Finanziamento per questo progetto è stato fornito dal programma di ricerca di scienza base attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero delle scienze e TIC (2016R1A2B2006354).

1. preparazione dei Media
<ol><li>Preparare Estratto di lievito con integratori (Sì), sì senza adenina (Sì basso Ade), Pombe Glutamate media (PMG12) e PMG senza adenina (PMG-Ade) mescolando i componenti come descritto nella tabella 1. Sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade hanno tutti gli stessi componenti, ma l'adenina è omesso da quest'ultimo.<ol>
<li>Utilizzare il seguente stock di sale (50x): 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50g/L KCl, 2G/L Na2modo4 in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Utilizzare il seguente vitamina (1, 000 x) magazzino: pantotenato di 1 g/L, 10 g/L di acido nicotinico, inositolo 10 g/L, biotina 10 mg/L in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Utilizzare il seguente minerale (10, 000 x) stock: 5 g/L di acido borico, 4G/L MnSO4, 4G/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1G/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L di acido citrico in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C. Nota: Sì liquido può essere fatto omettendo l'agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il mezzo di autoclave e raffreddarlo di sotto di 60 ° C continuando a mescolare con un ancoretta, al ritmo di 200 giri/min.</li>
	<li>Per piastre sì + G418 (geneticin), è necessario aggiungere soluzione di riserva di 1 mL/L G418 al mezzo Sì.<ol>
<li>Utilizzare il seguente G418 (1, 000 x) magazzino: G418 100 mg/mL in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm, aliquota per provette da 1,5 mL centrifuga e store a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mescolare per un altro 5-10 min e aliquota media nei piatti di Petri di 90 mm (1 L di aliquote medie di circa 40 capsule di Petri. Conservare le piastre a 4 ° C.</li>
</ol>2. clonazione di rpt4 + e suo 5' / 3' UTR
<ol><li>Eseguire PCR con primer p1 e p2 (Figura 1A) mediante fissione lievito DNA genomico (gDNA) come il modello in un volume totale di 50 µ l (~ 1 µ g del DNA, enzima U 20, 1x tampone di reazione), e applicando i cicli di reazione descritti nella tabella 2 per amplificare una 3.315-base frammento di coppia (bp) composto da rpt4 + e suo 5' / 3' UTR. Purificare il prodotto PCR usando un kit di purificazione13 come indicato dal produttore (Figura 1A).</li>
	<li>Digerire il pBlueScript KS(-) vettoriale14 e il frammento di DNA amplificato contenente rpt4 + con suo 5' / 3' UTR con BamH1 e Xho1 in un volume totale di 20 µ l (~ 1 µ g di DNA, 20 U enzima, tampone digestione 1x) a 37 ° C in un bagno d'acqua per 16-18 h (Figura 1B).</li>
	<li>Gel di purificare il vettore digerito (1,2% gel di agarosio) e inserimento di DNA mediante esecuzione di elettroforesi del gel dell'agarosi basati su TAE (100 V, 1h), asportando le bande di DNA della misura desiderata e isolare il DNA con un kit di estrazione gel15.</li>
	<li>Legare il vettore e l'inserimento di DNA usando T4 DNA ligasi eseguendo una reazione di legatura 20-µ l contenente 50-100 ng di DNA, di vettore un ~ 3 volte eccesso molare del DNA dell'inserto, 400 U T4 DNA ligasi e 1x buffer di legatura. Incubare la miscela a 18 ° C per 16-18 h.</li>
	<li>Trasformare il DNA legato in 100 µ l di e. coli DH5α applicando shock termico per 70 s a 42 ° C. Aggiungere 1 mL di LB e incubare per 1h a 37 ° C per il recupero. Eseguire la centrifugazione (13.800 x g), scartare il surnatante, piastra tutti del trasformato Escherichia coli cellule su piastre LB-ampicillina (LA) e incubare a 37 ° C per 16 h.</li>
	<li>Pick 4-8 colonie con degli stuzzicadenti e crescere durante la notte a 37 ° C in media 3 mL LA.</li>
	<li>Isolare i plasmidi con un plasmide purificazione kit16 usato secondo il protocollo del produttore ed eseguire le digestioni analitiche degli enzimi di limitazione con 5 µ l del plasmide isolato, 5 U di ciascun enzima di restrizione (BamH1 e Xho1) e 1x buffer di restrizione. Incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per 3 h. conferma la clonazione mediante sequenziamento plasmidi candidato la miscela di reazione.</li>
</ol>3. introduzione della mutazione silenziosa (Xho1 sito di restrizione)
<ol><li>Progettare un paio degli iniettori 33-bp (p3 e p4) che contengono la mutazione desiderata nella sequenza altrimenti complementare.</li>
	<li>Eseguire PCR con alta fedeltà della polimerasi17 (Figura 1) in un volume totale di 25 µ l (10 ng di plasmide clonato, 2 µ l di 10 pmol mix di primer, 2 U enzima, tampone di reazione 1x) utilizzando i parametri ciclismo riportati nella tabella 3.</li>
	<li>Digerire il plasmide modello con Dpnio in un volume totale di 20 µ l (20 U enzima, 1x buffer di digestione) a 37 ° C in un'acqua del bagno per 1 h.</li>
	<li>Trasformare, propagare, isolare e sequenza il plasmide contenente la mutazione silenziosa, come descritto nei passaggi 2.5-2.7. Nota: La mutazione silenziosa può anche essere introdotto utilizzando un metodo di clonazione che permette per la giunzione dei frammenti di DNA multipli in una singola reazione18.</li>
</ol>4. random mutagenesi di rpt4 + di Error-prone PCR
<ol><li>Eseguire errori PCR, utilizzando il plasmide con la mutazione silenziosa (sitoXho1 ) come il modello, primer p5 e p6, un volume totale di 50 µ l (l'importo del modello definito al punto 4.1.1, 2 µ l di miscela di primer 10 pmol, 2,5 U enzima, 1 tampone di reazione di x) , e una polimerasi speciale che è progettata per generare un errore elevato tasso19 (Figura 1). Eseguire la PCR come descritto nella tabella 2.<ol>
<li>Utilizzare 4-5 µ g di plasmide modello per controllare la frequenza di mutazione a 1KB bp (kilobase). Nota: Un'alta concentrazione (> 500 ng / µ l) del plasmide, che può essere ottenuto utilizzando un mini-prep kit20, è necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare l'elettroforesi del gel per confermare un prodotto PCR di 2670 bp (1,2% gel di agarosio). Gel di purificare questo prodotto PCR come descritto al punto 2.5.</li>
</ol>5. preparazione di frammenti di PCR di Fusion (KAN, 3' UTR)
<ol><li>Eseguire PCR utilizzando pFA6a-KANMX621 come modello, primer p7 e p8 e le condizioni elencate in tabella 4 per ottenere il frammento di marcatore (KAN). Gel di purificare il frammento di 1.480-bp risultante come descritto al punto 2.5 (Figura 1E).<ol>
<li>Verifica se il codone di arresto del gene mirato per mutazione e la regione di codificazione del suo gene adiacenti sono separati da più di 500 bp. Il terminatore endogeno non può essere utilizzato quando questa regione è inferiore a 500 bp; piuttosto, il terminatore di ADH dovrebbe essere usato anziché il terminatore endogeno. I cambiamenti di protocollo necessari per utilizzare il terminatore di ADH sono presentati nella tabella 5. Nota: Queste modifiche si applicano solo quando il terminatore di ADH , che è disponibile nel plasmide pFA6a-3HA-KANMX6, viene utilizzato invece il terminatore endogeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire PCR con clonato rpt4 +-contenente vettoriale come il modello e primer p9 e p10 in un volume totale di 50 µ l (20 ng di plasmide clonato, 2 µ l di 10 pmol mix di primer, 2 U enzima, 1x tampone di reazione), utilizzando le condizioni presentate nella tabella 6. Gel di purificare il frammento UTR ottenuti 506-bp 3' (Figura 1E).</li>
</ol>6. generazione del costrutto trasformazione da fusione PCR (Figura 1E)
<ol><li>Preparare i 3 frammenti (mutagenized rpt4 +, KAN e il 3' UTR) a 50 ng / µ l.</li>
	<li>Eseguire la fusione che PCR dei tre frammenti utilizzando primer p11 e p12, come descritto nella tabella 7. (Il protocollo per la fusione PCR è una modifica del protocollo originale22). Purificare il prodotto di PCR di 4.398-bp principale.<ol>
<li>Utilizzare rpt4 +: KAN:3'UTR frammenti con un rapporto di 1:3:1 per ottenere risultati ottimali. Nota: L'importo totale del DNA inserto non deve superare 500 ng. La quantità consigliata di rpt4 +: KAN:3'UTR è 50 ng:150 ng:50 ng. La regione mutagenized è di circa 1,6 kb, quindi il numero minimo delle colonie del lievito che potesse spiegare tutte le possibili combinazioni di ciascuna base essendo mutato agli altri tre è 1.600 x 3 = 4.800 colonie. Perché una reazione di trasformazione in genere produce colonie di 400-500, è necessario almeno 10 reazioni vale la pena di fusione PCR costruire. Questa necessità possa essere soddisfatte semplicemente aumentando la quantità di reazione (cioè, il numero di provette per PCR) di un fattore dieci.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. trasformazione del lievito di fissione mediante elettroporazione (Figura 1F)
<ol><li>Inoculare il lievito a 10 mL di mezzo di sì alla saturazione incubando esso per più di 16 h.</li>
	<li>Diluire le cellule a densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,2 in 200 mL di terreno di sì e incubare a 30 ° C con agitazione per 5-6 h, a OD600 = 0.6 - 0.8.</li>
	<li>Concentrare le cellule a OD600 = 30, erogare in quattro provette coniche da 50 mL e chill sul ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Raccogliere le celle eseguendo centrifugazione a 1.050 x g per 3 min a 4 ° C. Posizionare i tubi e 10 electro-cuvette sul ghiaccio. Eseguire la procedura 7.3-7,8 sul ghiaccio.</li>
	<li>Scartare il surnatante e aggiungere 15 mL di sorbitolo 1,2 M. Agitare delicatamente le provette per risospendere le cellule.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 1050 x g per 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 7.4 e 7.5. Scartare il surnatante. Aggiungere 500 µ l di 1,2 M sorbitolo in ogni provetta, risospendere le cellule e raccogliere tutte le celle in una provetta conica da 15 ml.</li>
	<li>Aggiungere 1,2 M sorbitolo fino a 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Tenere il tubo sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di cellule sorbitolo-sospesa (assicurarsi che essi sono completamente sospesi) in una provetta di EP contenente la fusione PCR costruire, mescolare bene e trasferire il campione di un electro-cuvetta.</li>
	<li>Electroporate le cellule con le seguenti opzioni: funghi, ShS (2.00kV, 1 impulso).</li>
	<li>Aggiungere 600 µ l di 1,2 M sorbitolo ogni electro-cuvette per un volume totale di 800 µ l e poi diffuso le cellule su quattro piatti Sì (200 µ l/piastra). Dieci electro-cuvette erogherà a 40 sì piastre.</li>
	<li>Incubare le piastre a 30 ° C per 24 h.</li>
	<li>Eseguire piastratura delle repliche a Sì + G418 e incubare le piastre a 30 ° C per 3 giorni.</li>
</ol>8. selezione di mutanti eterocromatina-destabilizzante e la verifica di falsi positivi
<ol><li>Per ogni piastra sì + G418, eseguire piastratura delle repliche di sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade (No Ade). Incubare le piastre di replica per 1-2 giorni a 30 ° C, fino a quando alcune delle colonie sulle piastre sì-Ade mostrano una colorazione rossa (Figura 1).</li>
	<li>Confronta le piastre sì-Ade e PMG-Ade e selezionare le celle che mostrano rosa o bianco sulla piastra sì-Ade e anche crescono sulla piastra PMG-Ade. Non selezionare colonie senza crescita il PMG-Ade, in quanto essi sono falsi positivi (ad es., riflettendo che la cassetta di KAN è stata integrata in un sito non-bersaglio altrove nel genoma).</li>
	<li>Prendere circa 1 x 105 celle da ogni Colonia e incubare a 10 µ l di soluzione SPZ contenente 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C per almeno 30 min. uso 1 µ l di questa soluzione per eseguire come il modello di partenza per la Colonia PCR (Figura 1 H).<ol>
<li>Fare SPZ (50 mL) mescolando 30 mL di sorbitolo 2m, 4,05 mL di 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 e 15 mL di acqua distillata (pH finale, 7.5). Campioni (5 mL) possono essere completati con zymolyase e memorizzati in aliquote di 500-µ l a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi del gel (gel di agarosio 1.2%, 180V, 20 min) per visualizzare i risultati di + la PCR della Colonia. Selezionare le reazioni che esibiscono bande PCR delle dimensioni corrette e digeriscono 5 µ l di ciascun prodotto di reazione con Xhoio (4 U enzima, tampone digestione 1x, bagno di acqua di 37 ° C, 1h) per identificare i falsi positivi (Figura 1 H).</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi del gel per visualizzare le raccolte di XhoI (1,2% gel di agarosio, 180 V, 20 min). Contrassegnare le colonie in cui prodotti PCR sono tagliati da XhoIe loro patch a piastre sì + G418 (Figura 1I).</li>
	<li>Isolare gDNA da cellule di lievito di fissione ed eseguire l'ordinamento dei prodotti PCR23. Confronta la sequenza ottenuta con la sequenza wild-type per identificare mutazioni (Figura 1I).</li>
	<li>Direttamente re-introdurre la mutazione di cellule wild-type trasformandoli con costrutti di fusione amplificati dalla PCR da cellule mutanti23. Utilizza individuazione per confermare il fenotipo in cellule mutanti appena effettuate (Figura 1J).<ol>
<li>Costrutto di trasformazione di fusione può essere facilmente amplificato mediante PCR con primer p1 e p10 utilizzando il DNA genomic di mutanti come il modello in un volume totale di 50 µ l (~ 1 µ g del DNA, enzima U 20, 1x tampone di reazione) e applicando i cicli di reazione descritti in tabella 2 . Trasformazione del costrutto può essere fatto seguendo i passaggi 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mutagenesi casuale tramite PCR errori è un potente strumento per la generazione di un pool di diverso mutanti in una determinata regione. Questa tecnica è particolarmente utile per gli studi che cercano di valutare la funzione di una proteina in una circostanza specifica. Ad esempio, abbiamo utilizzato nel presente documento errori PCR per valutare la funzione della 19S proteasome subunità, Rpt4, nella manutenzione di eterocromatina. Variando la regione mirato dalla PCR errori e regolare le condizioni di selezione, si...

Genetica in avanti è un metodo classico, in cui i ricercatori cercano mutanti naturali che visualizzano un fenotipo particolare ed eseguire analisi genetiche. In genetica inversa, mutazioni vengono introdotti in un gene di interesse ed il fenotipo è esaminato. In quest'ultimo caso, mutagenesi casuale di un gene target viene spesso utilizzata per generare un pool di mutanti che sono successivamente selezionato per desiderata fenotipi, come sensibilità di temperatura o alterati di attività enzimatica. Possono essere utilizzati vari metodi per raggiungere mutagenesi casuale, tra cui errori PCR1; Di irradiazione UV2; mutageni chimici, ad esempio methanesulfonate etilico (EMS) o acido nitroso3; l'uso di ceppi di mutator temporanei, come quelli che sovraesprimono mutD5 4; e DNA shuffling5.
Qui, descriviamo una strategia inversa-genetica in cui utilizziamo errori PCR per generare mutanti piscine per un gene dell'obiettivo del lievito di fissione. Come si potrebbe intuire dal suo nome, questo metodo genera mutazioni introducendo deliberatamente errori durante la PCR. A differenza di altri metodi di mutagenesi, errori PCR permette all'utente di definire la regione a essere mutagenizzato. Questo rende particolarmente utile negli sforzi per studiare la funzione di una proteina/dominio di interesse.
Per illustrare questa procedura di mutagenesi casuale, qui usiamo rpt4 +, che codifica per la subunità del proteasoma 19S, come un esempio. Rpt4 ha dimostrato di avere funzioni di proteolisi-indipendente negli organismi diversi da fissione lievito6,7,8,9, e un difetto nella proteolisi potrebbe causare effetti indiretti alterando proteine livelli. Abbiamo, quindi, sottoposti a screening per mutanti che ha attivato la proteolisi-indipendente modifiche, con l'obiettivo di indagare la funzione del proteasoma su eterocromatina.
Errori PCR può essere applicato a qualsiasi regione del gene regolando la posizione a cui associare il primer. Mutanti che presentano la variazione fenotipica desiderata possono essere identificati con i giornalisti appropriati. Qui, abbiamo utilizzato un reporter ade6 + inserito al centromero 1 esterno ripetere (otr) regione10. Eterocromatina costitutiva è formata a questa regione11, così il ade6 + reporter viene messo a tacere nella condizione di selvaggio-tipo; Questo è indicato da colonie rosse10. Una mutazione che destabilizza l'eterocromatina costitutiva al centromero porterà all'espressione del ade6 + reporter, che è visualizzato come colonie bianchi.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Enzyme reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>For error-prone PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>For general PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen square, black</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>For replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>For replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652086&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>For fusion PCR ramp reaction&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

