Name: a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

אנו מודים Dipa Bhaumik, אהרון מילר, בוב יוז לקבלת סיוע טכני. זנים נמסרו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנחנו אסירי תודה גאורגיה וודס ולבני לית'גו, Kapahi, Melov מעבדות לדיונים שימושי מ. ל נתמכה על ידי נבחרת מכונים לבריאות (NIH) הכשרה גרנט T32 AG000266 ואחווה אליסון רפואי קרן/אמריקאי הפדרציה של הזדקנות מחקר לפוסט. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של מעבדות BioAge, מענק קרן Hillblom לארי ל', כמו גם מכון הבריאות הלאומי מעניק UL1024917, תומך האיחוד מחקר בינתחומי על Geroscience, ו 1R01AG029631-01A1 אל G.J.L.

1. הכנת מאגרי
<ol><li>
מרק ליברות
	<ol>
<li>להשתמש בגרגרים טרום מעורב (ראה טבלת חומרים) ופעל הפרוטוקול של היצרן עבור הכנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צמיחה נמטודות מדיה (NGM) אגר
	<ol>
<li>לערבב 23 גרם של אגר, דור 3 של NaCl, 2.5 גר' peptone מה נשארתי, ולהוסיף מים יונים אוטוקלב ל' 0.972 וקריר לתת עד 60 ° צלזיוס, 25 מ של 1 מ' אשלגן פוספט (KPO4) מאגר (pH 6.0), 1 מ"ל של 1 מ' מגנזיום גופרתי (MgSO4) , 1 מ"ל של 1 מ' סידן כלורי (2CaCl) ולאחר 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול (באתנול).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פתרון תת-כלורי
	<ol>
<li>מערבבים 5 מיליליטר 5 מ' KOH, 4 מ של נתרן תת-כלורי פתרון (6%), ויונים H2O כדי הנפח הכולל של 50 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S הבזליים
	<ol>
<li>מערבבים 5 g של NaCl, 1 g K2HPO4, 6 גר'2פו ח'4ומים מיוננים 1 ליטר, ואז אוטוקלב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת מרוכז e. coli (OP50)
הערה: שלב זה מתרכזת 1 ליטר של פתרון רווי e. coli לתוך 25 מ של מאגר הבסיס S.
<ol><li>לחסן מ ל LB בלוק מרק (שלב 1.1) עם מושבה בודדת של e. coli (זן OP50) ולאחר תקופת דגירה של 4-6 h ב 37 ° C עם טלטול (250 סל"ד). השתמש 0.1 מ"ל של פתרון זה לחסן 1 ליטר של LB בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל'. דגירה 1 ליטר המבחנות בן לילה (12-16 ג) ב 37 ° C עם טלטול (250 סל"ד).</li>
	<li>צנטריפוגה תרבויות לילה 1 ליטר בבקבוקי 500 מ ל צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 10,000 x g ו- 4 ° C הצניפה החיידקים, decant משם המדיה הנותרים. Resuspend צנפה ב 25 מ ל S הבזליים (שלב 1.4). חנות ב 4 º C.</li>
</ol>3. הכנת NGM תרבות צלחות
<ol><li>עבור לוחות תרבות המונים להשתמש בהם כדי לייצר מספר גדול של תולעים, לוותר על 30 מ של אגר NGM מותכת (60 ° C) (שלב 1.2) ב קבינט על גבי לוחות תרבות 10 ס מ עם מנגנון אוטומטי שחולק נוזלים או פיפטה סרולוגית זרימה שכבתית. מאפשרים לילה יבש.</li>
	<li>Pipet 2 מ של OP50 מרוכז על כל צלחת 10 ס מ, להתפשט לגמרי לכסות את המשטח אגר על ידי הטיה וסיבוב לצלחת, ואז אפשר צלחות להתייבש. חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות.</li>
	<li>עבור תפוקה גבוהה assay תרבות לוחות בשימוש להקרנה, לנצל את מתקן 8 ערוץ אוטומטית כדי לוותר על 0.15 מ של אגר NGM מותכת לתוך כל טוב של צלחת טוב 96 בארון זרימה שכבתית. טיפול שימוש כדי להפוך בארות בטוח הם ללא בועות, כמו אלה יאפשרו ומחילות של תולעים תסכן את וזמינותו בבאר. מאפשרים לילה יבש. חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות.</li>
</ol>4. הכנת טמפרטורה רגיש (ts) סטרילי C. Elegans תרבויות המונית
<ol><li>להתחיל תרבויות, 'תולעת איסוף' (פיפטה מזכוכית עם כבל הפלטינה מצורפת או תולעת מיוצרים לבחור) תחת מיקרוסקופ ויבתר, באמצעות העברת ביצים 20 (זן TJ1060: spe-9 (hc88) אני; rrf-3(b26)II) אל תרבות המונים plate(s) מוכן בשלב 3.1. לאחר מכן, דגירה הצלחות ב- 20 ° C ל-6 ימים (מאפשר יותר מאשר דור אחד של צמיחה, כמו אתה ממקד לאוסף צאצאים של ביצי 20 עברה).</li>
	<li>מבחינה ויזואלית לאשר נוכחות של מבוגרים gravid (ביצים נוכח הרחם) עם מיקרוסקופ ויבתר. לאסוף המבוגרים gravid על ידי מחלק 2-3 מ"ל של S הבזליים לצלחת באמצעות פיפטה של זכוכית. מערבולת הנוזל סביב הצלחת ביד, ואז לאסוף את הנוזל לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה של זכוכית.</li>
	<li>ספין דרך צינור (1,000 g x 1.5 דקות ב- 20 ° C) הצניפה תולעים, ואז וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ ל פתרון תת-כלורי (שלב 1.3) בגדר תולעת, במהירות לנער את הצינורית ביד בכיוון מלמעלה למטה Incubate ס' 5 למשך 5 דקות, רועדת כל 2.5 דקות.</li>
	<li>שוב, ספין דרך צינור (1,000 x גרם 1.5 דקות); בגדר צריך להיות חום-צהבהב. תשאף את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ ל תת-כלורי פתרון בגדר ביצה ומנערים נמרצות את הצינור. דגירה 1-3 דקות, עם רועדת פה ושם, תוך מעקב אחר המראה עם המיקרוסקופ ויבתר. מבחינה ויזואלית לאשר רק ביצים הם שנותרו, והמשך לשלב הבא.</li>
	<li>ספין דרך צינור (1,000 g x 1.5 דקות), וארוקן את תגובת שיקוע. בגדר להיות לבן עם אין צבע חום. הערה: לאחר הסרת פתרון תת-כלורי, זה קריטי להשתמש טכניקות סטרילי, מאגרים, מאז זיהום (חיידקים ופטריות, בפרט) יכול להרוס את הניסוי, לבזבז זמן יקר, ריאגנטים. מחקר זה משמש ארונית זרימה שכבתית מסוננים ועבר נוזלים באמצעות רק פיפטות סטרילי וטיפים.</li>
