על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.

1. חומר צמחי
<ol><li>הבחירה של מיני צמחים</li>
	<li>השתמש המין צמח ילידי החלבון של עניין, דהיינו, אחד אשר מקודד חלבון זה חלבונים אנדוגני, או המייצג המארחת הטבעי של המחלה חלבונים נגיפיים. בנוסף, המין הצמח הנבחר חייב להיות נוטה? בשיטה של שינוי גנטי ארעית. הערה: המחקרים באופן שגרתי להעסיק טבק benthamiana, אשר מייצג מארח טוב עבור TMV, עובר טרנספורמציה ביעילות על ידי טכניקת בתיווך Agrobacterium שינוי גנטי, קרי, agroinfiltration (ראה שלב 3). צמחים benthamiana (ש ע) גם הם מגדלים בקלות, יש עלים גדולים, מחוסן בקלות על-ידי Agrobacterium ומותאמים בקלות נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.</li>
	<li>
צימוח
	<ol>
<li>צמח benthamiana (ש ע) זרעים באדמה רטובה-צפיפות גבוהה. לשמור אותם בתוך תא בסביבה מבוקרת הלעפה תרוטרפמט 20-25 מתחת לגיל 16 h של אור ~ 75 µmol פוטונים ז-2 s-1 ו- 8 שעות החושך. לאחר הקוטר של euphyll מגיע ל- 0.5 ס מ, בזהירות להעביר את השתילים סירים גדולים והמשך הצמיחה בבית הבליעה אותה תחת באותם התנאים.</li>
		<li>לשמור על הצמחים עד שהם גדלים לשלב 4-8-עלה תוך 4 שבועות כאשר העלים הגדולים הם 4-6 ס מ קוטר; בשלב זה, הם יכולים לשמש עבור agroinfiltration (ראה שלב 3). הערה: חשוב, אף פעם לא השתמש הצמחים אם הם החלו פרח, כי בשלב התפתחותי זה, הארכיטקטורה עלה משתנה לעיתים קרובות24,25, שמוביל לפעמים תוצאות לא עקביות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הביטוי וקטור בנייה
<ol><li>
בחירה של מערכת ביטוי
	<ol>
<li>לבחור את הביטוי מערכת, קרי, וקטורים ו וקטור משלוח השיטה, המיטביות עבור ביטוי של החלבון עניין במין הצמח למד. הערה: לעיתים, כזה שילובים מסוימים של מיני נבדק חלבון/צמחים עשויים לדרוש וקטורים ספציפיים, וקטור שיטת מסירה עבור הביטוי מיטביים ותפקוד של החלבון עניין. לצמחים dicotyledonous ביותר, עם זאת, בחר פלסמידים בינאריים כמו הביטוי וקטורים ו agroinfiltration כמערכת משלוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תיוג פלורסנט חלבון
	<ol>
<li>Fluorescently לתייג כל חלבון ביטוי לניתוח של הפצה subcellular22, לרבות משטרת לוקליזציה. הערה: מעסיקים חלבונים autofluorescent, כגון CFP ו- DsRed2, כמו תגיות. תג החלבון שנבדקו עם CFP, coexpress זה עם DsRed2 חינם. פונקציות CFP כתג והן בתור מולקולה לא קשור וירוס מטענים. DsRed2 פונקציות כדי לכייל את היעילות הכוללת של הביטוי ארעי, ובגלל זה תא-אוטונומי, כדי לזהות את התא טרנספורמציה בתחילה; פונקציה זו האחרון חשוב בעת הערכת תנועה לתא של חלבונים שנבדקו שעשויות להיות הלא-תא-אוטונומי. עבור coexpression עם הסמן משטרת PDCB1, אשר גם הוא התא-אוטונומי, לתייג את החלבון שנבדקו עם CFP, PDCB1 עם DsRed2.</li>
		<li>כלל אצבע, הפתיל תג autofluorescent carboxyl-הסופית של החלבון ביטוי. עם זאת, אם המוצגים מתויג באורך מלא חלבונים נבדק נחשף Pd מיקוד, העברת התג אמינו-הסופית של החלבון.</li>