Mutagenesi casuale di geni bersaglio è comunemente usata per identificare le mutazioni che producono il fenotipo desiderato. Dei metodi che possono essere utilizzati per raggiungere mutagenesi casuale, errori PCR è una strategia conveniente ed efficiente per la generazione di un pool di diverso mutanti (i. e., una libreria mutante). Errori PCR è il metodo di scelta quando un ricercatore cerca di mutare una regione pre-definita, come la regione di codificazione di un gene lasciando inalterato altre regioni genomiche. Dopo la libreria mutante è amplificata dalla PCR errori, deve essere clonato in un plasmide adatto. La dimensione della biblioteca generata da errori PCR è limitata dall'efficienza del passaggio clonazione. Tuttavia, il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, il clonazione passo possa essere sostituito dall'uso di una fusione altamente efficiente One-Step PCR per generare costrutti per la trasformazione. Mutanti di fenotipi desiderati quindi sono selezionabili utilizzando appropriati ai giornalisti. Qui, descriviamo questa strategia in dettaglio, prendendo come esempio, un reporter inserito all'eterocromatina centromerica.

I mutanti di Rpt4 acquisiti seguendo le procedure descritte nella Figura 1 possono essere analizzati valutando i colori delle colonie. I colori delle colonie sono macchiati sulle piastre pertinenti nel fare diminuire il numero delle cellule nella Figura 2. Il reporter ade6 + inserito presso la regione di eterocromatina è messo a tacere nel selvaggio-tipo e Mostra colonie rosse in piastra sì-Ade. Una volta che l'eterocr...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K Views.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Ricerca

Genetica

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologia

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

L&#39;isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Riepilogo

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Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in

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Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Studi genetici di proteine umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine in E. coli

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

L'isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

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