	<li>פתח הצינורות בתוך חלל סטרילי. לשטוף את צניפה 3 פעמים עם S הבזליים, מסתובב למטה (x 1000 גרם 1.5 דקות) וכ רפה בעברית משם את תגובת שיקוע בכל פעם. מחדש להשעות בגדר ביצה ב- 2-3 מ ל S הבזליים. . הביצים האלה עכשיו ניתן על פתח לילה במאגר כדי לאסוף L1 פגית (שלב 5).</li>
</ol>5. מאינקובטור C. Elegans במאגר כדי לקבל סינכרונית תרבויות (בהכנת L1 זחל C. Elegans )
<ol><li>Decant את הביצה צניפה ואת מאגר לתוך צלחת פטרי זכוכית סטריליים עם כיסוי. שוטפים את הביצים הנותרות מהצינור לתוך תבשיל באמצעות פיפטה סרולוגית עם 2-3 מ"ל של S הבזליים. הוסף 5 מ של S הבסיס כדי להקל על הצפיפות, כשם זה עשוי לעודד הבקיעה, כמו אור רועד (20 סל ד עם מטרף מסלולית רקדנית בטן). דגירה בין לילה ב- 20 ° C, כדי שיהיה זמן הביצים לבקוע (16-24 שעות). כל הוולדות אעצור בשלב 1סנט זחל (L1) העדר מזון. הערה: אנקדוטלי מציינת כי ההכנות L1 טריים (16-36 שעות לאחר אוסף ביצי) לייצר באוכלוסיות ביותר סינכרונית של תולעים בוגרות.</li>
	<li>איסוף L1s בשפופרת 15 מ"ל עם פיפטה סרולוגית. ספין למטה L1s ומפרידה (1,000 g x 1.5 דקות), תשאף משם את תגובת שיקוע, וחזור עד L1s כל שנאסף מן הבקיעה צלחות, תוך השארת 10 מ"ל של S הבסיס עבור השלב הבא.</li>
	<li>ברכבת התחתית המכיל L1s micropipette החוצה 0.01 mL (מיד לאחר ערבוב), לוותר על זה אל unseeded (אין e. coli) NGM צלחת. לספור את מספר L1s על הצלחת. חזור על פי 10 ולקבל ממוצע עבור מספר L1s של כל aliquot. מצפים בדרך כלל, בין 1-3 L1s לכל µL (כאשר החל עם לוחית תרבות המונים 1 המכיל ביצים 20).</li>
	<li>לקבוע עם פיפטה סרולוגית הנפח של S הבזליים מחזיק את L1s. ואז לנחש עם המספר הממוצע נחושה של תולעים לכל 0.01 מ ל, להשיג בשלב הקודם, כדי להעריך את המספר הכולל של L1s. באופן כללי, מצפה בין 10,000-30,000 L1s (לכל צלחת תרבות המונים המכילים ביצים 20).</li>
	<li>כדי להשתמש תרבות זו assay 96-ובכן, לדלל את המתלים L1 ל-1 L1 לכל µL בבקבוק מדיה עגול סטרילי, ולאחר מכן המשך לשלב 7. אם תרבות זו היא לשמש ליצירת נוספים C. elegans המונית, תרבויות ולאחר מכן המשך לשלב 6.</li>
</ol>6. הכנה תרבות סינכרונית בקנה מידה גדול
הערה: L1 פתרונות יכול לשמש כדי להגדיל במהירות את התולעת אוכלוסיות.
<ol><li>ליצירת מספרים גדולים תולעת עם פתרון L1, לוותר על L1s עד 5,000 על כל אחד מספר צלחות תרבות המונים הרצוי. לאסוף מבוגרים gravid 2.5 ימים מאוחר יותר (20 ° C) כמתואר בצעדים 4.1-2, והמשך לשלב 4.3 כדי לאסוף את הביצים.</li>
	<li>כמו זה anecdotally נצפתה זה חוזר על עצמו אוסף תת-כלורי יכול להדגיש את האוכלוסייה המשועבדת, לפצל את האוכלוסיות על ידי איסוף ביצים עבור הפצת לפני העמדת האוכלוסייה שנותרה לטיפולים תת-כלורי, אז זה מספר דורות של האוכלוסייה לא נחשפים שוב ושוב לטיפול פתרון תת-כלורי.</li>
</ol>7. התקנה של צלחות Assay 96-ובכן
<ol><li>לאפשר את הצלחות assay (להכין בשלב 3.3) לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בזרימה שכבתית cabinet, להוסיף 5 µL של OP50 מרוכז (להכין בשלב 2.2) כל טוב. כמו קודם, השתמש מתקן אוטומטית של ערוץ 8.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של השעיה L1 מכל קידוח באמצעות מתקן אוטומטית של ערוץ 8. זה תניב על ממוצע 10 תולעים לכל טוב, מכיוון שהן ההשעיה נוכח 1 L1 לכל µL. לקדם חלוקה שוויונית של L1s מ slurry, לוותר על L1s מבקבוק מדיה עגול באופן פעיל מעורב בינוני באיטיות והופך מערבבים בר.</li>
	<li>מכסים עם מכסה, תיבת אצוות של צלחות, צלחת, דגירה 25 ° c במשך יומיים.</li>
</ol>8. טיפול 1 סנט יום למבוגרים C. elegans עם כימיקלים
<ol><li>להסיר את הלוחות ספריית כימי מהמקפיא, ולאפשר צלחות לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. הערה: צלחות ספריית כימי כפי שמתואר כאן לוחיות 96 טוב המכיל תרכובות דיסקרטית בכל טוב, כל אשר נמצאים ריכוז זהה של מומס דימתיל סולפוקסיד. ספריות אלה לא לנצל את העמודות החיצוני, אז כל צלחת יש מקסימום של 80 כימיקלים שונים. ב פרוטוקול המתוארים כאן, הריכוז הספרייה הוא 10 מ מ. חשוב לקחת בחשבון את ההשפעות ממס על פנוטיפים. ואילו מחקר זה מקרינים על ריכוז דימתיל סולפוקסיד של 0.5%, רמה זו אירעה חריגה לא מבחני תוחלת החיים האלה, מבחני תפוקה נמוכה, איפה זה נוטים יותר לקחת ריכוז פתרון מניות מתחם. פרוטוקול זה אינו עולה על 0.25%, אשר הוא רמה שבה תוחלת החיים שינויים לא יתרחשו16, לפחות המתח N2.</li>
	<li>בעדינות לנער צלחת ב rpm 60 על מטרף microplate עבור 1 דקות מיד לפני השימוש.</li>
	<li>משתמש אוטומטית נוזלי 96-ובכן הנדלר, העברת 0.75 µL של המתחם (דימתיל סולפוקסיד) מהצלחת ספריית לצלחת וזמינותו. עומק פיפטה במהלך הלידה נוזל לצלחת assay נשלטת בקפידה, כך קצות פיפטה המטפל נוזלי מעבירים את העוצמה 0.75 µL µL ~ 15 של נוזל על פני השטח של אגר (עם תולעים, OP50 מרוכז מצעדי 7.1 -2) לא לנקב פני השטח אגר בבאר. אל תשתמש ידני 8 או 12 פיפטות מרובה ערוצים חוץ במסכים קטנים מאוד (< 10 צלחות), כפי שהם יכולים להגדיל את שגיאה ולגרום לעיתים קרובות כתוצאה ניקב של פני השטח אגר, אשר פוגעת וזמינותו.</li>
	<li>הכינו צלחות של שליטה שלילי ספריית כימי עם דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), בהנחה הספרייה הנבדקת משתמשת דימתיל סולפוקסיד הממס. להפוך לוח בקרה שלילית 1 עבור כל 5 לבדוק הצלחות, עד 10 לוחות בקרה שלילית. במידת האפשר, גם לעשות צלחת בקרה חיובית (NP11 -20 מ מ, על ריכוז הסופית assay של 0.1 מ"מ, יעילה למטרה זו; ראה סעיף נציג תוצאות). לא להוסיף כימיקלים (מבחן או שליטה) 2 העמודות החיצוני של הלוחות, כפי שהם רגישים במיוחד לייבוש.</li>
</ol>9. ייבוש תרבויות
<ol><li>כדי להסיר את הנוזל מפני השטח של אגר, יבש הצלחות זרימה שכבתית ארון עבור 4-8 שעות. . זה קריטי כי הצלחות האלה הם יבשים לחלוטין אבל לא הופכים desiccated כמו כמה צלחות ייקח יותר זמן להתייבש יותר מאחרים, לפקח מקרוב את כל הצלחות ולהסיר ברגע שהם יבשים. לאשר ייבוש על ידי בדיקה חזותית זהיר הבארות בודדים של הצלחת. הערה: בהתאם גורמים, הכוללים את קצב הפליטה של הקבינט, הפעם שזה לוקח מדעית להיקבע. שלב הייבוש זה יכול לקחת כ- 4-8 h עבור ארון מלא.</li>
	<li>חותם צלחות עם סרט שקוף ולאחר מכן לשים את המכסים את הצלחת.</li>
	<li>לסובב את הצלחות 96-ובכן assay עבור 45 s-1,000 x g.</li>
	<li>חנות צלחות הפוכה ב 25 º C.</li>
</ol>10. הבקיע את תרבויות C. Elegans לאריכות ימים
<ol><li>לפקח על לוחות בקרה שלילית עד > 95% תמותה נצפית. בדוק לוחות שבועי עבור שתי שבועות ומדי יום לאחר מכן. Caenorhabditis גדודים של זן ו מינים אותו ניתן להציג לכלבים שונה באופן משמעותי על ידי משפט17. הערה: עבור וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן, עם חיות TJ1060 תרבותי 25 ° c, 95% תמותה בקרב אוכלוסיות אלה שהתרחשה בין מבוגר יום 16-20.</li>
	<li>כאשר שליטה שלילי בארות נחשבים הגיעו > 95% מארק, ספין לאורך כל הצלחות 96-ובכן assay עבור 45 s בצנטריפוגה מלמעלה בטבלה עם microplate הותאם רוטור (250 x g עבור 45 s ב- 20 ° C).</li>
	<li>ציון בארות כל לוחית שליטה. הדבר נעשה על ידי ספירת והקלטה מספר החיות חיים וגם מתים כל היטב. תולעים מתים יכול להיות מבודלים מהקבצים תולעים בחיים על ידי חוסר תנועה מוחלט שלהם. לעורר תנועה בעיר וורמס בחיים על ידי הטלת את הצלחת היטב 96 מ כ- 7 ס מ על גבי המשטח מיקרוסקופ ויבתר תוך התבוננות דרך העיינית של המצלמה עבור כל תגובה עורר. תולעים מתים לא יגיבו, הסמוך מעבדה החברים אולי לא מעריך את הרעש חוזרות.</li>
	<li>עבור לוחות מבחן, לספור, להקליט רק בארות המכיל תולעים בשידור חי. כאשר נוצרת תולעת בשידור חי, לספור כל החיות חיים וגם מתים בתוך הבאר הזו, יחד עם מיקום טוב ו צלחת. הערה: זה לעיתים קרובות שימושי להבקיע מחדש את הצלחות לאחר > 99% של שליטה שלילי תולעים מתים. במסכים בקנה מידה גדול, זה עשוי להיות הנקודה הכי טוב לעשות על מניה הראשונית. בכל מקרה, הציון/מחדש-score כמתואר לעיל</li>
</ol>11. בדיקה מחדש תרכובות
<ol><li>בעת בדיקת רק מספר קטן של המועמד תרכובות (< תרכובות 320), כמו בדיקה חוזרת או מסך המועמד (ראה תוצאות נציג), להגביל את וזמינותו הבארות מרכזי 32 בניסיון למזער תופעות אפשריות הצלחת. זה משאיר הבארות 2 הכי קרוב לקצה הלוח לא מטופלת אבל עדיין המכילה אגר, מזון ותולעים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307 (5707), 258-262 (2005).</li><li>Melov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).</li><li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Genes+Tied+to+Endocrine,+Metabolic,+and+Dietary+Regulation+of+Lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+Genomic+RNAi+Screen.">New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen.</a> PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+chemicals+that+increase+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).</li><li>Fabian, T. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+age-synchronous+mass+cultures+of+Caenorhabditis+elegans.">Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans.</a> J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).</li><li>Greer, E. L., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+dietary+restriction+regimens+extend+lifespan+by+both+independent+and+overlapping+genetic+pathways+in+C.+elegans.">Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans.</a> Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).</li><li>Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+dietary+restriction+for+genetic+epistasis+analysis+and+gene+discovery+in+C.+elegans.">Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans.</a> PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).</li><li>Hamilton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).</li><li>Frankowski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+and+dimethyl+formamide+increase+lifespan+of+C.+elegans+in+liquid.">Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid.</a> Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genetic+background+and+experimental+reproducibility+on+identifying+chemical+compounds+with+robust+longevity+effects.">Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects.</a> Nat Commun. 8, 14256 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ישות מימון תמיכה עבודה זו היה כל קלט על איסוף נתונים, ניתוח של תוצאות, או ההחלטה לפרסם.