		<li>לשכפל את רצפי קידוד של החלבונים להיבדק לתוך וקטור הביטוי צמח מתאים. הערה: ישנם רבים וקטורים הביטוי צמח שונות המאפשרות תיוג פלורסנט. אנו משתמשים סדרה של קדם-פסיכומטרי פלסמידים26 או חלק שלהם נגזרים27,28, אשר מתאימים עבור שכפול של הרצף של עניין ישירות מסגרת עם התגים autofluorescent המוצע (ראה שלב 2.2.1) בשני אמינו- ו carboxyl-מסוף כיוונים.</li>
		<li>להעביר קלטת ביטוי לכל וקטור Agrobacterium בינארי. הערה: למרות בונה מבוסס-קדם-פסיכומטרי מתאימים למשלוח biolistic ישירה לרקמות הצמח, agroinfiltration, אשר היא השיטה השינוי המומלץ כאן (ראה שלב 3), מחייב הקלטת ביטוי כדי להיות ממוקם בין T-DNA גבולותיה של קובץ בינארי וקטור29. הערה: כל כיווני קדם-פסיכומטרי נועדו לאפשר העברת כזו26,30 וקטור בינארי ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים pPZP-RCS2 על-ידי צעד אחר צעד שיבוט באמצעות חיתוך נדיר nucleases AscI-PpoI, -SceI,. CeuI, פאי-PspI ו- PI-TliI 26. חוקרים שמעדיפים לנצל שיבוט recombinatorial, למשל, באמצעות אתרי heterologous לקס 31, יכול להעסיק קדם-פסיכומטרי וקטור משתנים26,27.</li>
		<li>עבור coexpression, העברת קלטות ביטוי הן, למשל, נבדק חלבון-CFP, DsRed2 או חלבון שנבדקו-CFP, PDCB1-DsRed2 (ראה צעד 2.1), כדי הווקטור בינארי זהה pPZP-RCS2. הערה: לחלופין, תרבויות Agrobacterium מחסה מבנים בינאריים בודדים ניתן לערבב ביחד חדירה לתוך benthamiana ש (ראה צעד 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
להוסיף 1 µg של פלסמיד pPZP-RCS2 מבוססי מתרבות 2.2.5 ל- 100 µL שלב של תאים המוסמכים של זן Agrobacterium tumefaciens EHA105 או GV3101 מוכנים כמו שמתואר32, דגירה על קרח למשך 30 דקות, הקפאה של חנקן נוזלי עבור 1 דקות, ואני דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
	<ol>
<li>לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מדיום ליברות (טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L ו- 10 גרם/L NaCl) לתערובת תא המוסמכת, דגירה ב 28 ° C עבור 2 ה ספין למטה התאים ב g × 3,000 עבור 1 דקות, מחדש להשעות אותם ב- 0.2 מ ל LB , לוח אותם על אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאים (למשל, spectinomycin 100 מ ג/ליטר ו- 50 מ"ג/ליטר ריפאמפיצין ל26,pPZP-RSC2 מבוססי וקטורים30). לגדול-28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עד מושבות בודדות גלויים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף ואת לוחית רישוי מספר מושבות בודדות על צלחת אגר טריים ליברות (ראה צעד 3.1), לגדול ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ולא לקחת כמות קטנה של חיידקים לניתוח על ידי המושבה PCR33 לאשר הנוכחות של המבנה בינארי ספציפי.</li>
	<li>
לגדול כל המושבה Agrobacterium עם הבונה עניין בן לילה ב 28 ° C ב- 5 מ ל LB בינוני בתוספת אנטיביוטיקה המתאימים (ראה שלב 3.1.1). Centrifuge התאים ב 3,000 × g, וכן מחדש להשעות אותם כדי OD600= 0.5 במאגר agroinfiltration (10 מ"מ MgCl2, 10 מ מ MES (pH 5.6), 150 acetosyringone מיקרומטר). תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר.
