Die Autoren möchten Danke Heather Currey für ihren ersten Beitrag, das Studiendesign und Dr. Swarup Mitra für seine kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten auch danke Dr. Michael B. Harris für Kommentare, Verbesserungen und Unterstützung bei der Erstellung der Demonstration dieser Methodik. Die Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von den NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Die Forschung in dieser Publikation berichtet wurde durch das National Institute Of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis zahlen UL1GM118991, TL4GM118992 oder RL5GM118990 und institutionelle Entwicklung Award (IDeA) unterstützt. das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant Nummer 5P20GM103395-15. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. UA ist AA/EO Arbeitgeber und Bildungseinrichtung und verbietet illegale Diskriminierung einer Person: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis Sieb Konstruktion und Verwendung
<ol><li>
Konstruktionsprotokoll
	<ol>
<li>2 Deckel aus 50 mL konische Röhrchen (Abbildung 1A) zu erwerben.</li>
		<li>Entfernen Sie den mittleren Bereich innerhalb der inneren Lippe der Lider (betrachtet von unten, Abb. 1 b) mit dem Bunsenbrenner und Roheisen Sonde oder einen Lötkolben oder trat Bohrer. Hinweis: Mit Wärme, um die Kunststoff-Deckel zu schneiden ist eine Klinge vorzuziehen, da gibt es weniger Verletzungsgefahr.</li>
		<li>Reinigen Sie und Schleifen Sie die Schnittkanten und oben Sie die Oberfläche mit einer gebogene Feile oder einem Rotary Schleifwerkzeug (z.B.Dremel). Siehe Abbildung 1.</li>
		<li>Schneiden Sie den Kreis der das Monofilament Netz auf den entsprechenden Durchmesser (Abbildung 1). Hierzu verfolgen Sie einen Deckel auf einem Monofilament Netz Nylonblatt und schneiden Sie nur innerhalb der Linie gezeichnet.</li>
		<li>Schneiden Sie Nuten/Schrägstriche in die obere Fläche der Deckel zur Verbesserung der Adhäsion von zwei Deckeln, wenn Klebstoff auf den Kunststoff (Abbildung 1E) angewendet wird.</li>
		<li>Die Deckel mit Ethanol zu reinigen und trocknen lassen.</li>
		<li>Cyanacrylat Kleber auf der Oberseite der beiden Deckeln, halten bis zum äußeren Rand. Hinweis: ein wenig Leim geht ein langer Weg.</li>
		<li>Legen Sie das Monofilament Netz gemäß Tabelle 1, auf einem geklebten Deckel (Abb. 1F). Setzen Sie den zweiten Deckel oben auf das Netz invertiert; Beide Deckel müssen ihre Spitzen zusammen. Drücken Sie fest zusammen (Abb. 1). Stellen Sie sicher, dass das Netz straff gespannt ist. Hinweis: als Sicherheitsmaßnahme, Verwendung Pinzette um das Netz auf den Deckeln zu platzieren.</li>
		<li>Sobald die erste Schicht der Leim getrocknet ist, wenden Sie einen Ring aus Cyanacrylat-Klebstoff um die äußeren Lücke zwischen den Deckeln. Seien Sie großzügig, da dies Integrität fügt und jede Peeling auseinander oder undicht verhindert.</li>
		<li>Beschriften Sie den Filter mit einer Pore Maschenweite des Netzes Monofile. Hinweis: Hier verwenden wir zwei Maschengrößen Pore – 20 µm und 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwenden Sie Protokoll
	<ol>
<li>Vornässen der Sieb.<ol>
<li>Pipette eine Kochsalzlösung, z. B. M9 [5 g NaCl, Na2HPO46 g, 3 g KH2PO4, 1 L von hochreinen H2O und 1 mL MgSO4 (1 M)]17, durch die Mitte des Siebes bis sich ein Tröpfchen bildet , kondensiert und tropft ab der Mitte des unteren Filter (Abbildung 2A). Optional, gelten ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) auf den Boden zu gestalten oder einen Tropfen Feuchtigkeit auf das Netz zu verbreiten.</li>
			<li>Legen Sie das Sieb über eine 50 mL konische Rohr. Beschriften Sie das Rohr als "Abfall-Tube" (Abb. 2 b).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Waschen Sie eine Bevölkerung von C. Elegans aus einer nährbodenplatte.<ol>
<li>Waschen der Platte mit der M9-Puffer und der Wurm-haltigen Medium auf der Oberseite der Monofilament Netz 1 mL zu einem Zeitpunkt (Abbildung 2). Achten Sie darauf, in der Mitte des Netzes zu betreiben. Waschen Sie alle Würmer von der Platte. Hinweis: In der Regel 3 mL M9 für eine 60 mm-Platte ist ausreichend.</li>
