פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייעל את הבידוד והזיהוי של נמטודות Caenorhabditis מהטבע ולתעד נתונים אקולוגיים וסביבתיים חשובים הקשורים לסביבה הטבעית של nematodes. היתרונות העיקריים לטכניקה זו הם המדרגיות והדיוק שלה, המתאפשרים על ידי מינוף פלטפורמות איסוף נתונים ניידות, מסדי נתונים מבוססי ענן ופונקציות עיבוד נתונים מתוקננות. כדי להתחיל, לזהות מיקום כדי לסקור נמטודות Caenorhabditis.
כדי ליצור פרויקט נקודת המשען, צור חשבון עם נקודת המשען באופן מקוון באמצעות הסכם חינוכי ללא עלות והוסף את יישום הדגימה של שדה נמטודה. לאחר מכן הוסף את יישום בידוד הנמטודות. הדפס ערכה של תוויות קוד QR כתוויות C-Labels כדי לעקוב אחר האוספים ותוויות S כדי לעקוב אחר בידודי הנמטודות.
חבר את תוויות C לשקיות פלסטיק Ziploc לאריזה. שמור את הסט של תוויות S לשימוש במעבדה. בחר את דגימת שדה הנמטודה מהתפריט הנפתח של האפליקציה למכשירים ניידים של Fulcrum ולחץ על פלוס כדי להתחיל רשומה חדשה בפרוייקט.
צלם את המצע. הקש על השדה C-Label ובחר סריקה. סרוק את הברקוד בתיק האיסוף באמצעות מצלמת המכשיר הנייד ולאחר מכן הקש על סיום.
הקש על שדה המצע ובחר סוג מצע. מדוד את טמפרטורת פני השטח של המצע באמצעות מדחום ללא מגע ורשום את הערך בשדה טמפרטורת המצע. כמו כן למדוד ולתעד את טמפרטורת הסביבה והלחות.
שמור והקלט ב'נקודת המשען' על-ידי הקשה על שמירה בפינה הימנית העליונה של המסך. לאסוף כף של המצע ללא מקלות או חתיכות קשות אחרות על ידי היפוך שקית האוסף ככפפה כדי להרים את המצע, ולאחר מכן לאטום את התיק. עבור כל שקית Ziploc, שימו לב ל-C-Label על השקית והצמידו תווית C תואמת למכסה של צלחת באורך 10 ס"מ שזוהתה עם חיידקי OP50.
מעבירים כף אחת של דגימה מכל שקית איסוף לצלחות C באמצעות כף פלסטיק נקייה. ביישום נקודת המשען, בחר בידוד נמטוד מתפריט היישום. לאחר מכן צור רשומת בידוד חדשה על-ידי הקשה על סמל הפלוס בפינה השמאלית התחתונה.
הקש על לחצן הבחירה כדי למצוא את תווית C המשויכת לדוגמה. הקש על סמל החיפוש. לאחר מכן הקישו על סמל הסריקה כדי לסרוק את קוד ה-QR C-Label.
חפש נמטודות על לוחית C עם מיקרוסקופ מנתח. הקש על התולעים בשדה מדגם כדי לתעד את נוכחותם של נמטודות על המדגם. אם אין נמטודות קיימות, parafilm C-צלחת ולהיפטר ממנו בפח biohazard.
אם קיימות נמטודות, בודדו עד חמש נמטודות מלוחית C והעבירו כל אחת לצלחת ה-S שלה. לאחר מכן, הקש על השדה לוחות עם תווית S כדי להיכנס ללוחית S המשמשת לבידוד זה. הקש על הפלוס בפינה השמאלית התחתונה.
הקש על S-Label ולאחר מכן לחץ על סריקה כדי לפתוח את מצלמת ההתקן, ולאחר מכן סרוק את קוד QR S-Label בלוחית S. הקש על כפתור השמירה בפינה הימנית העליונה לאחר שרשומת הבידוד תוסיף את כל המידע כראוי, ולאחר מכן תוסיף את לוחות ה- S עם נמטודות מבודדות והנח אותם בצד באזור המיועד להחזיק לוחות S עם נמטודות. היכנס לאתר האינטרנט של נקודת המשען ובחר את יישום הבידוד של נמטודות.
לחץ על היצואן כדי להוריד קובץ zip המכיל את s_labeled_plates בידוד nematode. קובץ csv. נווט אל תבנית הגנוטיפינג המבודדת הפראית Google Sheet והעתק את גיליון Google.