	<ol>
<li>אם משתמש תערובת של פלסמידים בינאריים ולא של פלסמיד ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים יחיד עבור חלבון coexpression, מערבבים את תרביות תאים המתאימים ביחס 1:1 v/v לפני חדירה. ואז דגירה התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טען את inoculum לתוך מזרק פלסטיק 1 מ"ל ואת העיתונות שהצינור של המזרק (ללא מחט) נגד האפידרמיס (abaxial) נמוך של בוגרים לגמרי benthamiana ש עלים. חכה העלה עם אצבע בכפפה34,פניה adaxial35.
	<ol>
<li>מציגים את Agrobacterium חדירה בינוני על ידי הזרקה איטית. מובהקות סטטיסטית, לחדור מספר עלים על כל צמח. הערה: שימו לב כי העלים העתיקים משמשים לא כפי שהם לא תשואה רמות הביטוי עקבית.</li>
		<li>לחסן כל העלים בתוך באתרו. לשמור על המפעל הסתנן עד תצפית כפי שמתואר בשלב 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>השימוש להב לחתוך כל עלה לחלקים בין הורידים 24-48 שעות לאחר החדירה, (תלוי היעילות של הביטוי ארעית של החלבון נבדק ספציפי); הגודל של כל פרוסה רקמות צריך להיות כזה כי הפרוסה מכוסה לגמרי על ידי הזכוכית המכסה (22 מ"מ x 40 מ"מ) המשמש מיקרוסקופ.</li>
	<li>המקום הפרוסות עלה על האובייקט שקופית עם פני העלים abaxial פונה כלפי מעלה, הניחו טיפת מים על הפרוסה עלה, לכסות את זה עם כיסוי זכוכית. לשתק את הזכוכית המכסה עם חתיכות קטנות של נייר דבק בכל צד.</li>
	<li>
להתבונן הרקמות agroinfiltrated תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ולהקליט את התמונות המתקבלות.
	<ol>
<li>תחילה, השתמש בעדשה המטרה X 10 כדי לזהות תאים עם האות, ולאחר מכן להשתמש 63 x עדשה המטרה עבור תצפיות מפורט יותר.</li>
		<li>שימוש 458 גל nm מ יון ללייזר לגרות CFP, 543 nm כדי לעורר DsRed2. שומרים על כל הגדרות עבור ייבוא תמונות, קרי, לייזר בעוצמה והגדרות האופטיקה צינור (PMT), בין ניסויים. בממוצע, בדוק 100-120 תאים עבור כל תנאי הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זיהוי של PLS
<ol><li>לאבחן הלוקליזציה של החלבון נבדק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (סעיף 4). בדוק אם החלבון שנבדקו יש את תבנית punctate היקפי אופיינית25,36,37,38,39,40,41 colocalizes עם הסמן משטרת PDCB123. אפשרות זו מציינת כי החלבון שנבדקו מכילים קרוב לוודאי רצפי PLS.</li>
	<li>לאחר אישור לפעילות PLS נבדק חלבון, בהדרגה לסעף את מסגרת קריאה פתוחה (ORF) (מספר גישה genbank BAF93925.1) שברים קטנים יותר, autofluorescently, (למשל, CFP,) לתייג כל אחד מהם, ולנתח שלהם לוקליזציה subcellular כפי שמתואר בשלב 4. בתחילה, בגודל של 100 שאריות חומצה אמינית עבור כל שבר המתפרשות מומלץ.</li>
	<li>בהמשך לסעף השברים קטום אשר הפעילות PLS לבדוק לוקליזציה subcellular שלהם כפי שמתואר בשלב 4 עד השבר הקטן ביותר זה עדיין רגישה לתחנת משטרה, כלומר מספיקה להעביר את המטען תג autofluorescent לתחנת משטרה, מזוהה. קטע זה יש להניח לייצג את רצף PLS.</li>
	<li>מחיקת ביסקוויטים בשם החלבון שנבדקו באורך מלא, קרי נתיך את החלק הנותר של החלבון מבחן ללא PLS בשם autofluorescent תג, לקבוע לוקליזציה subcellular של החלבון המוטנטי וכתוצאה מכך כפי שמתואר בשלב 4. אם זו מוטציה בחלבון חסר ביסקוויטים בשם נכשל להתאים לשפה לתחנת משטרה, יציין כי מזוהה PLS אינה רק מספיק (ראה צעד 5.3), אבל גם הכרחי עבור הובלה Pd של החלבון שנבדקו.</li>
