המערכת שלנו מאפשרת לחוקרים לעורר תנודות לא מקומיות עם תכונות מבוקרות היטב בתזוזה לא מדורגת ולכמת את זרם הסידן במהלך התגובות של הגורמים המגרים לתנודות. כיתרון העיקרי של טכניקה זו, אנו יכולים לחקור באופן לא פולשני את המנגנונים העצביים, העומדים בבסיס מנגנוני ההתנהגות. הכינו מדיום גדילה חדש של נמטודה או צלחת NGM שעליה Escherichia coli OP50 מפוספס בתבנית מרובעת באמצעות מפיץ תאים, כך שהתולעת מבלה את רוב הזמן בחיידק במהלך הדמיית סידן.
ארבעה ימים לפני ניסוי הדמיית סידן, העבירו שתי תולעי ST12 בוגרות לצלחת, והניחו את הצלחת באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים. בצע הדמיית סידן באמצעות מיקרוסקופ המצויד במכשיר מתמר אקוסטי לגירוי, עדשת מטרה 2x, מצלמת CMOS במהירות גבוהה, אופטיקה מפצלת תמונה. הפעל את המחשב המדויק בבקר הבמה הממונעת X Y.
לאחר מכן הפעילו את המגבר והגדירו את מתאם עוצמת הקול ל-10 בבסיס ואת כוונוני הטרבל לשמונה. כדי לעורר GCaMP ולתייג RFP, הפעל את אורות ה-488 וה-560 ננומטר של מקור תאורת ה-LED. הגדר את המדדים של 470 ו-550 ננומטר של תרמיל הבקרה במקור האור ל-5% כך שעוצמת אור ה-LED תתאים להדמיה.
הורד והתקן את חבילות התוכנה והחלונות הבאים. תוכנת מאקרו של עכבר, תוכנה לבקרת רעידות, תוכנה למעקב רץ ותוכנה לניתוח נתונים. לחץ פעמיים על קובץ תוכנת המעקב, ולאחר מכן הגדר את זמן החשיפה ל- 0.033 שניות, ותחבר לשניים על שניים כדי להבטיח רכישת תמונה חלקה.
לחץ על לחצן ההפעלה והמתן חמש דקות כדי לייצב את התוכנה. הזן את המידע לרכישת תמונה. לדוגמה, כדי להקליט 500 תמונות ללא מרווח, הזן 500 בתיבה הכוללת של התמונות, 500 בתיבת התמונות ואפס בתיבה מרווחים.
לאחר הפעלת כפתור הרכישה, פיצלו את התמונה הפלואורסצנטית באמצעות אופטיקת פיצול תמונה, תוך הקרנת ערוץ GCaMP ותייגו את ערוץ RFP על שני חצאים של מצלמת CMOS. כייל את הקואורדינטות של ערוצי GCaMP ו- Tag RFP ושמור את ההגדרות. לאחר מכן הגדר את הספריה כדי להפיק את קובץ הנתונים וכבה את הרכישה.
קרא את הבדיקה. קובץ טקסט עם מערכת המאקרו של העכבר כך שסמן העכבר נשלט על סמך הקואורדינטות ולוח הזמנים בקובץ זה ולחיצה כפולה על קובץ התוכנה לבקרת רטט. הגדר את הקואורדינטות של סמן העכבר בזמן המתנה עד לגירוי לאחר תחילת ההקלטה, ולאחר מכן הגדר את ערכי התדר ואת ערכי המשרעת בתוכנה לבקרת רטט.
העבר תולעת בודדת המבטאת גם GCaMP וגם תג RFP מהצלחת המדגרת לצלחת NGM טרייה שבה E coli OP50 כבר פסים. חברו את לוחית ה-NGM למתמר האקוסטי באמצעות סרט הדבקה שקוף. להדמיית סידן, הפעילו את כפתור הרכישה ומצאו את התולעת בהגדלה של פי 2.5.
הגדר את שדה הראייה כ- 1.1 על 1.1 מילימטר ברזולוציה של 2.6 מיקרון לפיקסל. כבה את האור הבהיר ולחץ על כפתור הביות כדי לעקוב אחר הנקודה הפלואורסצנטית של תולעת, אשר יוזמת את התנועה של שלב X Y כדי לשמור על אזור העוצמה המרבית של התולעת באמצע שדה הראייה בתמונת התג RFP. ודא שערכי העוצמה הם כ- 1000.
אם לא, כוונן את המדדים 470 ו-550 ננומטר של תרמיל הבקרה במקור האור. לחץ על לחצן ההפעלה במערכת המאקרו של העכבר כדי לאפשר שליטה בסמן העכבר, וודא שקובץ BMP הפלט נוצר כראוי. לניתוח נתונים, צור תיקייה בשולחן העבודה וקרא לה סידן הדמיה", ולאחר מכן צור תיקיה בתוך התיקיה Calcium Imaging וקרא לה תוצאת CI עבור קבצי תוצאות הפלט.
לחץ פעמיים על הדמיית התצוגה הכפולה. קובץ MB שנכתב בתוכנת ניתוח הנתונים, והוסף את נתיבי הקבצים לתיקיית התוצאות CI בתיקיה עם קובץ BMP. לחץ על מקשי ההזזה והחזיר בו-זמנית כדי להתחיל ניתוח אוטומטי, המשתמש בערך של אזור בעוצמה מרבית בתמונת התג RFP.
לבסוף, בדוק אם קבצי הפלט נוצרים כראוי בתיקיית התוצאות CI. בניתוח הייצוגי, נתוני ערוץ GCaMP ו- RFP התג התקבלו כסדרה של תמונות. תזוזה של צלחת הפטרי המושרה על ידי מערכת רטט לא מקומית כומתה גם היא.
ניתן לשלוט בתזוזה על ידי הגדרת ערך המשרעת בתוכנה לבקרת רעידות, ומתאם עוצמת הקול והמגבר. ואילו ניתן לווסת את התדר על ידי הגדרת ערך התדר בתוכנה. תגובת סידן חולפת של נוירוני AVA נצפתה עם גירוי עם תנודות בעלות תדר של 630 הרץ ותזוזה של כ-4.5 מיקרומטר לשנייה, מה שמצביע על כך שהנוירון Ava הופעל במהלך התגובה לאחור של התולעת לגירוי הלא מקומי.
בהליך שלנו, אנו יכולים לכמת רק נוירון אחד. עם זאת, ניתן לשלב מערכת זו גם עם שיטת הדמיה ביומטרית כדי לכמת באופן לא פולשני נוירונים מרובים או אפילו את המוח כולו.