			<li>Um die Anzahl der Würmer in pipettieren verloren zu minimieren, verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette, um die Würmer aus der Platte und in das Netz-Zentrum (Wiederholung nach Bedarf) zu bewegen.</li>
			<li>Spülen Sie den Filter mit dem M9-Puffer von oben. Wieder, stellen Sie sicher, in der Mitte des Netzes zu betreiben und spülen alle Würmer in diesem Bereich. Waschen Sie sich so oft wie notwendig, um sicherzustellen, dass das Netz die Bakterien und kleinere Würmer durchlaufen haben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ernten Sie die Größe angepasst Tiere vom Sieb.<ol>
<li>Legen Sie eine neue 50 mL konische Rohr an die Spitze des Siebes mit der erwachsenen Würmer aus Schritt 1.2.2.3 mit Blick auf das Innere der neuen Kollektion-Röhre (Abb. 2D).</li>
			<li>Entfernen Sie das erste Rohr (Abwasser Rohr) und Blättern Sie schnell über das Sieb und die neue Röhre, die Tröpfchen von Migration zu halten (Abbildung 2E). Hinweis: Wenn Sterilität nicht erforderlich ist, verwenden Sie ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) Docht Fluid von Unterseite des Netzes vor spiegeln.</li>
			<li>Spülen Sie das Netz mit M9 in der neuen 50 mL Tube aus der neuen Oberseite (Abb. 2F). Wieder in das Netz-Zentrum Betrieb und Wartung ein Tröpfchen auf der Unterseite des Netzes.</li>
			<li>Ermöglichen die Würmer zu begleichen oder sanft nach unten zu drehen (z.B.< 16 X g) für ca. 1 min (Abbildung 2).</li>
			<li>Aspirieren die Pufferlösung aus dem Pellet von Würmern, im Idealfall bis zu > 0,5 mL, oder entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören das Pellet.</li>
			<li>Die Würmer mit einem Glas Pasteurpipette auf einem Teller NGM Pipette und trocknen lassen. Raum mehrere Tröpfchen heraus auf eine neue Platte, damit sie schneller (Abb. 2 H Trocknen).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinigen Sie Sieb.<ol>
<li>Das Sieb sanft und gründlich mit Ethanol und Umkehrosmose-Wasser abspülen. Lassen Sie ihn trocknen.</li>
			<li>In einen sauberen Behälter für unbestimmte zukünftige Verwendung speichern.</li>
			<li>Entsorgen Sie es, wenn das Netz ein "Sag" Erscheinungsbild entwickelt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Validierung der Caenorhabditis Sieb Sortiermethode
<ol><li>Allgemeine Wartung
	<ol>
<li>Für alle Experimente Kultur worms auf eine standard Nematoden Wachstumsmedien17 (1 L der NGM besteht aus 2,5 g Pepton, 17 g Agar, 3 g NaCl, 975 mL bidestilliertem Wasser, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin, 1 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4und 0,5 mL von 100 mg/mL Streptomycin) bei 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentelle Behandlung Verwaltung
	<ol>
<li>Vergleichen Sie die drei Behandlungsgruppen: Pick, Fluorodeoxyuridine (FUDR) und Caenorhabditis Sieb.<ol>
<li>Für die Behandlungsgruppe FUDR die NGM-Medien, um eine Endkonzentration von 100 μM, Nachkommen-Produktion zu verhindern 100 mg/mL FUDR hinzu, und übertragen Sie die Würmer täglich auf einen frischen NGM Teller Essen Erschöpfung zu vermeiden.</li>
			<li>Markieren Sie für die Pick Gruppe und übernehmen Sie die Würmer manuell mit einer Platin-Schleife.</li>
			<li>Folgen Sie für die Behandlungsgruppe Caenorhabditis Sieb Schritt 1.2 und pipette die Würmer auf eine NGM-Teller.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Sieb prozentuale Ausbeute
	<ol>
<li>Um zu quantifizieren, wie effektiv das Sieb ist zur Sortierung von C. Elegans, Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 1 des Erwachsenenalters bei 25 ° C (d. h.48 h nach der Eiablage) wachsen und übertragen sie dann durch Abnehmen ihnen frische NGM-Platten (in Höhe von insgesamt N = 50 oder N = 100 Tiere pro Tre Atment Gruppe).</li>
		<li>Nach 24 Stunden der Erholung, transfer die Bevölkerung zum neuen NGM Platten mit Caenorhabditis Sieb nach oben-Protokoll (siehe Schritt 1.2) und die Anzahl der erfolgreich übertragenen Tiere.</li>
		<li>Berechnen Sie die prozentuale Ausbeute als das Verhältnis der Anzahl der Tiere im Vergleich zu der Startnummer zu Beginn der Übertragung multipliziert mit 100 (%) übertragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan assays Hinweis: Gäste Healthspan Parameter der Motilität Klasse, der pharyngealen Pumprate und sowohl die vorderen und hinteren sanften Touch-Reaktion an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters für Alter synchronisiert N2 Tiere gepflegt bei 25 ° C.<ol>
<li>Motilität tracking<ol>
<li>Motilität Partituren basiert auf einem Klasse-basierte System (Klassen A, B und C) weisen nach den Methoden von Herndon Et Al. 18. vergleichen Sie die Auswirkungen der drei experimentellen Gruppen anhand eines ordinale logistische Statistiken im statistischen Analyse-Software. Hinweis: Klasse A Personen bewegen sich spontan in einem normalen, sinusförmige Muster. Klasse B Personen bewegen sich in deutlich nicht-sinusförmige Bewegungen und möglicherweise drängen um Bewegung zu fördern. Klasse C Individuen bewegen Sie ihren Kopf und/oder Schweif als Reaktion auf Drängen aber nicht über den Agar bewegen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pharyngealen Pumprate<ol>
<li>Zählen Sie die Mühle Bewegung des Tieres terminal pharyngealen Glühbirne visuell unter einem Stereomikroskop bei einem 600 X letzte Vergrößerung für 1 min.</li>
			<li>Eine statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Touch-Reaktion<ol>
<li>Erfassen Sie eine sanfte Berührung Reaktion und vergleichen Sie zwischen den drei Behandlungsgruppen. Führen Sie die Tests basierend auf den Methoden von Calixto Et Al. beschrieben 19.</li>
			<li>Aufzeichnung der vorderen und hinteren touch-Reaktion durch sanft streichelte eine Wimper Pick senkrecht über der Rute oder der Kopf (5 X, abwechselnd Kopf und Schweif) der Tiere.</li>
			<li>Erhalten Sie jede Bewegung in die entgegengesetzte Richtung des Pinselstrichs als 1 Punkt auf einer Skala von 0 bis 5 für die vordere und die hintere Antwort.</li>
			<li>Statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Fruchtbarkeit-assay
	<ol>
<li>Um die Verwendung von Caenorhabditis Sieb Auswirkungen auf die Fortpflanzung zu ermitteln, wachsen Sie Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 2 des Erwachsenenalters bei 25 ° C.</li>
		<li>60 h nach Ei zu legen, Tiere auf neue NGM-Platten mit Platin holen oder Caenorhabditis Sieb übertragen und Ihnen 4 h zu erholen (trocken gesiebten Platten für 20-30 min).</li>
		<li>Geben Sie nach seiner Genesung individuell Teller holen die Tiere über eine Wimper NGM Platten ihnen 24 h um Eier zu legen, und entfernen Sie die Tiere. Lassen Sie die Nachkommen auf jeder Platte, unter normalen Bedingungen bei 25 ° C für ein weiteres 24 h zu entwickeln. Hinweis: Eine Wimper-Pick ist eine menschliche Wimpern sicherte sich am Ende einer Pasteurpipette mit Nagellack und sterilisiert mit Ethanol.</li>
		<li>Die Anzahl der lebensfähigen F1 Generation Individuen. Eine statistische Analyse mit einem T-Test mit α = 0,05. Hinweis: Lebensfähige Nachkommen gelten als Eier, die erfolgreich auszubrüten und beginnen ihre Entwicklung durch die regelmäßigen Larven Zyklen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszierende Reporter Stress-Reaktion-assays
	<ol>
<li>Führen Sie drei häufigsten verwendeten fluoreszierenden Reporter Assays um potentielle Marker von Stress zu erkennen: ein DAF-16::GFP Translokation in den Kernen der Zellen in einem Stamm [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; Rol-6)]20; Hsp-16,2 Ausdruck [TJ375-gpIs1 (Hsp-16.2p::GFP)]21; und ein Sod-3 Ausdruck [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Kultur für jeden Test, Alter-synchrone Tiere aus den drei Behandlungsgruppen bei 20 ° C und am Tag 3 des Erwachsenseins zu untersuchen: Verwenden Sie eine Negativkontrolle (auf einer täglichen Basis übertragen eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick), eine Positivkontrolle (auf einer täglichen Basis eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick plus eine etablierte Stressor übertragen), und das Sieb Caenorhabditis (die Tiere durch das Sieb passieren und es ihnen ermöglichen, für 30 min auf NGM kurz vor Bildgebung zu erholen).</li>