	<li>Agroinfiltrate העלים עם תערובת של תרבויות Agrobacterium מסתירים את הביטוי לבנות עבור PLS מתויג CFP ו DsRed2 חינם (ראה צעד 3.3). להתבונן הסתנן רקמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה המטרה של 10 x באמצעות אותן הגדרות כמו שלב 4.3.</li>
	<li>ציון התאים מכילים אותות CFP והן DsRed2 כתאי הסתנן בתחילה, ולא את נספח תנועה ניקוד התאים הסמוכים שהכיל רק האות CFP כמו אלה. הערה: שלב זה בוחן ביסקוויטים מזוהה בשל יכולתו-לתא התנועה פוטנציאליים; זה בגלל חלבונים רבים המטרה Pd (כולל רוב לשתול MPs ויראלי) גם לעבור Pd לתאים שכנים. הריכוז של Agrobacterium המשמש עבור הסתננות תלוי היעילות ביטוי של מבנים שונים בהתאמה. עבור agroinfiltration, הקפד להשתמש דילול תרבות תא מבטיח (i) טרנספורמציה של תאים בודדים, עוזב את התאים הסמוכים untransformed, (ii) משיגה יעילות דומה לביטוי. לדוגמה, הניסויים שלנו לנצל OD600 של 0.01 ו 0.005 עבור ביטוי מתויג CFP PLS חופשי DsRed2, בהתאמה.</li>
</ol>6. זיהוי של מפתח PLS שאריות באמצעות סריקה אלנין42
<ol><li>השתמש פרוטוקולים סטנדרטיים PCR כדי להגביר ביסקוויטים קידוד רצף העסקת זוג תחל עוצבו כך שיכילו את המוטציה הרצוי, קרי, החלפה של השאריות חומצת אמינו היעד עם אלנין, סביב האזור המרכזי של כל פריימר כמתואר 21. לבצע פריימר עיצוב, ערכת מוטגנזה לשימוש מוטגנזה בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>לטהר את המוצרים PCR הנוצרת באמצעות כל ערכת טיהור DNA סטנדרטי, ולעכל אותם ב 37 ° C עם DpnI לחסל את ההורים (כלומר, ללא-מוטציה) מפוגל ו hemimethylated ה-DNA. יירגעו זה 5 דקות בטמפרטורת החדר (לא על הקרח). ואז להפוך את התערובת ישירות לתוך תאים המוסמכת e. coli 43וזהה מושבות עם מוטציה המבנה הרצוי כפי שמתואר בשלב 3.2.</li>
	<li>להציג את בונה מוטציה לתוך הווקטור בינארי כפי שמתואר בשלב 2.2.4 לבצע agroinfiltration כפי שמתואר בשלב 3, להעריך Pd מיקוד כפי שמתואר ב 4 שלבים ו- 5.1.</li>
</ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ?...

הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינטימית עם הרצפים ספציפי שמכוון את החלבונים מועבר לתוך המסלולים הללו. לפיכך, זיהוי אותות לוקליזציה אלה Pd (PLSs) ייתכן אבחון של מסלול התחבורה Pd המתאימים. זאת על ידי השוואה של משטרת התעבורה8, לדוגמה, מסלולים שונים ייבוא גרעינית, אשר יכול להיות ספציפיות עבור שונה לוקליזציה גרעיני אות (שקל) רצפים9,10. מבחינה מושגית, הן NLSs והן PLSs מייצגים רצפים מיקוד subcellular-cleavable הכרחי ובלתי מספיק עבור מיקוד. אולם, בניגוד NLSs11, המידע רצף על PLSs היא מוגבלות מאוד. באופן ספציפי, רק ארבעה רצפים חלבון מעורב Pd מיקוד דווחו, עם כולן נגזר פרוטאינים צמחיים אנדוגני. הראשון מיוצג על ידי תחום גנים homeobox של KN112 – גורם שעתוק שזז משכבות התא הפנימי כדי אפידרמיס של עלה צמח13 – ו שלו homologs נוקס14. . השני גם הוא מפקטור שעתוק, Dof, אשר מכיל PLS בשם תיאר את הסחר המערכת (IT) מוטיב15. הרצף השלישי של החלבון ממברנה PDLP1 plasmodesmata תושב סוג 1, הוא מיוצג על ידי תחום transmembrane16. לבסוף, המשטרה הרביעי מיקוד רצף דווח לאחרונה על glycosylphosphatidylinositol (GPI)-חלבונים מעוגן וזה מיוצג על ידי האות השינוי17glycosylphosphatidylinositol (GPI).
מעניין, עד ממש לאחרונה, דווחו PLSs אין עבור MPs ויראלי. מחקרים קודמים מצביעות על הימצאות בשם רצפים PLS צמח-18,MPs-ויראלי-19, אך אין PLS אמיתי, דהיינו, רצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי והן מספיקות עבור משטרת פילוח של (מולקולה מטענים לא קשורים למשל., CFP) זוהתה ב MP נגיפי. עוד אחד החלבונים האלה, MP של נגיף פסיפס הטבק (TMV), היה הראשון אשר Pd לוקליזציה ותעבורה כבר הפגינו20.
כדי לטפל פער זה, פיתחנו אסטרטגיית ניסיוני לזהות TMV MP PLS. אסטרטגיה זו התבססה על שלושה מושגים. (i) אנחנו מוגדרים PLS כרצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי ולא מספיק חלבון המיקוד Pd21. (ii) כי TMV MP תחילה מטרות Pd, ואז translocates דרך ערוצים אלה22, אנחנו מכוונים uncoupling שתי פעילויות וזיהוי ביסקוויטים בתום לב, אשר מתפקד רק עבור משטרת מיקוד, ולא על הטרנספורט עוקבות. (iii). ניתחנו ביסקוויטים מזוהה עבור שאריות חומצה אמינית חשובה עבור שלה Pd מיקוד פעילות, בין אם מבחינה מבנית או פונקציונלית. באמצעות גישה זו, מאפשרת לנו רצף שאריות חומצה אמינו 50 התחנה הסופית-אמינו של MP TMV שפועל PLS בתום-לב. זה נעשה על ידי הפקת סדרת שברי TMV MP כי רווי לכל אורכה של החלבון, תיוג שלהם carboxyl-termini עם CFP transiently לבטא אותם ברקמות הצמח. משטרת לוקליזציה של כל אחד מהשברים שנבדקו נקבע על-ידי coexpressing אותם עם משטרת סמן חלבון, PDCB1 (משטרת callose מחייב חלבון 1)23. השבר הקטן עדיין מקומי לתחנת משטרה, אך לא לחצות Pd, נחשב לייצוג PLS. לבסוף, ביסקוויטים היה אלנין-סריקה כדי לקבוע את שאריות מפתח חומצת אמינו הדרושות עבור מבנה ו/או הפונקציה שלה.
ואילו כאן אנחנו להמחיש את גישה זו על-ידי תיאור זיהוי של MP TMV PLS, זה עשוי להיות מועסק לגלות PLSs בחלבונים כל אחרים, ממוקדות Pd, אם מקודד על ידי פתוגנים צמח או את הצמחים עצמם; זה בגלל השיטה שלנו לא לנצל את כל תכונות ייחודיות של MPs ויראלי לגבי יכולתם היעד לתחנת משטרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.

הנתונים נציג, בנאמנות להמחיש את התוצאות צפוי מן הפרוטוקולים שתואר ולזהות את TMV MP PLS, המותאמים מ יואן. et al. 21. איור 1A מסכם ראשון המבנים העיקריים לבטא את באורך מלא TMV MP (1-268), TMV MP PLS (הכוללת את שאריות חומצה אמינית קודם 50 של החלבון, 1-50), ו שלה אלנין סריקה V4A ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K Views.  State University of New York. צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd...

Video: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video