוות את התוצאות תוך שימוש מודל סטטיסטי סידורי הלוגיסטיקה בתוכנת ניתוח סטטיסטי. Hsp-16.2 ומבחני את הביטוי השתילות-3, להשתמש חד-כיווני אנובה עם α = 0.05 ובדיקות של Tukey פוסט הוק עם α = 0.05 כדי להשוות את קרינה פלואורסצנטית הכולל של אזור הראש.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mechanosensation.">Assaying mechanosensation.</a> WormBook. , (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Mitochondrial+Superoxide+Dismutase+sod-2+Extends+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Argon, Y., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+fertilization-defective+mutants+with+abnormal+sperm.">Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm.</a> Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).</li><li>Lee, S. J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+longevity+response+to+temperature+by+thermosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Temperature+Differentially+Modulates+C.+elegans+Longevity+through+a+Thermosensitive+TRP+Channel.">Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel.</a> Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).</li><li>Michaelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+A+Practical+Approach.+Ian+A.+Hope+(ed.).+Oxford+University+Press,+Oxford.+1999.+Pp.+281.+ISBN+0+19+963738+5.">C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5.</a> Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans.">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li><li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li><li>Henderson, S. T., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+integrates+developmental+and+environmental+inputs+to+mediate+aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan.">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li><li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit.">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li><li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neuron+aging:+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).</li><li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis.">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).</li><li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li><li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress.">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li><li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף. המחברים מצהירים כי המחקר בוצע בהיעדר יחסים מסחריים או פיננסי שיכול להחשב בתור ניגוד אינטרסים פוטנציאליים.

במסמך זה, הצגנו את העיצוב ואת השימוש של המסננת Caenorhabditis נגיש, יעיל ככלי מיון ולשמירה על C. elegans. כלי זה יש מספר יתרונות לבחירת חיות בודדות, שטיפת אוכלוסיות, טיפולים כימיים (למשל, FUDR) ושיטות יקר יותר מחיות הפרדת באופן ידני. קודם כל, Caenorhabditis ניפוי ביעילות ובמהירות (פחות מ- 20 דקו?...

התולעת נמטודות Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל premier. בנוסף הטבע ישיר ומבוקר של הטיפוח-תרגול במעבדה, הגנום כולו שלהם הוא ברצף1 , גורל כל תא התפתחותית ידוע2. בשל תכונות אלה, C. elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ מחקרים גנטיים. עם זאת, יחד עם תכונות מועילות אלה באים כמה אתגרים לחוקרים. בשל מזמנם דור מהירה, C. elegans אוכלוסיות יכול לרוץ במהירות האוכל ו/או מעורב אוכלוסיות עם דורות מרובים, בשלבים התפתחותיים להציג בו-זמנית. לפיכך, ניסויים שבוצעו במדיה צמיחה נמטודות מוצק (NGM) דורשים חוקרים להעביר פיזית חיות ללוחות טרי, לפני מכלה מקור המזון חיידקי ולפתח הזחלים חדש. זה יכול להיות מייגע כמו העברת תכופים של החיות נחוצה כדי למנוע האוכלוסיות ניסיוני החל להיות מעורב עם הצאצאים דורות. ובכל זאת, ניסויים דורשים שני מספרים גדולים של בעלי חיים ושל נקודות זמן ממושך (למשל, מיצוי DNA או RNA בבגרות). זה תרכובות האתגרים של שמירה על אוכלוסיה מסונכרן באופן מדויק והעברת מספרים גדולים של בעלי חיים.
שיטות של העברת C. elegans תרבותי על NGM איסוף או לרחוץ את החיות צלחת על צלחת; כימי בטיפול החיות (למשל, עם fluorodeoxyuridine מעכב שכפול ה-DNA או FUDR); או באמצעות cytometry זרימה כדי למיין חיות לוחיות רב טוב. איסוף כרוכה בשימוש כלי יד, עשה עם חוט דק פלטינה או עפעף, להעביר באופן ידני אדם או בעלי חיים מרובים3,4. בשיטה זו הוא מדויק אבל דורש מיומנות והן זמן והוא מגבלה על מחקרים שכללו מספר גדול של בעלי חיים. איסוף מאי גם, להיות פיזית מזיק ומלחיץ החיות במינים יחידים פוטנציאל לכמויות לא טבעי ולא עקבית של הפרעה וכוח. כביסה כרוך שטיפה לצלחת תרבות עם פתרון מאגר העברת הפתרון עם בעלי החיים דרך זכוכית פסטר פיפטה צלחת תרבות חדשה. שיטה זו מהירה ויעילה אך אינה מדויקת כמו דורות מרובים, בשלבים התפתחותיים של בעלי חיים מועברים בצובר. טיפולים כימיים, כגון FUDR, יכול להיות מומס בתקשורת culturing כדי למנוע את הייצור של הצאצאים באמצעות חסימת כל שכפול ה-DNA, וכך, פיתוח ייצור וביצה תא רבייה. בעוד יעיל, בשיטה זו יש להחיל לאחר ההבשלה התפתחותית עד כדי לא לשבש את תהליכי התפתחותי נורמלי, וזה אומר שעדיין יש דרישה להעביר את החיות לפני שלה מינהל3. שיטה זו גם השפעות מרובות הסלולר מסלולי איתות, וכתוצאה מכך מורגשת ההשפעה על החיות כשהם מזדקנים (למשל, סיומת תוחלת החיים או פרוטוסטאזיס שינו) בהתאם המתח של C. elegans בשימוש5, 6,7,8,9,10. שיטות cytometry זרימה אוטומטית למיין, להעביר בודדים C. elegans לוח רב טוב אחד עוד11. בעוד ששיטה זו הוא מאוד אפקטיבי ויעיל, ציוד cytometry זרימה הוא יקר and נגישים לחוקרים רבים. אלטרנטיבה העברת בעלי חיים היא להשתמש מוטציה בדגמי טמפרטורה רגיש, כגון fer-15 ו- פמ-1, אשר הופכים סטרילי עם התאמת הטמפרטורה12. בזמן השימוש חיות מועיל במצבים מסוימים, זנים מסוימים אלו גדלים לאט יותר פראי-סוג חיות והן מסתמכות על הגנום השונה, המגישה כנציגים המסכן לתולעים הזדקנות או בריאה. בנוסף, ההסתמכות על שינוי טמפרטורה לזירוז עקרות שתוצאת גם בהיעדר סביבה סטטי, שינויי טמפרטורה הוכחו ברצון להשפיע על ג'ין ביטויים13,14, 15. קבוצות מחקר בעבר פורסמו טכניקות המתאר את השימוש רשת שינוי כדי לסנן C. elegans לפי גודל16. עם זאת, היינו מסוגלים למצוא עבודה קודמות בדיקה עבור כל שינוי תוצאות בריאותיות הכוללת שעשויים להיות מזוהה עם השימוש של מסננים כאלה.
לפיכך, יש צורך בתוך קהילת המחקר C. elegans שיטה במחיר נוח, יעיל, מהיר, ו מדויק עבור העברת מספרים גדולים של בעלי חיים בין תרבות צלחות. פיתחנו כלי של שיפור, נגיש של ציוד (בשם המסננת Caenorhabditis ), פרוטוקול המשויך עבור שלה ייצור ותפעול העונים על הצרכים של קהילת המחקר C. elegans . במסמך זה, אנחנו חולקים את העיצוב של מסננת Caenorhabditis והשיטות לשימושו, נדגים את השימוש בו לא משפיע על בריאות נפוצות או כל אחד מסמני מתח כאשר לעומת איסוף ידני רגיל וטיפול עם הנפוצות, פוריות-הגבלת FUDR כימי.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל ומבוססת נעשה שימוש במגוון של מחקר ביו-רפואי בסיסי. בתוך קהילת המחקר נמטודות, יש צורך דרך במחיר נוח ויעיל לשמור על אוכלוסיות גדולות, מתאימים לגיל של C. elegans. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מכנית מיון וניקוי C. elegans. המטרה שלנו היא לספק תהליך חסכוני, יעיל, מהיר ופשוט לקבל בעלי חיים הגדלים אחיד, שלבי החיים לשימוש שלהם בניסויים. כלי זה, מסננת Caenorhabditis , משתמש במערכת המכסה לפי הזמנה זה חוטים אל צינורות מעבדה חרוט נפוצות וממיין C. elegans בהתאם לגודל הגוף. אנחנו גם להוכיח כי המסננת Caenorhabditis ביעילות העברת חיות של תרבות אחת צלחת מתן אפשרות נוספת עבור מיון מהיר, סנכרון וניקוי מבלי להשפיע על סמנים של בריאות, כולל תנועתיות, מתח-inducible ג'ין כתבים. כלי נגיש, חדשני זה הוא אפשרות מהיר, יעיל, ומלחיץ לשמירה על אוכלוסיות C. elegans .

המסננת Caenorhabditis מורכב 2 מזרקי וואקום, אבטחת אזור של ניילון ארוגים monofilament רשת שינוי קטן יותר מקוטר גוף העידן ההתפתחותי הרצוי, השתמשו כדי לחלץ אוכלוסיות בשידור חי של אורגניזמים בטכניקה פשוטה כביסה. זה מייחסת צינורות תקן חרוטיים ומשתמש המסך רשת שינוי כדי למיין באופן מכנ...

Watch this Scientific Journal Video about Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms at JoVE.com

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

בפרוטוקול הנוכחי כולל מתודולוגיה מיון וניקוי של אוכלוסיות תואם גיל Caenorhabditis elegans. הוא משתמש פשוטה, זולה, והכלי בהזמנה אישית יעילה להשגת ניסיוני אוכלוסיה גדולה של נמטודות למחקר.

Caenorhabditis נפה:, מכשיר low-tech ו מתודולוגיה לצורך מיון אורגניזמים רב תאיים קטנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K Views.  University of Alaska Fairbanks. בפרוטוקול הנוכחי כולל מתודולוגיה מיון וניקוי של אוכלוסיות תואם גיל Caenorhabditis elegans. הוא משתמש פשוטה, זולה, והכלי בהזמנה אישית יעילה להשגת ניסיוני אוכלוסיה גדולה של נמטודות למחקר.

Video: Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemistry

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetics

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunology and Infection

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

גישה מדרגית מאוד לביצוע סקרים אקולוגיים של נמטודות קאנורהבדיטיס Selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

דיסוציאציה של תא בודד של Caenorhabditis elegans: שיטה לבודד תאים חיים

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...