מקם את תוויות ה-S שהועתקו מהבידוד של הנמטודות s_labeled_plates. עמודת csv בגיליון הגנוטיפינג. בדוק אם יש בעלי חיים מתרבים על S-צלחות 48 שעות לאחר הבידוד.
אם לוחית S כוללת בעלי חיים מתרבים, הזן אחד בעמודה 48 התפשטות בגיליון genotyping, ולאחר מכן להעביר את צלחת S לתיבה שכותרתה 48 שעות התפשטות תיבה אחת. בדוק את S-צלחות שלא התרבו ב 48 שעות לאחר הבידוד שוב ב 168 שעות לאחר הבידוד. אם לוחית S מתרבה כעת, הזן אחד בעמודה התפשטות 168 בגיליון genotyping ולאחר מכן להעביר את צלחת S לקופסה שכותרתה 168 שעות התפשטות תיבה אחת.
סנן את הגנוטיפ בגיליון Google כדי לכלול רק את תוויות ה- S בתיבת התפשטות אחת שיש להוסיף, ולאחר מכן בחר את העמודות S-Label באמצעות צמתי תמוגה. הדפס גליון עבודה תמוז עבור כל תיבת התפשטות שיש להוסיף. הכן 12 צינורות רצועה היטב עבור הדגימות להיות lysed.
יש לנתק צינור רצועה אחד ולהוסיף שמונה מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לכל מכסה עם צינור חוזר. בחר שלוש עד חמש חיות מלוחות המקור למיקומי המכסה המצוינים בגליון העבודה של תמוגה. חוזרים על הפעולה עד שמונה צינורות חשפנות ומניחים את צינורות הרצועה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.
הסר את הסטים של צינורות רצועה ולהפעיל את תוכנית תמוגה בתרמוציקלר. לאחר מכן לאחסן את lysates במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. מוציאים את צינורות הרצועה מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ומפשירים את חומר התזה על קרח.
בזמן שחומר הזיזה מפשיר, הכינו את ITS2 ו- SSU מאסטר מתערבבים בצינורות נפרדים על קרח. הוסף שני מיקרוליטרים של ליסאט לבאר המתאימה בלוח ה- PCR עם פיפטה רב-ערוצית בנפח נמוך. הפעל את PCRs עם תוכנית thermocycler המתאימה ולרשום אילו תוויות S מניבות מוצרי PCR ITS2 או SSU בגיליון genotyping.
עבור כל דגימה שהיא ITS2 חיובית, השתמש במוצר ה- PCR הנותר של ITS2 עבור ריצוף Sanger וקבל את קבצי פלט ה seq עבור כל S-Label מפלטפורמת הרצף. נווט אל אתר האינטרנט של NBCI BLAST בדפדפן אינטרנט כדי להתחיל בחיפוש BLAST. עבור רצפי לוח S כי BLAST למין Caenorhabditis, הזן את הסוג המלא ואת שם המינים של הלהיט BLAST העליון בעמודת זיהוי המין.
תן שם לזנים בשמות ייחודיים, בעקבות מוסכמות המינוח של Caenorhabditis והזן את שמות המתח בעמודת שם המתח. כדי לעבד את הנתונים, נווט אל אתר האינטרנט של נקודת המשען וייצא את נתוני הפרוייקט הגולמיים ממסד הנתונים של נקודת המשען. פתח קובץ Script חדש של R ובצע את ההוראות בציור נקודת המשען הקלה כדי לעבד את נתוני האיסוף.
ב NBCI BLAST, התוצאות עבור S-Label S-Label S-05554 להראות כי הלהיט העליון הוא Caenorhabditis briggsae. בנוסף, כמה נמטודות מבודדות דורשות מאמץ נוסף לגנוטיפ. לדוגמה, כ -2% מהבודדים אינם מצליחים להגביר עם פריימר SSU PCR שנקבע לאחר ניסיון התזה הראשון ויש להסתמך עליהם כדי להבטיח שחומר התזה מתאים להגברה עם ערכת הפריימר של ITS2.
בעקבות הליך זה, חוקרים יכולים לחקור את הנתונים האקולוגיים והסביבתיים הקשורים לבודד נמטודות בר כדי לזהות מיקומים ומאפייני מצע שסביר ביותר שיש להם מינים ספציפיים של נמטודות.