כאן תארנו שיטה פשוטה עבור culturing C. elegans ב 96-ובכן צלחות. אנו מתארים תרבויות אלה לשימוש הקרנה כימי מבחני תוחלת החיים, אך הם יכולים לשמש עבור סוגים רבים של מבחני. בזמן התנאים תרבות רב טוב לסינון כימי כבר קודם לכן דיווח8, כולל עבור תוחלת החיים ניתוח10, וזמינותו המתוארים כאן שונה במספר דרכים. וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן מנצל 96-ובכן צלחות מסתמך על מוטציות סטרילי (במקום עיקור כימית), משתמשת אגר תרבות בתנאים, משתמשת נוזל פשוט טיפול להעביר תולעים, הוא הבקיע באופן ידני על נקודת הקצה. הגישות השונות בשימוש assay הזה עשוי להיות לעזר לחוקרים מחפש הקרנת שיטות הכוללות תנאים אלה.
רכיבים חיוניים כדי פרוטוקול זה מרכז בעיקר על איכות הגלופות הופק עבור וזמינותו. ראשית, בעת ביצוע צלחות זה הכרחי כי השטח אגר הינו ללא בועות, פגמים אחרים. אלה בווריאציות פני אגר כמעט תמיד להוביל ומחילות ואובדן של הבאר. שנית, פרוטוקול זה מסתמך על הניגוב נוזלים הופקדו בשלבים סימום וההתקנה. . זה קריטי כי נוזלים אלה יוסרו לחלוטין, אבל אגר לא להפוך התייבש Anecdotally, נראה כי תולעים בבארות שאינם לגמרי מיובשים (שחייה בנוזל) יחיו זמן רב יותר יבשים כראוי וולס, בזמן ייבוש יתר הלוחיות מוביל לייבוש פיצוח של אגר, מה שמוביל תולעת ומחילות ואובדן. עוד אלמנט מכריע של פרוטוקול זה הוא שמירה על תנאים סטריליים. כמו עם כל assay תוחלת החיים, יש הרבה עבודה רגשית עם הגדרת צלחת ולאחר זמן והזדמנויות רבות קיימות עבור assay הורס זיהום ליישב ולגדול על הלוחות.
בעוד וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן הוא שימושי להקרנה של תרכובות C. elegans, זה מוגבל לרקע גנטי מסוים, כמו זה מסתמך על זן רגיש (ts) טמפרטורה סטרילית; השתמשנו TJ1060, שבו יש עקרות גבוהה penetrance. זה מגביל זנים הזמין להקרנה בשיטה זו. חלופה ניגש כולל חציית מוטציות סטרילי ts לתוך הרקע הרצוי או באמצעות עיקור כימי. לא ניסינו עיקור כימי עם assay הזה, אבל זה צריך להיות אפשרי. משוכות פוטנציאליים כוללים הצבת המעקר התולעים בשלב הנכון, את המינון הנכון. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש מתקן נוזלי מהיר, אך אינו מופיע כדי לוותר על מבוגרים ביעילות. כך, תולעים אלה לפתח על הלוחות, ולכן חייבים להיות מטופלים עם עיקור כימי על הלוחות. קביעת המינון האופטימלי ואת התזמון יהיה חשוב להצלחה. אסטרטגיות אלטרנטיביות כוללים באמצעות שיטה שחולק שיכול להזיז מבוגרים. בעבר, מצאנו כי מכונות מסוגל לזהות ולמיין מבוגרים הם בדרך כלל איטית יותר מאשר המטפלים נוזל פשוט, אשר יכולים לדלג slurries הומוגנית של זחל על תנאי.
באופן כללי, אנו משתמשים בשיטה זו כדי במהירות מסך כימיקלים וטיפולים עבור גדול השפעות חיוביות על תוחלת החיים. השיטה זו יעילה במיוחד בעת שימוש במינונים מרובים, גבוהה לשכפל את המספרים, לסגור ניטור של פקדים שלילי כי הם תמיד מתוחזקים וביניהם בין הלוחות הבדיקה. פקדים חיוביים שימושיים גם בעת תכנון וביצוע המסכים המתואר בכתב היד. עם זאת, כדי להיות חיובי יעיל, הפקד יצטרך להיות חזק למדי ו/או חזקה מאוד. כאשר המסך במקור פרוס, תרכובת כראוי חזק וחזק לא היתה אפשרות לזהות. כיום, ישנם דיווחים רבים בספרות "הזדקנות" של מועמדים חיובי פקדים שימושיים במסכים המתוארים כאן. כפי שמתואר בסעיף מסך המועמד של המקטע התוצאות הצפויות של כתב יד זה, איור 2 , טבלה 1, מתחם NP1 הוא פקד חיובי יעיל עבור מסך זה. אנחנו בדרך כלל לאשר חיובי להיטים משנות את המסכים הבאים עם תוחלת חיים רגילה מבחני על צלחות תרבות 3 מ מ.

כאן פרוטוקול המתואר שפותח להקרנה תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות על ההשפעות על תוחלת החיים Caenorhabditis elegans . פרוטוקול עצמה ניתנת להתאמה בקלות מסכי פנוטיפי אחרים, כולל לימודי ניצול זנים של C. elegans כתב. פרוטוקול זה היה מנוצל בהצלחה לזהות תרכובת פעילים ביולוגית הרומן, NP1 (nitrophenyl-piperazine 1), זה בחריפות מאריך את תוחלת החיים של C. elegans באמצעות מנגנון הגבלת תזונתיים. NP1 אפיון של השפעתו על תוחלת החיים, כולל תיאור של המסלולים גנטי משחק, היה בעבר תיאר במקום1. דוח זה כולל גם תיאור של התוצאות של יישום בקנה מידה גדול של המסך. כאן נתאר בפירוט רב יותר הרבה את המתודולוגיה ואת ההתקנה של המסך עצמו, אשר היא מדרגית ליישומים שנינו קטן - ו large היקף.
המטרה זה הוביל ליצירתו של הפרוטוקול המתואר כאן הייתה לפתח פלטפורמה תרבות C. elegans מותר להקרנה מהירה של ספריות כימיים גדולים עבור הרומן חומרים פעילים ביולוגית. בעוד מסכי כימי בוצעו לפני הפיתוח של פרוטוקול זה, היו אלה בעיקר בקנה מידה קטן ו/או המועמד סוג מתקרב2,3. ואכן, רוב המסכים שבוצעה במעבדה על עשרות מתחמים מנוצל מתח מבחני עמידות, עם להיטים מוקרן על אריכות ימים תופעות4. מחקר זה ביקשו במקום ישירות למסך לאפקטים תוחלת החיים. למרבה הפלא, היו כמה תיאורים בספרות המדעית בזמנו של ביצוע מסכי כימיות בקנה מידה גדול עם C. elegans. אכן, לעומת סוגים אחרים של מסכי5,6,7, הקרנה כימיות בקנה מידה גדול באמצעות C. elegans נראו המועסקים תחת.
היו שני תיאורים בקנה מידה גדול כימיים המסכים של C . elegans ששימשו כבסיס לפיתוח גישה זו. הראשון היה מחקר אלגנטי מן המעבדה של פיטר רוי באמצעות מסכי כימי לזיהוי תרכובות יכול perturb את התפתחות בעלי חיים. המחקר ואז במעקב עם מסך מוטגנזה מכוונת קדימה כדי לזהות את המטרות גנטי של כימיקלים אלה8. פרוטוקול המתוארים במחקר זה נעשה שימוש פאטה 24-ובכן, אשר היה פשוט לתפעול לצרכים הספציפיים של מחקר זה (כמות מוגבלת של חומר כימי בספרייה ואני בחלל החממה זמינים מוגבל). המחקר השני היה של מייקל Petrascheck שאפתני וחדשני מולקולה קטנה מסך עבור תוחלת החיים הארכת כימיקלים9,10. המחקר הזה משמש 384-ובכן לוחיות והתרבויות נוזלי. התכונה העיקרית אחרים של מסך זה היה השימוש FUDR (5-fluorodeoxyuridine) כימית לעכב ייצור רומא. לאחר התחשבות ניכרת של פרוטוקול המתוארים במחקר זה, היו להימנע עיקור כימית והן תרבויות נוזלי של C. elegans .
למרות FUDR הוא בשימוש נרחב בניסויים תוחלת החיים C. elegans , היו חששות כי FUDR עלול לגרום תרופתיות בלתי צפויות או את FUDR עצמו יש השפעה על תוחלת החיים. לאחרונה זה הדאגה השנייה אומתה, לפחות בריכוזים מסוימים ובמיוחד בגיל 25 ° C11. כדי לעקוף את הבעיה של רומא זיהום, שימש C. elegans זן TJ1060, אשר בנמלים שתי מוטציות רגיש לטמפרטורה עצמאית (spe-9 (hc88) אני; rrf-3(b26)II) לבטל את ייצור הזרע ולא הוכחו להיות שימושי על תרבויות המונית של אוכלוסיות סינכרונית12. זן זה היה עקר לחלוטין 25 ° c, אך תייצר רומא בעת תרבותי ב 15-20 º C. מחקר זה משמש תנאי התרבות קונבנציונאלי, עם תולעים זוחל על פני השטח של אגר, כמו התוצאות המתקבלות עם נוזלי תרבויות אינן תמיד לשחזור עם פלטות אגר קונבנציונלי. בעוד תופעה זו אינה מובנת לחלוטין, זה הוכח כי תולעים תרבותי ב נוזלי להגיב ד ר (הגבלת תזונתיים) באופן שונה מאשר תולעים תרבותי על סטנדרטיים מדיה13,14. לכן סביר כי מדיה נוזלי יכול להסוות כמה מימטיקה ד ר כי אחרת להיות מזוהה עם המסך.
התיישב על אגר תרבות תנאים, אפשרויות שונות עבור הבקיע את הביצועים של בארות assay זו נחשבו. בעוד שונים האוטומטית או הדמיה המבוססת על מבחני היו זמינים, הם המתחייבות רכישה והיערכות טכנית מאתגר התקנים, אשר רובם היו לחדשו. בעוד בהתחשב באפשרויות אלה, זה היה חיוני כדי להפנות אל המסכים תוחלת החיים הקודם מכל הסוגים. בסופו של דבר, מחקר זה משמש שיטת הניקוד הותאם ממסך המעבדה סיו סילביה לי כל הגנום RNAi תוחלת החיים פנוטיפים15. באופן ספציפי, כל לוחות תוחלת חיים סידרו באופן זהה, אך רק הפקדים שלילי נוטרו. ברגע הלוחות שליטה שלילי אומתו שיש ליד התמותה השלם, בדיקת לוחות זכו בעבודת יד. במסך זה בקנה מידה גדול, תוצאות חיוביות שאושרו על-ידי בדיקה מחדש עם כימיקלים הטרי, באמצעות שהפקידים חזרות על הצד החיובי העיקרי.

<table><tbody><tr><td>LB Broth Miller Granules</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unispense&amp;nbsp;</td><td>Wheaton Science Products</td><td></td><td>automated fluid dispensing apparatus</td></tr><tr><td>96 well assay plate; COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manufactored worm pick</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td><td>IKA Works, inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td><td>&amp;nbsp;Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&amp;nbsp;</td><td>Sorenson Bioscience, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td><td>we use rainin&amp;hellip;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם שימושי לבדיקת השפעות כימיות על הפיזיולוגיה. מסכי מולקולה קטנה מהאורגניזם מציעים יתרונות משמעותיים לזיהוי אקטיביות כימית מבנים אותם ניתן לשנות פנוטיפים מורכבים כגון תוחלת החיים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול פשוט בהפקת מאות לוחות 96-ובכן תרבות עם מספרים עקביים למדי של C. elegans היטב בכל. בשלב הבא, אנו לציין כיצד להשתמש תרבויות אלה למסך אלפי חומרים כימיים עבור אפקטים על תוחלת החיים של תולעים נימיות C. elegans. פרוטוקול זה עושה שימוש של זנים סטרילי רגיש לטמפרטורה, תנאים צלחת אגר לטיפול כדי להקל על ייצור תפוקה מהירה וגבוהה של תרבויות החיות מסונכרן להקרנה בבעלי חיים פשוטים.

נתחיל על-ידי בדיקת תוצאות נציג של העסקת פרוטוקול זה עבור מבחני 96-ובכן תוחלת החיים. בדוגמה הראשונה, השיטה שימשה למסך דרך כימיקלים 30,000 בהצלחה לזהות כימיקלים להאריך את תוחלת החיים של C. elegans, וכוללת גם תוצאות המסך המשך בדיקה חוזרת של כימיקלים באמצעות הביצועים הטובים ביותר באותו פרוטוקול. תוצאות אלו היו שתואר לעיל1. הדוגמה השניה משתמשת באותו הפרוטוקול מסך מידה קטן יותר של תרכובות המועמד.
בקנה מידה גדול מסך ולבדוק מחדש: המסך בקנה מידה גדול בדיקות תרכובות 30,000 בוצעה ב מנה אחת, ב כפילויות. כל חומר כימי ולכן נבדקה ב שתי בארות עם אוכלוסיה הצפוי של בעלי חיים הכולל של 20. כדי לעשות זאת, הוקרנו שלושה סטים נפרדים של 10,000 תרכובות (כפולים) על פני תקופה של ~ 3 חודשים כדי לכסות את תרכובות 30,000 כולו. זה נעשה באופן חלקי, על מנת להבטיח כמות לניהול של ניקוד ידני בסוף וזמינותו, נדרש בסך 260 הלוחיות 96-ובכן וזמינותו בכל אחד של ערכות. בספריית מלאי הצלחות, רק 80 בארות הכיל המתחם; שכפול אחד של תרכובות 10,000 הופך 125 צלחות וזמינותו. מחקר זה להשתמש משכפל 2 עם 10 לוחות בקרה שלילית בתוך כל קבוצה. כדי להגדיל את התפוקה, צלחות זכו כאשר אוכלוסיות שליטה שלילי היו העריך חוו ~ 99% תמותה. כל מבחן בארות נבחנו ואז לתולעים בשידור חי.
כימיקלים בבארות עם תולעת חיה אחת נקראו להיטים. כימיקלים בבארות המכיל בחיים יותר 1 תולעת היו גם להיטים בשם, בנוסף את כל התולעים בבארות האלה (החיים והמתים) נספרו כדי ליצור תוצאה פשוטה (אחוז הציון חי; מספר תולעים בחיים לחלק למספר של תולעים מתים). כל כימיקל בספריה יכול לפיכך להיקרא מכה פעמיים ואת הפגיעות האלה, אבל אולי. לא, יש לי ציונים המשויכים אליהם. כימיקלים ייחודיים 512 נקראו להיטים (לפחות פעם) ממסך של תרכובות 30,000. המסך בוצעה מתוך כוונה זיהוי חזק ו/או חזקים אפקטים פרו-אריכות ימים (לשחזור). אלה שני מאפיינים שונים יכול להיות השפעות שונות. כימיקלים חזק יכול להגדיל באופן משמעותי תוחלת חיים ובמקרה היינו מצפים אחוז גבוה של תולעים בחיים של הכימיקל הזה היטב. כימיקלים חזקים, יהיה צפוי יש תולעים חיות שתי משכפל. רשימת המתנקשים דורגה בהתבסס על קריטריונים אלה. 179 של הכימיקלים הניב ציונים בחיים באחוזים גבוהים, או נפגעו במעבר משכפל שני, ולכן נבחרו לבדיקה מחדש. רוב הכימיקלים הנותרים קרא להיטים, אך לא נבחרה לבדיקה מחדש, הכילה רק תולעת יחיד חי באחת הבארות שכפל.
בדיקה מחדש של הלהיטים היה שבוצעו, בדומה למסך הראשי חוץ עם 3 משכפל (הצפוי הכולל חיה אוכלוסייה של 30), זהיר כימות לכלבים החיות לוחית שליטה ללא טיפול. שינויים אלה נוספו כדי לסייע בהשוואת הבארות בדיקה ובקרה. 179 של מכה כימי היו מחדש הורה, מדולל עד 10 מ"מ, הועבר לתוך צלחות טוב 96. רק הבארות 24 הפנימי שימשו וזמינותו בדיקה חוזרת (גירסאות נוכחיות של פרוטוקול זה הייתי משתמש הבארות 32 הפנימי כמתואר בסעיף פרוטוקול עבור מסכי בדיקה חוזרת) והיו תרכובות נבדק מחדש שהפקידים עם שש צלחות assay בקרה שלילית מטופלים עם דימתיל סולפוקסיד הממס. לוח בקרה שלילי אחד היה הבקיע מעת לעת להישרדות הכולל (איור 1א'). כ- 95% של חיות בקרת היו מתים, כל הצלחות זכו לחלוטין (התייחסו לחיות, תולעים מתים נספרו).
להתקשר להיטים מתוצאות בדיקה חוזרת, ניתוק בוצע ב הציון הממוצע חי אחוז של סטיות תקן שליטה שלילי +2 (SD). בשביל הבארות מבחן, בממוצע אחוז בחיים (בזמנו של מניה) ציונים חושבו על ידי חישוב ממוצע הציון בחיים אחוז מן משכפל שלוש במשך כל. עבור assay מסוימת זו, שליליות שליטה ממוצע הציונים וולס בחיים האחוזים חושבו כממוצע של משכפל שלושה 48-וולס (2 סטים של צלחות triplicate בקרה שלילית). הגרמנים נהגו לקרוא להיטים מסידרת כימי בדיקה חוזרת היה שהגרמנים על פני הפקד שלילי 48 בממוצע ציונים בחיים אחוז. מחקר זה באמצעות אסטרטגיה זו, למצוא להיטים 57 מהספרייה בדיקה חוזרת של תרכובות 179, הוכחת כי סכום כולל של 32% של הכימיקלים בדיקה חוזרת חיובית (איור 1B). Binning של בממוצע הציונים בחיים אחוז בשביל הבארות בקרה ובדיקה שלילי ציינו כי הבארות מבחן ביצועים טובים יותר הבארות שליטה (איור 1C).
מועמד מסך: מסכי בקנה מידה קטן יכול להתבצע באופן דומה הבחינה שתוארו לעיל. כאן, אנו מתארים את התוצאות ממסך מועמד עם תרכובות 139. מועמדים אלה רוכזו כמבני סביר לקדם את תוחלת החיים. עבור מסך זה, נוכל לבצע משכפל 5 הלוחיות מבחן במינונים שונים שני (מיקרומטר 50 ו- 100 מיקרומטר). בנוסף, השתמשנו 8 לוחות בקרה שלילית עם צלחת בקרה חיובית יחיד (NP1) המכילות מינונים שונים שני; מיקרומטר 50 ו- 100 מיקרומטר.
לוחות בקרה שלילית נוטרו עד ~ 90% של בעלי חיים מתים. באותו הזמן, וולס היו שבוים על ידי ספירה חיה ומתה תולעים בבארות שליטה כל ולאחר מבארות מבחן שהכיל תולעים בשידור חי. האחוזים חי בזמנו של הניקוד שימשו לחישוב ציונים בחיים אחוז בממוצע במשך כל. עבור הפקדים שלילי, בארות 32 היו ציונים בחיים אחוז מן משכפל 8. עבור הפקדים חיובית, היו 4 ציונים טוב בממוצע על פני משכפל 4 עבור כל מנה. להיטים נקראו וולס עם ניקוד בחיים אחוז בממוצע, זה היה גדול יותר בממוצע אחוז שליטה שלילי בחיים ציון +2 SD. הפסקת הזה עזב 14 להיטים מהמסך של המועמד, נשלל כל הבארות שליטה שלילי. את הכשל כללה גם את כל השליטה חיובי בארות שטופלו ב 100 מיקרומטר ו 50% של הפקדים חיוביים שטופלו ב 50 מיקרומטר. תוצאות אלו מוצגים כאן כפי מנופה בממוצע ציונים בחיים אחוז את 50 מיקרומטר (איור 2א) וגם את המסכים מבחן 100 מיקרומטר (איור 2B).
לבסוף, כל הצלחות היו הצליחו מחדש בנקודת זמן מאוחרת, אשר תאמו זמן כאשר יחס גדול מ- 99% של הפקד שליליים בעלי חיים מתים. תוצאות אלה יצוין כי הבארות בקרה חיובית הרבה יותר שבוצעה שלילי בדיקה ובקרה הבארות (איור 2C). בעוד הבארות הבדיקה היו מעט יותר הפקדים שלילי. תוצאה זו האחרון הוא מוטה על ידי הסימן כי רבים מן הבארות מבחן הופיע שהפגינו רעילות ביחס לטיפול שליטה (טבלה 1), ובכך משתנה מתערב פרשנות פשוטה זו. זה היה צפוי, שכן הספרייה המועמד היה מסך אמיתי של כימיקלים עם פעילות ביולוגית לא ידוע ב- C. elegans, בדיקה חוזרת של המסך היה בעיקרו ממוסך מראש עבור תרכובות שלא היו רעילים. מאז במסך הראשי זה היה עבור תרכובות מאורכים תוחלת החיים, באופן משמעותי כימיקלים רעילים צריך לא ב לבחון מחדש הוגדרו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> איור 1 : נציג נובעת גבוה מסך התפוקה ובדיקה מחדש (א) שאירים עקומת מצלחת ייצוגית שליטה שלילי בשימוש וזמינותו בדיקה חוזרת. עקום זה נבנה מתוך הבקיע כל התולעים בשידור חי ומת ב הבארות 24 בשימוש זה וזמינותו 4 פעמים במהלך הימים 18 של וזמינותו. יום 18 של בגרות, פקדים היו העריך שיש ~ 5% הישרדות, מבחן שליטה וכל הצלחות היו אז גם כבש. (B) טבלה המסכמת את התוצאות של המסך, בדיקה חוזרת. (ג) Binning של הציונים אחוז בארות בממוצע בחיים בתנאי בקרה ובדיקה מהמסך בדיקה חוזרת. עבור פקדים, הציונים הם מבארות 48 אחד המורכב הממוצע של משכפל 3. תוצאות הבדיקה הן בארות 179 אחד המורכב הציון בממוצע של משכפל שלוש. איור 1 המופקת מן הפרסום הקודם1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> איור 2 : נציג נובעת מסך המועמד Binning (א) של תוצאות מהמסך המועמד 50 מיקרומטר. תוצאות הבדיקה-ובכן 139 לייצג את הציון בחיים אחוז בממוצע בין משכפל 5. התוצאות שליטה שלילי 32 מורכב בממוצע ציונים בחיים אחוז מן משכפל 8. התוצאות בקרה חיובית 4 מורכב בממוצע ציונים בחיים אחוז מ 4 משכפל (סה כ 16 בארות NP1 המכיל ב 50 מיקרומטר). Binning (B) של תוצאות מהמסך המועמד 100 מיקרומטר. כל הוא זהה (א), חוץ מזה מבחן בארות ופקדים חיובי טופלו בריכוזים 100 מיקרומטר. הלוחות בקרה שלילית באותו מוצגים הן (A ו- B). (ג) נציג נובעת לבדיקה חוזרת הלוחות בנקודת זמן מאוחרת יחסית קיצוני. פקדים חיובית באופן דרמטי ביצועים טובים יותר כל השאר, אם רק החשבונאי האחוזים של וולס עם תולעים חיות בנקודה זו בזמן, אשר הוא לרעת מבחן בארות כפי שמתואר הטקסט העיקרי, טבלה 1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">Binning של בממוצע ציונים בחיים אחוז</td>
		</tr>
<tr>
<td>ציונים מקובצת</td>
			<td>כל המתים (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>בדיקה חוזרת</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># של (-) שליטה</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># של מבחן בארות (50µM)</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>המועמד מסך</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># של (-) שליטה</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># של (+) שליטה (50µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># של (+) שליטה (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># של מבחן בארות (50µM)</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># של מבחן בארות (100µM)</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: נציג נובעת binning שונות כאן אנו מציגים את binning של הציונים בחיים אחוז בממוצע של שני המסכים (בדיקה חוזרת, המועמד). במסך בדיקה חוזרת, הפסגה היא דומה אל הפקד שלילי עם מחדש בדיקות outperforming הפקד שלילי באופן דרמטי בצד הימין (מאריכים) בצד של השולחן. הדבר מעיד על הנוכחות של תרכובות פרו-אריכות ימים מרובים נוכח ערכת בדיקה חוזרת. המסך המועמד, אנו רואים כי השיא הוא בקטגוריה כל מת, אמנם יש גם אות לכאורה מצד ימין של הטבלה. זה מעיד על קיומם של אריכות פרו-ימים תרכובות בערכת המועמד, אלא גם מעיד על קיומם של רעילות משמעותיות בין המועמד קבוצת תרכובות.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

כאן נתאר פרוטוקול פשוט להפקת במהירות מאות צמיחה נמטודות מדיה אגר, 96-ובכן תרבות צלחות עם מספרים עקביים של Caenorhhabditis elegans לכל טוב. תרבויות אלה שימושיים להקרנה פנוטיפי של אורגניזם שלם. אנו מתמקדים כאן באמצעות תרבויות אלה לכימיקלים מסך עבור אפקטים פרו-אריכות ימים.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

a-simple-method-for-high-throughput-chemical-screening-caenorhabditis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

8.7K Views.  The Buck Institute for Research on Aging. כאן נתאר פרוטוקול פשוט להפקת במהירות מאות צמיחה נמטודות מדיה אגר, 96-ובכן תרבות צלחות עם מספרים עקביים של Caenorhhabditis elegans לכל טוב. תרבויות אלה שימושיים להקרנה פנוטיפי של אורגניזם שלם. אנו מתמקדים כאן באמצעות תרבויות אלה לכימיקלים מסך עבור אפקטים פרו-אריכות ימי?...

Video: A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Developmental Biology

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Behavior

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Environment

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biology

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Immunology and Infection

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות