אנו מודים חואן וואסקז על תרומותיו חישובית עם הפרויקט הזה. אנחנו אסירי תודה על התמיכה של וואסר קולג לתואר ראשון מחקר הקיץ המכון (URSI), קרן מחקר לוסי סלמון מיינארד, את ה-NSF פרס מס 1058385

1-C. elegans צמיחה ותחזוקה <ol><li>הכן תרבות נמטודות מנות.
	<ol><li>למלא את צלחות פטרי עם פתרון אגר ולהשאיר להם לגבש, ואז זרע עם תרבות e. coli של OP50 זן 9 , 10-</li>
	</ol></li> <li>להכין אוכלוסייה ההתחלתי של נמטודות למבוגרים על כל צלחת על-ידי העברת מספר תולעים בוגרות טרי מלא אגר צלחות פטרי עם תיקון e. coli. לשמור על התרבויות נמטודות ב 20 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. 
	הערה: ניתן להשיג זנים נמטודות מן המרכז הגנום Caenorhabditis elegans. מחקר זה, הסוג הפרוע, N2, המתח, את OH7547 (otls199 [חתול-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + rol-6(su1006)]) זן, אשר מוצגים הפנוטיפ רולר, נוצלו.</li>
	<li>הפצת תולעים על תרבויות בעתיד.
	<ol><li>להסיר פטרי צלחת המכילה C. elegans, גידול בשימוש פטרי מן החממה טמפרטורה מבוקרת. למקם אותם על הבמה של מיקרוסקופ ויבתר.</li>
		<li>להדליק את מבער בונזן ולחטא האיסוף נמטודות פלטינה על-ידי הצבת המתכת הלהבה עד שזה זוהר אדום. אפשר לבחור להתקרר לטמפרטורת החדר. אל תהרוג את עצמך או תן לבחור לבוא במגע עם מזהמים.</li>
		<li>לגעת בעדינות את קצה האיסוף עד לקצה המעגל של חיידקים. חומר זה הוא דביק, יגרום איסוף נמטודות מבוגרים בודדים קל יותר.</li>
		<li>להעביר עד 4 נמטודות gravid צלחת פטרי תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) מלא אגר, דגירה ב 20 º C. התולעים להטיל ביצים שתתבגרי בעוד ארבעה ימים.</li>
		<li>לחזור נמטודות הנותרים את החממה לאחר המעבר נמטודות למבוגרים ארבע.</li>
	</ol></li></ol> 2. הגדרת אופטי ( איור 1) <ol><li>Secure ההליום-ניאון לייזר בסמוך לפינה השמאלית האחורית של עבודה, שעליו מונחים אופטי וחבר אותו מקור כוח. 
	הערה: הלייזר &#39; קרן s חייב למלא את הדרישות עבור oversampling. C. elegans כ 1 מ מ אורך, לכן קרן הלייזר צריך קוטר גדול מ- 2 מ מ בזמן האירוע על תולעים נימיות, אך יותר מ- 5 מ מ כך תבנית עקיפה לא קשה לאתר.</li>
	<li>מקום דחיסות נייטרלית מסנן בין לייזר הליום-ניאון המדגם כך קרן הלייזר נוסע דרך המסנן לפני שהגיע המדגם.</li>
	<li>שימוש היגוי חזית אלומיניום משטח שתי מראות, לבנות פריסקופ נאבטח את המראה הראשון לאחר המסנן ' דחיסות נייטרלית '. אבטח את המראה השני כ- 10 ס מ מתחת המראה הראשון לתת מרחב כדי לכוון את קרן הלייזר ולהוסיף את cuvette בין המראות. יישר את קרן הלייזר ואת cuvette כך קרן הלייזר אנכית עובר cuvette. 
	הערה: המרחק האורגניזם diffracting פוטודיודה חייב להיות הרבה יותר גדול מאשר האורגניזם עצמו כדי להשיג את שדה רחוק עקיפה. בניסוי זה, המרחק cuvette פוטודיודה הוא 20 ס מ.</li>
	<li>לאבטח את פוטודיודה ישירות מול המראה השני עם חיישן שלה מול המראה. 
	הערה: cuvette המכיל את תולעים נימיות יוצב בין שתי מראות באמצעות מלחציים כימיה. עיין בסעיפים 4 ו-5.</li>
	<li>במקום cuvette מלא מים על הדוכן. להתאים את הגובה של העמדה. להתאים את הגולן ואת זוויות של מראה 1, ראי 2 כך קרן הלייזר עובר cuvette מכוון ליד אבל לא ישירות את פוטודיודה.</li>
	<li>להשתמש רמה כדי להבטיח הטופס דוכני משטח מפולס עבור cuvette. התאם את מראות נוספות במידת הצורך.</li>
	<li>להתחבר פוטודיודה את אוסצילוסקופ דיגיטלית באמצעות כבל ה-USB סיפק את אוסצילוסקופ דיגיטלי. להתחבר למחשב זה ישמש כדי להקליט ולשמור את הנתונים אוסצילוסקופ דיגיטלי.</li>
</ol> 3. אוסצילוסקופ ההתקנה <ol><li>באמצעות התוכנה אוסצילוסקופ במחשב, להגדיר את קצב דגימה לפחות 8 הרץ כדי לפתור את מעגל בהלקאה התולעת מספיק. 
	הערה: בקצב הדגימה צריך להיות יותר מפעמיים התדרים בהלקאה הצפוי של המין כך מתקיים משפט נייקוויסט 11.</li>
</ol> 4. מכין את התולעת ואת Cuvette עבור איסוף נתונים <ol><li>להעביר ארבע נמטודות בוגרים טריים NGM 10 מלא אגר פטרי צלחת באמצעות איסוף חוט דק, שעברו שיטוח פלטינה (ראה סעיף 1.3).</li>
	<li>אחד cuvette פלסטיק חד פעמיות להסיר את החבילה שלו, נזהר רק לגעת את cuvette על הדפנות מחורץ.</li>
	<li>שימוש micropipette כדי פיפטה מים מזוקקים לתוך cuvette עד cuvette כ-80% מלא עם מים מזוקקים. 
	הערה: חשוב רק מים מזוקקים או מאגרי מיונן כגון M9 10 או באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) בעת טיפול של נמטודות, כמו מי ברז מכיל תרכובות מיקרואורגניזם-הרג.</li>
	<li>למקם את צלחת פטרי המכילות את C. elegans כדי לשמש תחת טווח ויבתר.</li>
	<li>משתמש האיסוף פלטינה, הסר אחד בוגר C. elegans הפטרי ויציפו האיסוף לתוך cuvette, נעים האיסוף במעגלים במידת הצורך לנתק את תולעים נימיות.</li>
	<li>כדי למנוע בועות ב cuvette, למלא את cuvette עם מים עד שהוא מתנפח מעט מעל cuvette &#39; s העליון. למלא את cuvette &#39; s כובע לחלוטין עם מים ואז שמים במהירות את הכובע על גבי cuvette.</li>
	<li>להשתמש מטלית ניקוי אופטי כדי להסיר טיפות מים זה ייתכן שפכתי מעל ואופטית ניקוי נייר לניקוי כל תרסיס הנותרים.</li>
</ol> 5. נתונים בזמן אמת-רכישת עקיפה דפוס עוצמת השינויים <ol><li>להפעיל ההליום-ניאון לייזר ולהתאים את הגדרת תדירות/צבע כך שהוא מייצר קרן אדומה. הפעל את החיישן. 
	התראה: השתמש קרן אנרגיה נמוכה ב- 632 nm, כמו C. elegans להימנע אור בתדירות גבוהה (כחול) 12-</li>
	<li>אתר התולעת cuvette. מחזיק את cuvette על הדפנות מחורץ, להטות בעדינות את cuvette עד תולעים נימיות במרכז החלק של cuvette. 
	הערה: טלטולים או הטיה של cuvette באלימות גורמת התולעת להתנגש עם קירות cuvette. זה עלול לגרום נזק של תולעים נימיות.
	<ol><li>מקום cuvette על גבי המעמד במערכת אופטית, מרכוז התולעת בתוך הלייזר &#39; קרן s שמשתקף במראה 1 2 מראה. כדי לסלק אור תועה.</li>
	</ol></li> <li>מרכז התולעת בתוך קרן הלייזר.
	<ol><li>המקום את פוטודיודה בדוגמת המילוי עקיפה, כך שמיקום פוטודיודה, המרבי המרכזי של התבנית עקיפה אינם מתנגשים.</li>
		<li>להתאים את המסנן ' דחיסות נייטרלית ' למניעת רוויה של פוטודיודה. סיבוב ההגה מסנן ' דחיסות נייטרלית ' מווסת את עוצמת האור.
		<ol><li>סובב דחיסות נייטרלית מסנן כך מגביר המתח כפלט את פוטודיודה. 
			הערה: הפלט מתח הוא ציין באמצעות התוכנה פוטודיודה דיגיטלי. רווי פוטודיודה אם המתח אינו משתנה. במקרה הזה, סובב את המסנן ' דחיסות נייטרלית ' עד המתח מקטינה ללא משתטח על קריאה מינימלי. ודא כי האות מתח לא לרדד על הקריאות שיא, המציינת את הרוויה של פוטודיודה. להפחית את עוצמת האור על ידי סיבוב הגלגל מסנן ' דחיסות נייטרלית ' אם רוויה נצפית.</li>
		</ol></li> <li>, ברגע הדפוס עקיפה נע הוא גלוי, לאסוף נתונים עם פוטודיודה על-ידי לחיצה על לחצן התחל על תוכנת שליטה אוסצילוסקופ תוך מעקב אחר התולעת &#39; s תנועה. להמשיך לקחת מידות עד התולעת עובר קרן הלייזר וגם את diffracדפוס tion נעלמת, אשר בדרך כלל לוקח בערך 20 s.
		תהליך <ol><li>לעצור איסוף הנתונים על-ידי לחיצה על לחצן עצור על התוכנה עבור אוסצילוסקופ. לשמור בכל ניסוי &#39; s נתונים בתבנית. csv או. txt.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>חזור על השלבים 5.2-5.3 עד לפחות 50 ערכות נתונים שנגבה עבור כל פנוטיפ. להשתמש בבעלי חיים 8-10 לכל משפט.</li>
	<li>אם cuvette הוא נשרט השלך אותה תולעת לבין חזור על שלב 4. אם התולעת ייפגע במהלך המעבר, להיפטר ממנו ולא לשטוף את cuvette עם מים מזוקקים לפני חוזר בשלב 4 באמצעות cuvette אותו את.</li>
	<li>חזור על שלב 5 באמצעות OH7547 את &#34; רולר &#34; זן, וישתדלו תווית הנתונים כדי לציין את המתח תולעת.</li>
</ol> 6. ספקטרום פורייה של נתונים <ol><li>לייבא את הנתונים רכשה לתוך תוכנית ניתוח נתונים יכולים לבצע המרות פורייה דיסקרטית 3.</li>
	<li>פורייה לבצע המרות על כל ערכת נתונים באמצעות האפשרות שינוי צורה (FFT) פורייה מהירה של התוכנה-</li>
	<li>ממוצע התדרים מתוצאות FFT עבור כל משרעת עבור סוג הפרוע N2 תולעים.</li>
	<li>חזור על שלב 6.3 משתמש את FFTs של OH7547 &#34; רולר &#34; תולעים.</li>
</ol> 7. מידול של הספקטרום פורייה <ol><li>תוכנית מודל בינארי של תולעים נימיות גפיים (ראה כללה את החומרים משלימה). 
	הערה: מודל זה היא הערכה קשה, אשר מציג לראשונה את המאפיינים הבולטים של תולעת תנועה. המודל יכול להיות מעודנות כפי התוצאות מושווים עם תולעים בפועל. צורות תולעת הם הערכות באמצעות מיקרוסקופ תמונות 13.
	<ol><li>יצירת מסגרות רציפים של המודל הבינארי עוברים דרך תולעת לפחות שני מחזורים ( איור 2 א). לראות קטעי וידאו בהחומרים משלימה; התולעת C וידאו (CWorm.avi) ווידאו תולעת W (WWorm.avi).</li>
	</ol></li> <li>לייצר תבניות עקיפה רציפים. לראות קטעי וידאו בתוספת חומרים. הסרטונים עקיפה התולעת C (CWormDiff.avi) ווידאו תולעת W (WWormDiff.avi).
	<ol><li>התמרת פורייה בכל מסגרת בינארי של התמונה תולעת. גדול יותר הריפוד של המסגרת סביב התולעת, טוב יותר הרזולוציה של התמונה עקיפה יהיה. 
		הערה: הערך המוחלט של כל אחת מהמסגרות טרנספורמציה פורייה הוא יחסי התבנית המתאימה עקיפה ( איור 2b).</li>
		<li>לכוון את החדות של התבנית עקיפה על-ידי מיפוי עוצמות של התבנית עקיפה לקנה מידה לוגריתמי. 
		הערה: מצלמות ועיניים נוטים לפעול בקנה מידה שאינו ליניארי. מידה לוגריתמי ניתן לדמות כיצד תבנית עקיפה נתפסת בדרך כלל על ידי עין אנושית.</li>
	</ol></li> <li>לחלץ את האות עקיפה מעוצבת.
	<ol><li>לבחור על מיקום מחוץ למרכז המתאים למיקום של פוטודיודה בדוגמת המילוי עקיפה.</li>
		<li>להוסיף האלמנטים מטריצת שכנות המקיפים את המיקום של פוטודיודה כדי לדמות את גודל פוטודיודה. הגודל של פוטודיודה הוא בדרך כלל 0.1% של התבנית עקיפה modeled.</li>
		<li>שיא עלילה הרצף על המשמעות של עקיפה אותות. בדוק האות באופן פיזי סביר (כלומר, במקרה של העמסה מחזורית, האיתות פוטודיודה צריך להיות תקופתי גם).</li>
	</ol></li> <li>פורייה לשנות את האות עקיפה שהושג ב- 7.3 ולהשוות את התוצאות עם נתונים ניסיוני.</li>
	<li>חוזר עבור זנים שונים של תולעת ולהשוות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Magnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction.">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering. , (1995).</li><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+A+revolution+in+structural+biology.">Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li><li>Thibault, P., Rankenburg, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+diffraction+microscopy+in+a+teaching+laboratory.">Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory.</a> Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).</li><li>Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+retrieval+of+diffraction+patterns+from+non+crystalline+samples+using+the+oversampling+method.">Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method.</a> Phys. Rev. B. 67, 174104 (2003).</li><li>Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+eliminating+zero-order+diffraction+in+lensless+Fourier+transform+digital+holography.">Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography.</a> Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).</li><li>Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Dasalukunte, D., &#214;wall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon. , (2014).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), e198 (2008).</li><li>Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+Locomotion+in+Confined+and+Unconfined+Fluids.">Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids.</a> Phys. Fluids. 25, 081902 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כולל מתיחות של נתונים עם חוסר פעילות להטות את התוצאות מאז מלאכותי תדרים נמוכים ייכללו בממוצע לתוך התוצאות. קולח פוטודיודה ניתן לזהות על ידי פסגות שטוח או 'נכרת' פסגות ההרים הנתונים הגולמיים. חילוק כל ערכת נתונים גולמיים בעוצמות שיא יעזור עם להתווכח על תנודות בעוצמת לייזר.
התדרים שיא הן אינדיקטור של הכולל ומתפתלת תדירות; עם זאת, תנועה מורכבת גורם הפרעות בתדרים היכו תבנית עקיפה, עליך להיבדק בקפידה.
בשיטה זו ניתן לחקור את ומכניקה של נמטודות אחרים. ניתן לשנות את הסביבה באמצעי אחר. אורכי גל עשוי להשתנות גם כן. עובד בטווח הנראה של הספקטרום האלקטרומגנטי הוא הקלה והבטוחה.
מודל מעודנת יותר יחקה ספקטרום עקיפה יותר מציאותי בעתיד. דוגמנית בעתיד עשויים לכלול תולעת שיכולים לשנות כיוונים, אשר לא ישפיע על מיקומים תדירות אבל השיא היחסי הגולן. מודל מציאותי יותר יאפשר עבור התפלגות הסתברותית בהלקאה תדרים, אשר ירחיב את הפסגות כמו המידע מהניסוי. בכפולה בתדרים היה חשבון וריאציות בתדרים thrashing.
הצורה תולעת הנוכחית היא גסה, במיוחד באזור ראש ולא זנב, שאמור להיות מחודדות יותר מאשר במודל הנוכחי. זה עשוי להיות מעניין לערוך ניתוח מפורט של סדרת הזמן של האות מאז זה יכול לתת רמזים על המורכבות של גפיים במוטציות שונות.
. זה שווה לשקול את המעשיות של הרחבת טכניקה זו אל תוך אפיון נמטודות מרובים בו-זמנית. חשוב להבין שיטה זו כשיטת משלימה לשיטות הקיימות באמצעות מיקרוסקופים מסורתיים. בשיטה זו יש יתרון ב לא דורש מיקרוסקופ במהלך רכישת הנתונים כך התולעת עשויים לנוע מהמטוס מוקד. ספקטרום תדירות בממוצע להראות הבדלים ברורים בתנועה תולעת ולא ניתן לכמת באמצעות הפסגות תדירות שכיחה, שיטה ב לכימות תולעת ומכניקה. ניתוח נתונים החתימות עקיפה נמצא להמשך פיתוח, בתקווה יוביל תהליך זיהוי אוטומטי של מספר מוטציות ויחידים.

שיטה זו משווה ניסיוני ותדירות modeled ספקטרה ומכניקה של C. elegans באמצעות שני זנים עם דפוסים שונים מאוד locomotory. התוצאות מציגות כי ספקטרום תדירות תלויה טמפורלית שינויים כמו תולעים נימיות שוחה בעמודת המים כך ברור מיקרוסקופיים תמונות לא נחוצים לצורך ניתוח. שיטה זו מאפשרת לניתוח כמותי בזמן אמת, מספק מידע משלים תמונות/סרטונים שהושג עם מיקרוסקופים מסורתיים. עקיפת פראונהופר, הנקראים גם שדות רחוק עקיפה, מספק את הבסיס עבור קבלת עקיפה בשידור חי-נתונים-1,-2. עוצמת האור בכל נקודה בודדת בתבנית עקיפה היא התוצאה של superimposing אור מכל נקודה בחלוקה לרמות של נמטודות3. כתוצאה מכך, עוצמת האור שנאספו לאורך זמן נושאת מידע אודות ומכניקה תולעים נימיות. ניתוח האות עקיפה תלויי-זמן יכול לזהות את התנועה האופייניות של המוטציה המתאימים מאז ניתוח כל התדרים מעורב גפיים משלים ניתוח וידאו מסורתיים. במקרה זה, ההבדלים האופיינית של גפיים של "רולר" לבין פראי סוג C. elegans מאושרות על-ידי השוואת ספקטרום תדירות של שני זנים שונים של תולעים נימיות.
כמה מאפיינים הקודם אושרו באמצעות ניתוח תדירות של עקיפה אותות כמו שחייה תדרים2,4. וחשוב מכך, שיטה זו יכול לשמש כשיטה המשלימה כדי מיקרוסקופ מסורתי להתבונן גפיים בזמן אמת על גבי מסך מחשב כמו הנתונים הנאספות. ניתן לכמת את ספקטרום תדירות של תולעים עם דפוסים ברורים locomotory על ידי שוקל שפורייה הפך אות לאות עקיפה.
מהות רב תחומיים מבוססי פורייה עקיפה בעבודה זו כרוכה בתחומי ביולוגיה ופיזיקה. עקיפה על ידי תחת דגימה שימש זמן לחקור מבנים קריסטל ביולוגיה5 ושדות אחרים. בניסוי זה, עם זאת, oversampling6,7 יוצר התבנית שדה רחוק עקיפה כך האורגניזם ממורכזת בתוך הקרן. Oversampling משמשת בדרך כלל עבור הדמיה עדשה-פחות8 בשילוב עם אלגוריתם אחזור שלב משחזר תמונה של האובייקט המקורי. אחזור שלב קשה להשיג כאשר קיימות scatterers כמו במקרה תולעים נימיות. החתימה עקיפה טמפורלית מספיקה כדי להעריך את התדרים מפתח של התנועה תולעת. שיטה זו נמצאת פחות שהמפתחות מפרכת, מספק דרך אופטי לכמת ומכניקה. טכניקה זו יכול בקלות להיות מותאם לניתוח של מוטציות או תנאים סביבתיים לשנות התנהגות.

<table><tbody><tr><td>Tunable Helium-Neon laser</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Front Surface Aluminum Mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode: SI Amplified Detector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA 100A</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Cuvette</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td>Plastic cells may be used as well.</td></tr><tr><td>MatLab (Software)</td><td>MathWorks</td><td>R2016b (9.1.0.441655)</td><td>Use the fft command to simulate diffraction</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>14.7.1</td><td>Used for data analysis of Figure 4</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; Roller</td><td>&lt;em&gt;University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)&lt;/em&gt;</td><td>Strain: OH7547&lt;br/&gt; Genotype: otIs199.</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; Wild Type</td><td>&lt;em&gt;University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)&lt;/em&gt;</td><td>Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr></tbody></table>

fourier-based diffraction analysis of live caenorhabditis elegans

כתב יד זה מתאר כיצד לסווג נמטודות השימוש בחתימות עקיפה שדה רחוק טמפורלית. . יחיד C. elegans מושהה בעמודת המים בתוך cuvette אופטי. Nm 632 לייזר מתמשך wave הנה מכוונת דרך cuvette באמצעות מראות המשטח הקדמי. מרחק משמעותי של 20-30 ס מ לפחות נסע אחרי האור עובר דרך cuvette מבטיחה תבנית עקיפה שימושי רחוק-שדה (פראונהופר). השינויים תבנית עקיפה בזמן אמת כמו תולעים נימיות שוחה בתוך קרן הלייזר. פוטודיודה ממוקם מחוץ למרכז התבנית עקיפה. האיתות מתח פוטודיודה נצפית בזמן אמת והקליט באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי. תהליך זה חוזר על עצמו עבור סוג הפרוע 139 ו- 108 "רולר" C. elegans. תולעים פראי סוג התערוכה דפוס תנודה מהירה בפתרון. התולעים "רולר" יש מוטציה במרכיב מרכזי של הקוטיקולה המפריע ומכניקה חלקה. מרווחי זמן לא חופשיים הרוויה ואת חוסר פעילות מתבטלים. זה מעשי לחלק כל ממוצע ב- המקסימאלית שלה כדי להשוות עוצמות היחסי. האות עבור כל תולעת היא שפורייה הפך כך התבנית תדירות עבור כל תולעת מתגלה. האות עבור כל סוג של תולעת הוא בממוצע. ספקטרום פורייה בממוצע עבור הסוג פרא ו- "רולר" C. elegans שונה במובהק, לחשוף את הצורות תולעת דינמי של זנים שונים תולעת שני ניתן להבחין באמצעות אנליזת פורייה. ספקטרום פורייה של כל זן תולעת תואם דגם משוער באמצעות שתי צורות תולעת בינאריים שונים התואמים רגעים locomotory. המעטפה של ההתפלגות תדירות בממוצע עבור תולעים בפועל, מעוצבת מאשר שהמודל תואם את הנתונים... בשיטה זו יכול לשמש בסיס עבור אנליזת פורייה עבור מינים רבים מיקרוסקופיים, כמו כל מיקרואורגניזם יש ספקטרום פורייה הייחודי שלה.

הגדרת הניסוי אופטי המוצג באיור 1 מאפשר חקר מיקרואורגניזמים מבלי להיות קשור למישור מוקד. האיתות בהלקאה פוטודיודה ניתן לצפות בזמן אמת על גבי מסך המחשב כמו איסוף הנתונים. דפוסי לא רגיל יהיה גלוי באופן מיידי ללא צורך לנתח וידאו בפירוט.
דוגמאות תולעת רציפים modeled התנועה ואת עקיפה המתאימים דפוסי מוצגים באיור2. הדפוסים עקיפה מעוצבת איכותית דומים. הדפוסים ניסיוני1 ומהווים אינדיקציה ראשונית הסימולציות בהצלחה מודל של תולעים נימיות.
חתימה עקיפה זמני דגימה של שני הסוגים של C. elegans למד פה מוצג באיור3. ניתן לראות איכותית כל תולעים נימיות מפרפרת תעריפים שונים, amplitudes. חלק מההבדלים ניתן לכמת דרך עקומה פולינומיאלית כפי שנעשה ב- הפרסום הקודם1. התמרת פורייה בדידה, חושפת פרטים נוספים בנוגע תדרים מוטבע:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq1.jpg">, (1)
כאשר Fk הוא התמרת פורייה דיגיטלי (רגל) ו- fn הוא האות עקיפה raw תלויי-זמן עם הזמן דיסקרטית משתנה n משתנה תדירות דיסקרטית ק' N הוא המספר הכולל של נקודות נתונים. התמרת פורייה דיגיטלית ממוצעת מאפשר תולעים נימיות להיות מזוהה על ידי משרעת ספקטרום תדירות שלה עקיפה (איור 4). הקשת פראי סוג נשלטת על ידי תדרים נמוכים יותר מאשר הספקטרום תנועה רולר.
מודל המעריכה את סוג בר נגד ההערות C. elegans רולר לסוג הפראי נוטה ת'ראש בתנועה (W או S shape) wavelike (איור 2 א) בזמן רולר נוטה נותן העדפה לצד אחד הדומה בערך צורה C נדנוד ( איור 5). זה מציע הסבר על ספקטרום שונה. רולר בעיקר יהוו את כנסיי לצד אחד, בזמן תנודה W יכולים להיחשב שניים מנוגדות C תנועות. מסיבה זו, W. ההצעה מורכבת יותר חושפני יותר משני תדרים נמוכים מ- C. ההצעה. תוצאה זו הוא אישר במודל חישובית. הצורה W יש הרבה צפיפות גבוהה יותר תדירות מאשר הצורה C (איור 6). זה אושר ב FFT איור 4 איפה התדרים רולר מקובצים יותר בזמן לא דיסקרטית לחלוטין. הסטטיסטיקה של ה roller מוטים מאז רולר ניתן לחזור פראי סוג גפיים באופן זמני.
ספקטרום יישר כוח מסוג רולר C. elegans מראה רחב לשיא ב ~1.5 הרץ, בזמן שחייה פראי סוג C. elegans תערוכות קשת עם מודאלים מרובים (כולל פסגות ~1.0 הרץ, הרץ 1.75). פוטודיודה (PD) יש גודל סופי שמתפשטת במספר אלמנטים מטריקס. מטריקס בודדים רכיבים או נקודות על התבנית עקיפה משתנים בעוצמתם מאז התאבכות בונה והרסני משתנים; ובכל זאת, התדרים שבו משתנים עוצמות זהים עבור כל רכיבי מטריקס, כפי שניתן לראות באיור7. בהתחשב הנגזרת זמן 1 הציוד, זה ניתן לראות כי תדירות תנודות לא לסמוך על המטריקס שלב, אלא רק על התנודות של האובייקט המקורי:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq2.jpg">, (2).
כמו המשטרה מתפשט על פני מספר רכיבי מטריקס, מיקומי שיא ממוצע לפרופיל תדירות עקבית. גיוון צפויים, יכול לתת רמזים על הכיוון של התולעת. התפלגות השכיחויות ישתנה כמו דהירה של השינויים תולעת. המודל הנוכחי הוא מודל פשוט המאפשר רק על ההערכה של מיקומי שיא יותר מאשר הגולן השיא היחסי. דפוסים שונים locomotory יהיה בממוצע למיקומים שונים שיא.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig1.jpg"> 
איור 1. הגדרת הניסוי. מסעותיו קרן לייזר צריכת חשמל נמוכה דרך המסנן דחיסות נייטרלית, משתקפת במראה M1 למטה דרך cuvette המכיל את התולעת על גבי המראה M2, נוסע לכיוון פוטודיודה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig2.jpg"> 