		<li>In der DAF-16::GFP-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere bei 37 ° C für 30 min vor der imaging-20. Für die Hsp-16,2-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere für 90 min, 20 h vor dem imaging-21. Für die Sod-3 Test behandeln Sie die Positivkontrolle Tiere mit 100 mM Paraquat für 4 h vor imaging22.</li>
		<li>Ernte die Würmer sofort mit einer Wimper Pick aus und Klebe sie auf einem deckgläschen mit 1 μl einer 36 % Poloxamer 407 Tensid-Lösung, die Würmer zu immobilisieren.</li>
		<li>Die montierten Würmer mit einem anderen Deckglas Sandwich. Montieren Sie zwei Deckgläsern zu einem Standardglas Mikroskopie Folie und Bild der Würmer mit einer 8 X Vergrößerung auf einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop (für eine allgemeine Vergrößerung von 80 X) und eine ständige Exposition mit einem FITC-Filter.</li>
		<li>Um Unterschiede zwischen den drei Gruppen in der DAF-16::GFP-Assay zu erkennen, zu kategorisieren die Tiere anhand der Position der DAF-16::GFP-Reporter (Kern-, wenn die Reporter, Kerne, cytosolischen umgesiedelt, befindet sich die Reporter in Cytosol und Mittelstufe, wenn der Reporter befindet sich in Kernen und Zytosol).</li>
		<li>Vergleichen Sie die Ergebnisse unter Verwendung eines ordinalen Logistik statistischen Modells in statistische Analyse-Software. Für die Hsp-16.2 und die Sod-3 Ausdruck Assays, verwenden Sie eine einfache ANOVA mit α = 0,05 und Tukey post Hoc Tests mit α = 0,05 um die totale Fluoreszenz des Kopfes zu vergleichen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mechanosensation.">Assaying mechanosensation.</a> WormBook. , (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Mitochondrial+Superoxide+Dismutase+sod-2+Extends+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Argon, Y., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+fertilization-defective+mutants+with+abnormal+sperm.">Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm.</a> Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).</li><li>Lee, S. J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+longevity+response+to+temperature+by+thermosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Temperature+Differentially+Modulates+C.+elegans+Longevity+through+a+Thermosensitive+TRP+Channel.">Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel.</a> Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).</li><li>Michaelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+A+Practical+Approach.+Ian+A.+Hope+(ed.).+Oxford+University+Press,+Oxford.+1999.+Pp.+281.+ISBN+0+19+963738+5.">C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5.</a> Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans.">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li><li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li><li>Henderson, S. T., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+integrates+developmental+and+environmental+inputs+to+mediate+aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan.">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li><li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit.">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li><li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neuron+aging:+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).</li><li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis.">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).</li><li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li><li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress.">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li><li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Hier haben wir die Gestaltung und Nutzung der zugänglichen, effektive Caenorhabditis Sieb als Werkzeug für die Sortierung und Pflege C. Elegans. Dieses Tool hat mehrere Vorteile, manuell auswählen einzelner Tiere, Wasch-Populationen, chemische Behandlungen (z.B.FUDR) und teurer Methoden der Trennung Tiere. Erstens die Caenorhabditis Sieb schnell und effizient (weniger als 20 min) sortiert Nachkommen aus großen gemischten Populationen von Tieren (Tabelle 2). Auch di...

Die Nematoden Wurm Caenorhabditis Elegans, ist eine führende Modellorganismus. Neben der einfachen und kontrollierten Natur ihrer Züchtung im Labor ihre gesamte Genom sequenziert1 und Entwicklungsstörungen Schicksal jeder Zelle ist bekannt2. Aufgrund dieser Eigenschaften ist C. Elegans weit verbreiteten Modellorganismus für genetische Studien. Zusammen mit diesen vorteilhaften Eigenschaften kommen jedoch einige Herausforderungen für Forscher. Aufgrund ihrer schnellen Generationszeit C. Elegans Populationen können schnell laufen aus der Nahrung und/oder Populationen mit mehreren Generationen vermischt werden und Entwicklungsstadien auf einmal präsentieren. Folglich erfordern Experimente auf solide Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Forscher körperlich bewegen Tiere zu frischen Teller, bevor die bakterielle Nahrungsquelle erschöpft und neue Larven entwickeln. Dies kann mühsam sein, da eine häufige Übertragung der Tiere erforderlich ist, um zu verhindern, dass die experimentellen Populationen von mit Nachkommen Generationen vermischt. Jedoch erfordern einige Experimente sowohl große Anzahl von Tieren und längere Zeitpunkte (z.B. DNA oder RNA-Extraktion im Erwachsenenalter). Dies verstärkt die Entwicklung genau zu erhalten eine synchronisierte Bevölkerung und große Zahl von Tieren übertragen.
Aktuelle Methoden der Übertragung von C. Elegans kultiviert auf NGM Kommissionierung oder Waschen der Tiere von Platte zu Platte; chemische Behandlung der Tiere (z. B.mit der DNA-Replikation-Inhibitor Fluorodeoxyuridine oder FUDR); oder mittels Durchflusszytometrie, um die Tiere im Multi-well-Platten zu sortieren. Kommissionierung beinhaltet die Verwendung von ein Handwerkzeug, gemacht mit einer dünnen Platindraht oder eine Wimper manuell einzelne oder mehrere Tiere3,4übertragen. Diese Methode ist korrekt, aber erfordert Geschick und Zeit und ist eine Einschränkung für Studien, die große Zahl von Tieren. Mai auch sein körperlich schädlichen und stressig für die Tiere durch potenziell Personen unnatürlich und inkonsistente Mengen von Störung und Kraft zu unterwerfen. Waschen umfasst Spülen einer Kulturschale mit einer Pufferlösung und die Lösung mit den Tieren über Glas Pasteurpipette auf eine neue Kultur-Platte zu übertragen. Diese Methode ist schnell und effizient aber ist nicht genau, wie mehrere Generationen und Entwicklungsstadien der Tiere in der Masse übertragen werden. Chemische Behandlungen, wie z. B. FUDR, können in die Kultivierung Medien, um zu verhindern, dass die Produktion von Nachkommen durch Sperrung DNA-Replikation, und somit die Gameten Produktion und Ei-Entwicklung aufgelöst werden. Während wirksam, nach Entwicklungsstörungen Reifung, nicht die normalen Entwicklungsprozesse stören diese Methode angewendet werden, und dies bedeutet, dass es noch eine Voraussetzung um die Tiere vor seine Verwaltung3zu übertragen. Diese Methode beeinflusst auch mehrere zelluläre Signalwege, die spürbare Auswirkungen auf die Tiere wenn sie älter werden (z.B., eine Lebensdauerverlängerung oder eine veränderte proteostase) abhängig von der Sorte von C. Elegans verwendet5, 6,7,8,9,10. Flow Cytometry Methoden automatisch sortieren und individuelle C. Elegans aus einem Multi-well-Platte auf eine andere11übertragen. Während diese Methode sehr effektiv und effizient ist, ist Flow Cytometry Ausrüstung unerschwinglich teuer und für viele Forscher nicht zugänglich. Eine Alternative zur Übertragung von Tieren soll mutierten Modelle verwenden, die sind temperaturempfindlich, z. B. Fer-15 und Fem-1, die steril mit Temperatur Einstellung12geworden. Verwendung von mutierten Tieren in einigen Situationen nützlich ist, diese spezifische Stämme wachsen langsamer als Wildtyp Tiere und sie verlassen sich auf eine veränderte Genom, als schlechte Vertreter für alternde oder gesunde Würmer. Darüber hinaus das Vertrauen auf eine temperaturverschiebung induzieren Sterilität führt auch das Fehlen von einer statischen Umgebung, und Temperaturschwankungen leicht nachweislich Einfluss auf Gen Ausdrücke13,14, 15. Forschungsgruppen haben zuvor veröffentlichten Techniken beschreiben die Verwendung eines Netzes zum Filtern von C. Elegans nach Größe16. Jedoch konnten wir finden Vorarbeiten Tests für alle Änderungen an den allgemeinen Gesundheit Resultaten, die den Einsatz von solchen Filtern zugeordnet werden können.
So gibt es eine Notwendigkeit in C. Elegans Forschungskreisen eine kostengünstige, effiziente, schnelle und präzise Methode zur Übertragung von großen Anzahl von Tieren zwischen Kultur Platten. Wir haben eine verbesserte, zugängliche Stück Ausrüstung (benannt Caenorhabditis Sieb) und eine zugehörige Protokoll für seine Herstellung und Betrieb, die den Bedürfnissen der Forschungsgemeinschaft C. Elegans entwickelt. Hierin, teilen wir das Design der Caenorhabditis Sieb und Methoden für den Einsatz, und wir zeigen, dass ihre Verwendung nicht die allgemeine Gesundheit oder alle Stress-Marker im Vergleich zu standard manuellen Kommissionierung und eine Behandlung mit den gängigen auswirkt, Einschränkung der Fruchtbarkeit chemische FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine etablierte Modellorganismus verwendet in einer Reihe von grundlegenden und biomedizinischen Forschung. Innerhalb der Nematoden Forschungsgemeinschaft ist eine Notwendigkeit für eine kostengünstige und effektive Möglichkeit, großer, Alter abgestimmt Populationen von C. Eleganszu. Hier präsentieren wir eine Methodik für die mechanisch sortieren und Reinigen von C. Elegans. Unser Ziel ist es, eine kostengünstige, effiziente, schnelle und einfache Verfahren um Tiere einheitliche Größen und Stufen für den Einsatz in Experimenten zu erhalten. Dieses Tool, das Sieb Caenorhabditis verwendet eine Custom-Built Deckel-System, die Gewinde auf gemeinsame konische Labor Röhren und C. Elegans anhand der Körpergröße sortiert. Wir zeigen auch, dass das Sieb Caenorhabditis Tiere effektiv aus einer Kultur Platte überträgt, zu einem anderen ermöglicht eine schnelle Sortierung, synchronisieren und Reinigung ohne Beeinträchtigung der Marker für Gesundheit, einschließlich der Motilität und Stress-induzierbaren gen-Reporter. Dieses allgemein zugänglicher und innovativer Tool ist eine schnelle, effiziente und nicht stressig-Option für die Aufrechterhaltung der Populationen von C. Elegans .

Die Caenorhabditis Sieb besteht aus 2 Schraubverschlüsse, Sicherung einer Fläche von gewebtem Nylon Monofilament Netz kleiner als der Körperdurchmesser von der gewünschten Entwicklungsalter, zum Extrahieren von live Populationen von Organismen mit einer einfachen waschen-Technik verwendet. Es legt auf standard konischen Rohren und nutzt das Sieb mechanisch Tiere Sortieren nach Körperdurchmesser, verlassen die gewünschten Tiere in der Röhre fertig für die weitere Wartung u...

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.

Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K Aufrufe.  University of Alaska Fairbanks. Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.

Serie: Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Forschung

Genetik

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunologie und Infektion

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Neurowissenschaften

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biologie

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

Sortierung der<em&gt; Streptomyces</em&gt; Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Ein hochgradig skalierbarer Ansatz zur Durchführung ökologischer Untersuchungen von selbstsüchtigen Caenorhabditis-Nematoden

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Handdissektion von Caenorhabditis elegans Darm

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode zur Isolierung lebender Zellen

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Automatische Trennung von

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode

Grundlegende

Sortierung der

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

Ein hochgradig skalierbarer Ansatz zur Durchführung ökologischer Untersuchungen von selbstsüchtigen Caenorhabditis-Nematoden

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Handdissektion von Caenorhabditis elegans Darm

Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode zur Isolierung lebender Zellen