באיור 2. תולעת רציפים צורות ותבניות עקיפה המתאים. () יש לבחור תמונות בינאריות רציפים של נמטודות צורה מעוצבת של W ואת הדפוסים עקיפה רציפים (b) המתאימים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig3.jpg"> 
איור 3. מדגם ניסיוני עקיפה חתימות. עקיפה חתימות שנאספו () OH7547 "הרים" ו- (b) N2 הפרוע סוג C. elegans בעזרת פוטודיודה יחיד בדוגמת המילוי עקיפה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig4.jpg"> 
באיור 4. ניסיוני בממוצע כוח ספקטרום של רולר וסדרות עקיפה פראי סוג פראונהופר. המופע ספקטרום התדרים המצויים בממוצע התמרת פורייה של סדרת הזמן הקליט עם פוטודיודה. מסנן גאוסיאני של סטיית תקן הרץ 0.075 ק, נחתך ב 3 סטיות תקן, משמשת לאיזון. שימו לב הפסגה ספקטרלי רחב-~1.5 הרץ בספקטרום רולר מוחלקים, לעומת הקשת עם מודאלים מרובים מוחלקים פראי סוג (כולל פסגות-~1.0 ו- 1.75 Hz). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig5.jpg"> 
איור 5. איור צורה עקיפה. תבניות עקיפה שניתן למדל באמצעות חשיבה של כל מקטע קו כמו קו ישר אינפיניטסימלי קטן (משמאל). Superimposing את השורות האלה (מימין) מדגים את בניית תבניות עקיפה רחוק-שדה שנוצר על ידי סי בצורת תולעים נימיות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig6.jpg"> 
איור 6. מדומה כוח ספקטרום של רולר וסדרות עקיפה פראי סוג פראונהופר. () C צורה ו- (b) W צורה תולעים עם פוטודיודה מרוכז בכל האלמנטים מטריקס 200 (אנכי) של 175 (אופקי). הצורה W מראה צפיפות גבוהה יותר של תדרים עקב גפיים מורכבים יותר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig7.jpg"> 
איור 7. מדומה כוח ספקטרום של רולר וסדרות פראי סוג פראונהופר עקיפה במיקומים שונים פוטודיודה. תולעת () W-צורה, התולעת צורה (b) C עבור רכיבי מטריקס יחיד במקומות שונים להדמיית במקומות שונים של פוטודיודה. פסגת הגולן להשתנות עבור מיקומים שונים; עם זאת, מיקומי שיא נותר ללא שינוי עבור צורות ספציפיות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

כתב יד זה מתאר כיצד להבחין בין נמטודות שונים באמצעות שדה רחוק עקיפה חתימות. אנו משווים את ומכניקה של 139 108 "רולר" C. elegans וסוג הפרוע מאת ממוצע של תדרים המשוייך לחתימה עקיפה פראונהופר טמפורלית במקום אחד באמצעות לייזר מתמשך wave.

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

fourier-based-diffraction-analysis-of-live-caenorhabditis-elegans

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Engineering

Unit 1

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Fourier Series

SCIENTISTS IN ACTION

7.9K Views.  Vassar College. כתב יד זה מתאר כיצד להבחין בין נמטודות שונים באמצעות שדה רחוק עקיפה חתימות. אנו משווים את ומכניקה של 139 108 "רולר" C. elegans וסוג הפרוע מאת ממוצע של תדרים המשוייך לחתימה עקיפה פראונהופר טמפורלית במקום אחד באמצעות לייזר מתמשך wave.

Video: Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Bioengineering

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Developmental Biology

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Behavior

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Neuroscience

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אחת אורך גל צל הדמיה של

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם