Name: peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות במימון מדע יפן וטכנולוגית סוכנות גישוש מחקר לטכנולוגיה מתקדמת (JST-Erato), האנרגיה החדשה התעשייתי טכנולוגית הפיתוח הארגוני (NEDO), וצלב-משרדי אסטרטגי חדשנות קידום התכנית (SIP), יפן .

1. הכנת פורמולציות מבוסס פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות המניות של כל פפטיד כדלקמן: (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל או 800 ננומטר), Cytcox- (KH) 9 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר). לשקול את הכמות הנדרשת של כל פפטיד צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ולהוסיף מים ultrapure autoclaved לפזר את הפפטיד. מערבבים היטב על ידי pipetting חוזר על עצמו עד פתרון ברור מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר ולטהר את ה- DNA פלסמיד (pDNA), פעמיים גדילי דנ&quot;א (dsDNA) ו- RNA פעמיים תקועים (dsRNA) על פי מתודולוגיות מולקולרי רגיל. ב 1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge, להפוך פתרונות מניות עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(pDNA ו dsDNA) או 400 ננומטר (dsRNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון חלבון מניות עם ריכוז של 7 מיקרומטר, על ידי המסת 1 מ&quot;ג של חלבון (למשל., Dehydrogenase אלכוהול, ADH) אבקה ב 1 מיליליטר של תמיסת סודיום קרבונט (0.1 M, pH 9). לייבל החלבון עם fבדיקות luorescent כגון rhodamine B (RHB) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לאפשר להדמיה מיקרוסקופית של החלבון אל תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המרכיבים השונים בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד הציטופלסמה, להוסיף 6.4 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 773.6 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי גרעינית (P35S-RLuc-TNOS, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד המיטוכונדריה, להוסיף 6.6 μl של Cytcox- (KH) 9 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 ° C ולאחר מכן להוסיף 2.4 μl של BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 256; צלזיוס במשך 15 דקות אחרות. להוסיף 771 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי המיטוכונדריה (pDONR-COX2: rluc, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-dsDNA, להוסיף 5.1 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 8 μl של dsDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 786.9 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-dsRNA, להוסיף 50 μl של (KH) 9 -BP100 (800 ננומטר) 50 μl של dsRNA (400 ננומטר) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 700 μl של RNase ללא מים כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים-חלבון פפטיד, להוסיף 16 μl של (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר) ל -16 μl של ADH (7 מיקרומטר) ומערבביםהיטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף 768 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הניסוחים לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. </li></ol> .2 אפיון פורמולציות מבוסס פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל פתרון (800 μl) לתוך קובט לניתוח דינמי פיזור אור (DLS). לקבוע את מדד בקוטר polydispersity הידרודינמית של מתחמי הקים עם nanosizer זטה, באמצעות לייזר 633 ננומטר הוא Ne-של 25 מעלות צלזיוס עם זווית גילוי backscatter של 173 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מדידות גודל, להעביר כל פתרון (800 μl) לתוך תא נימי מקופל למדידות פוטנציאל זטה ב פרמטרים ברירת המחדל של קבוע דיאלקטרי, מקדם השבירה ואת צמיגות המים במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נפח קטן של פתרון מורכב, המשמש ניתוח DLS, על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הפקדה של 10 μl של פתרון מורכב על גבי המשטח בקע חשוף הטרי של גיליון יציץ ולהשאיר את המיקה לאוורר לילה יבש בצלחת פטרי פלסטיק מכוסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של המתחמים באוויר ב 25 מעלות צלזיוס באמצעות שלוחת סיליקון עם קבוע קפיץ של 1.3 N / מ &#39;קשה במצב 27,28. </li></ol> הסתננות 3. עלי צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 צמחי קרקע-הזדקנו שבוע (ארבידופסיס thaliana 24, ניקוטיאנה benthamiana 24 או 26 צפצפה). Transfect לפחות 3 עלים לשמש בשלושה עותקים עבור כימות של ביטוי גנים או מסירת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק פלסטיק מחטים 1 מ&quot;ל עם 100 μl של פתרון מורכב עבור transfection של עלה אחד. מקם את קצה המזרק על פני שטח abaxial של העלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על קצה המזרק נגד עלה מעט לוחץ על מתג המזרק לאט תוך הפעלת א-לחץ נגדי עם iאצבע ndex של יד לטקס בכפפות מהצד ההפוך. ניתן לצפות חדירה מוצלחת כמו הפצת אזור ספוגת מים עלה. לייבל העלים הסתננו על מנת להקל על הזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עלה טרנספקציה משכי אופטימיזציה הבאים חדירה עם-pDNA פפטיד (12 שעות), פפטיד-dsDNA (12 שעות), פפטיד-dsRNA (9 - 48 שעות) ו-חלבון פפטיד (6 שעות) ניסוחים בתנאים הבאים: 16 hr אור / 8 שעות בחושך ב 22 מעלות צלזיוס למשך א thaliana ו צפצפה, או 24 שעות אור קבוע ב 29 מעלות צלזיוס למשך נ benthamiana. </li></ol> הערכת 4. יעילות Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו כולו עלה טרנספקציה של שהמפעלים הקטנים יותר (למשל., Thaliana א) או סעיף 1 ס&quot;מ 2 של האזור הסתננו לצמחים גדולים (למשל., נ benthamiana). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים transfection באמצעות בלוציפראז Renilla (Rluc) וקטור הכתב, לקבוע את transfectioיעילות n כמותית באמצעות ערכת Assay Rluc. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל עלה נכרת או סעיף עלה בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. הוספת 100 μl של 1 × Rluc Assay הצפת תמוגה לכל צינור. באותו אופן, להכין lysates עלי שליטה הלא transfected (בשלושה עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחן את העלים באמצעות עלי המגון דגירת lysate כתוצאה במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 - 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב g 12,470 × ב microcentrifuge דקות 1. העברת 20 μl של lysate פינה אל באר בתוך microplate 96-היטב, ולהשתמש נפח הנותרים כימות של ריכוז החלבון הכולל באמצעות ערכת Assay חלבון BCA פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של 1 × המצע Assay Rluc (מדולל באמצעות הצפת Assay Rluc) לתוך הבאר ומערבבים ידי pipetting איטי. מניחים את microplate ב קורא microplate multimode וליזום המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הארת הרקע (ממוצע של לאn-טרנספקציה בשלושה עותקים) מכל ההארה של מדגם הניסיון. חשב את היחס בין photoluminescence (יחידות אור יחסי, RLU) לסכום של חלבון (מ&quot;ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים transfection באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקטור הכתב או שכותרתו fluorescently חלבון (למשל., ADH-RHB), ולבחון את הקרינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצוות של עלה שלם (כדי לסייע להסרת חללי האוויר), בעוד עלה מחולק יכול לשמש הוא. הסר את הבוכנה של מזרק 10 מ&quot;ל ומניח כל חלק לעלה או עלה ניכר בתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הבוכנה ולחץ עליו בעדינות לתחתית המזרק ללא ריסוק העלה. לשאוב מים לתוך המזרק עד שהוא כמחצית מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המזרק כלפי מעלה ודוחפים את הבוכנה כדי להסיר אוויר מן המזרק דרך קצה. מכסה את קצה המזרק ולמשוך את הבוכנה כלפי מטה לאט לגרש אוויר מן לאהf. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד העלה נראה שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פני השטח של המיקרוסקופ שקופית עם דבק. חותכי שטח מרובע בקלטת הגדולה מספיק כדי להכיל את המדגם עלה באמצעות סכין, לקלף את הפיסה הרבועה של קלטת את עם מלקחיים כדי ליצור תא דגימה. הקלטת תשמש spacer בין השקופיות coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עלה בתא עם המשטח abaxial פונה כלפי מעלה ולמלא באזור תא הנותרים עם מים. חותם את העלה בתוך תא עם coverslip זכוכית ולאבטח את הקצוות של coverslip עם סרט דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המדגם עלה באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר confocal תחת מטרה 40X או טבילה אובייקטיבי מים 63X. GFP או קרינת RHB ניתן דמיין באורכי גל עירור של 488 ננומטר או 555 ננומטר, בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).</li><li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+farming:+systems+and+products.">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li><li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA.">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li><li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation:+problems+and+strategies+for+practical+application.">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li><li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications.">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li><li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event?.">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?.</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li><li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+25,+Engineering+peptide-based+carriers+for+drug+and+gene+delivery.">Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery.</a> Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).</li><li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug/gene+delivery+and+tissue+engineering.">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li><li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(amino+acid)s/polypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials.">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules.">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li><li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems.">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li><li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells.">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li><li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells.">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides.">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li><li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs.">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li><li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery.">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li><li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery.">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li><li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers.">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751 (2015).</li><li>Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+method.">Plant transformation method.</a> Patent. , (2015).</li><li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides.">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).</li><li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers.">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li><li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes.">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li><li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide.">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+processes+of+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric+acid]+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy:+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates.">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM.">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li><li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide.">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface.">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li><li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles.">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li><li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+transformation.">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li><li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants.">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li><li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning.">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li><li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation.">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול אשר זוהו באופן אמפירי נדונים. על ידי חדירת מזרק, הניסוחים מבוססי פפטיד המוכנסים הנאדיות בתוך עלה הצמח דרך הפיוניות. כדי להבטיח ספיגה מקסימלי של הפתרון, בתהליך החדיר צריכה להתבצע כאשר הצמחים נמצאים תחת תנאים שהם תורמים פתיחת הפיוניות כלומר., מסופקים עם מספיק מים ובתקופת האור. באשר להכנת מתחמי transfection, על ניסוחים שכוללים שילוב של שני פפטידים (למסירת DNA במיקוד המיטוכונדריה), הרצף עבור תוספת של כל רכיב חיוני ולא צריך להיות הפוך. ישנם שינויים רבים סבירים לנוהל. אופציה נוספת עבור חדירת תאי צמח היא השימוש של חדירת אבק, אשר מסוגל להציג את הפתרון המורכב לתוך צמחים שלמים ו / או רקמות חלקיות כוללmeristems הפסגה. עבור הליך חלופה זו, שתילי שקועות הפתרון transfection, ובהתבסס על הלחץ שנוצר על ידי ואקום, מתחמי מטען הפפטיד נאלצים דרך הפיוניות ולתוך בתאי צמח (Yoshizumi, ט, נתונים שלא פורסמו). ביטוי גני חלוף, בהתבסס על מחקרים באמצעות תאים מן החי, מוכיח להגדיל עם ריכוזי DNA גבוהים 29-31. חשוב לציין כי היחס של פפטיד ל- DNA משפיע על מאפייני biophysical (גודל, פריצת שטח) של מתחמים (איור 4), אשר משפיע יעילה transfection; ומכאן, היחס האופטימלי צריך להישמר גם עם ריכוז ה- DNA מוגבר. אחד היתרונות העיקריים באמצעות פפטידים כסוכן למסירת גן / חלבון הוא כי הרצף שלה ניתן כוונון למלא תפקיד רצוי. לדוגמא, תחום מיקוד-המיטוכונדריה של הפפטיד המוביל מתואר הרבעה זוy יכול להיות מוחלף עם רצפים chloroplastic או peroxisomal מיקוד עבור לוקליזציה אברונים אלה. בעוד שתמורה הכלורופלסט אפשרי בכמה צמחים באמצעות biolistics 32-34, לא Agrobacterium ולא שיטת biolistic יכול להציג גנים לתוך המיטוכונדריה או אברונים אחרים מלבד גרעין (טבלה 2). אין מגבלות מארח לטווח קשיחים transfection מבוססי פפטיד, בשונה משיטת מבוססי Agrobacterium (טבלה 2). עד כה, ניסוחים עבור transfection של thaliana א, נ benthamiana וצפצפה מוטבו (טבלה 1), אבל השיטה יכול להיות מיושם גם עבור טבק, זן עגבניות מיקרו-טום, אורז (מבוסס על ניסויים ראשוניים), וצמחים ובי-dicotyledonous אחרים. נכון לעכשיו, אין שום מגבלה ידועה בגודל transgene כאשר פפטידים הם השתמשווקטורי transfection הים. לעומת זאת, מולקולות דנ&quot;א גדולות נמצאו להפחית את יעילות השינוי של שיטות בתיווך Agrobacterium 35,36, ו מגבלת גודל עליון transgenes של כ 200 kb דווח 37-39. שימוש biolistics, מצד השני, קטעי דנ&quot;א גדולים עשויים להיות טעונים במהלך הכנה או מסיר לתוך צמחי 38. אמנם אין גבול עליון נקבע לטרנספורמציה biolistic עד כה, אילוצים פיזיים נמצאו להגביל את הגודל של ה- DNA כי ניתן להעביר הרבה פחות מ -150 KB 40. היתרונות העיקריים של שימוש במערכת מבוססת-פפטיד עבור העברת גנים לעומת הגישות קיימות העסקה או Agrobacterium או הפגזת microprojectile, שנדונו לעיל, מסוכם בטבלה 2. במוגבלות מעטיבשביל שיטה זו כפי שהיא עומדת. ראשית, ממוקד משלוח של pDNA כדי האברונים ספציפיים, כגון mitochondria, הוכח אפשרי על ידי שילוב פשוט של ה- DNA מחייבת חודר תאים רצפים במעבר אברון למרות היעילות הייתה נמוכה. הביטוי transgene ניתן היה לזהות, על ידי מיקרוסקופ confocal, רק אוכלוסייה קטנה של המיטוכונדריה בתוך התאים. לפיכך, שינויים נוספים נחוצים כדי: (i) לשפר את טרנסלוקציה של מתחמים יותר על פני התא / קרום organellar, וכן (ii) לשפר את הניתוק והעברת pDNA מן פפטיד המוביל לתוך אברון היעד לביטוי. שנית, באמצעות מערכת מסירת DNA זה, הביטוי החולף של גני כתב אקסוגניים הושג בהצלחה בתא cytosolic ו המיטוכונדריה של תאים. התאגדות וביטוי יציב של הגנים הציגו את הכור הגרעיני / הגנום organellar לא הוקמו עדיין, עם זאת, בשל העדר של אסטרטגיות בחירה מתאימות. אף שהוא מודה כי ישנם אזורים לשיפור או ד נוסףevelopment, האסטרטגיה נגזרת פפטיד המתוארת כאן נשארת טכניקה פשוטה צדדית סללה את הדרך עבור משלוח מטענים שונים לסוגי צמח מגוונים.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table><tbody><tr><td>(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;-BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-K&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-&lt;br/&gt; KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml and 10 ml Plastic Syringes</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Plate</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Folded Capillary Cell</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Stainless pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization Pestle</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&amp;reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri Dish</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B Isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade and Handle</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Tip Cap</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

מערך מטעני חומצה וחלבון גרעין הוכנס בהצלחה לתוך צמחים שונים באמצעות פפטידים תוכננו וקטורי משלוח. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין פפטידים קטיוני ומטענים-טעונים שלילי הביאו להיווצרות של מתחמי transfection כי יכול להיות שחדר ישירות לתוך בעלים הצמח באמצעות מזרק מחטים (איור 1). ניסוחים אופטימליים (נקבע באופן אמפירי במחקרים אלה 21,23-26) עבור transfection של בתאי צמח מפורטים בטבלה 1, כאשר כל סוג של מגוון רחב של מטענים נמסר (pDNA, dsDNA, dsRNA וחלבון) מיוצגת. בקטרים ​​הממוצעים של כל הניסוחים מבוססים פפטיד היו בטווח המשוער של 150 - 300 ננומטר. בהתבסס על ניתוח DLS, כל הניסוחים מוצגים polydispersities גודל נמוך יחסית, המעיד כי אגרגטים פפטיד המטען נוצרו יש חלוקה בגודל אחידה. המורפולוגיות שלמתחמי בין פפטיד pDNA (איור 2 א) או חלבון (תרשים 2B), על מיקה, הם צילמו על ידי AFM. מתחמי כדוריים הומוגנית נצפו הן שילובים פפטיד-pDNA פפטיד-חלבון, בהסכמה עם נתונים ממדידות DLS. מבחינת הפוטנציאל זטא של מתחמים (טבלה 1), pDNA- ומכלולים הנגזרות dsDNA היו חיובי שטח נטו שלילי בעוד מתחמים מבוססים dsRNA היה מטען משטח ליד ניטראלי. מתחמי פפטיד-חלבון, ומצד שני, היו בעלי מטען חשמלי חיובי. הנצילות של pDNA פפטיד ניסוחים-dsDNA פפטיד בתיווך transfection של thaliana א או נ benthamiana כמערכות צמח המודל הוערכו כמותית וכן איכותית. את assay ביטוי גנים RLuc הועסק כימות של רמות ביטוי גנים (טבלה 1), ולכן, עבור pDNA בניסוי זה אוdsDNA קידוד הגן RLuc חייב לשמש complexation עם פפטידים המוביל בהתאמה. שימוש (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA, משלוח גרעיני במיקוד וביטוי של pDNA יכול להיות מושג, לאחר תקופת דגירה של 12 שעות, עם ערך מ&quot;ג RLU / מוערך של כ 1 × 10 5. למסירה במיקוד המיטוכונדריה וביטוי של pDNA, שילוב של פפטידים, Cytcox- (KH) 9 ו BP100, נדרש ליצירת מורכבות. עם תקופת הדגירה באותו אופטימיזציה של 12 שעות, עם זאת, ברמה הרבה יותר נמוכה של transfection (כ 1 × 10 3 RLU / מ&quot;ג) הושגה. בינתיים, תקופת דגירה דומה (12 שעות) ורמת ביטוי גנים (כ 1 × 10 3 RLU / מ&quot;ג) נדרשו / מוקלטת עבור מתחמים מבוססים dsDNA, אף התגבשו באמצעות (KH) 9 -BP100 פפטיד. הערכות איכותיות של ביטוי גנים בוצעו על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה של עלים שטופלה prepar מתחמיםed באמצעות pDNA או dsDNA קידוד גן כתב GFP. בתאים transfected עם מתחמים הלא ממוקד פפטיד-pDNA, מפוזר פלואורסצנטי ירוק להתכתב עם הביטוי של GFP נצפה בבירור ונמצא למקם ב (איור 3 א) cytosol. הבדלים ברורים דפוס לוקליזציה של הקרינה GFP ניכרו תאים הסתננו עם מתחמי pDNA-פפטיד במיקוד המיטוכונדריה. הנה, פלואורסצנטי ירוק punctate כי colocalize עם הכתם המיטוכונדריה היה גלוי, המאשר את הספציפיות של ביטוי גנים באופן בלעדי בתא המיטוכונדריה של תאים (איור 3). במקרה של ניסוחים-חלבון פפטיד, נטייה של מטען החלבון (ADH) על fluorophore (RHB) תאפשר להדמיה של החלבון נשא בתא התאי. בתוך תקופת דגירה קצרה של 6 שעות, ADH-RHB חלבון (כחול) נמצא שיחולקו לאורךcytosol ו vacuole של תאים הסתננו (איור 3 ג). בינתיים, מהיר ויעיל למטה בקרת גנים יכול להיות מושלם בצמחים שונים באמצעות ניסוחים פפטיד-dsRNA. בניסוי הראשון, עלה thaliana א הסתנן עם פפטיד-dsRNA קומפלקסים להשתיק את גן synthase chalcone (CHS) האחראי אנתוציאנין (פיגמנט האדום) ביוסינתזה בתנאי בצורת. ההבדל במראה של thaliana א עלים תחת נורמלי (האיור 3D, א) ותנאי בצורת (איור 3D, ב) ספק אמצעי קל להעריך CHS השתקה באמצעות ניסוח פפטיד-dsRNA אופטימיזציה (חץ 1 מציין באזור הסתנן). בניסוי השני, מתחמי פפטיד-dsRNA הסתננו לתוך העלים של thaliana א המהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). הפחתה ניכרת ביטוי YFP ניתן היה לראות את התאים אפידרמיס 9 שעות pOST-transfection (איור 3E, F). האפקטיבי של הניסוח בביטוי גני ויסות למטה במערכת צמחים שונה (צפצפה, 12 שעות שלאחר transfection) גם אושר (האיור 3G, H). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> איור 1: פורמולציות מבוססים פפטיד עבור משלוח חומצות גרעין ומטעני חלבון לתוך חיים וצמחים. פפטידים המובילים שנועדו להכיל polycations מצומדות כדי חודר לתא או רצפי מעבר organellar. Polycations מאפשר מחייב ו / או התעבות של מטענים-טעונים שלילי כמו גם בריחה מתא endosomal הבא הפנמה לתאים. משלוח מטענים לתאים ובהמשך ל אברונים ספציפי מתווך על ידי רצפים חודרים לתא רצפי מעבר organellar, בהתאמה. מטענים שונים שיכולים להיות successfully נמסר לתוך הצמח כוללים חומצות גרעין כגון pDNA, dsDNA ו dsRNA, כמו גם חלבונים מודל כמו אלבומין בסרום שור (BSA), dehydrogenase אלכוהול (ADH) סיטרין (וריאנט של חלבון פלואורסצנטי צהוב). מולקולות ביו מסוגלים להקים מתחמי transfection עם conjugates פפטיד באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, אשר מוכנסים עלי הצמח על ידי חדירת מזרק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> איור 2: מורפולוגיות של פורמולציות המבוססות פפטיד. (א) AFM משרעת תמונה של (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA ב N / P 0.5. (ב) תמונה גובה AFM של (BP100) 2 K 8 / ADH ניסוח בבית רטי טוחנתo 10. לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> איור 3: הערכה מיקרוסקופית של יעילות transfection באמצעות פורמולציות פפטיד מבוססי אופטימליים. (א) ביטוי GFP Cytosolic (ירוק), להבדיל בין autofluorescence הכלורופלסט (אדום), נצפה בתאי mesophyll הספוגיים של thaliana א עלים הסתנן עם (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA (N / P 0.5; 12 שעות ). (ב) ביטוי של GFP (ירוק) זוהה במיטוכונדריה (אדום) בתאי האפידרמיס של עלים א thaliana הסתננו עם Cytcox- (KH) 9 / BP100 / ניסוח pDNA (N / P 0.5 לכל peptidדואר; 12 שעות). תמונות מוגדלות של המיטוכונדריה עם ביטוי של GFP מוצגים בלוח הימין הקיצוני. משלוח (C) של ADH-RHB (כחול) לתוך התאים mesophyll הספוגית של thaliana א עלים בתיווך (BP100) 2 K 8 ביחס טוחנת פפטיד / חלבון של 10, דמיינו 6 שעות-חדירת הפוסט. (ד) עלה א thaliana לפני (א) ואחרי (ב) טיפול (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 48 שעות), אשר הביא דיכוי המסלול ביוסינתזה אנתוציאנין. ניסוח דומה המכיל GFP5 dsRNA הסתנן לתוך עלה כפי בקרה שלילית (ג). חצי 1 ו -3 מצביעים באזור הסתנן בעוד חצים 2 ו -4 עולים לאזור שאינו הסתנן בתוך העלה. (ה) א thaliana משאיר לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (ו) את הקרינה YFP פחתה בעקבות חדירת עם<html> (קרן היסוד) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחנת 2; 9 שעות). (G) עליי צפצפה מהונדסת מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (H) חדירה הבאים קרינת YFP פחתו עם (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 12 שעות). לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> איור 4: וריאציה פפטיד-ל-דנ&quot;א (N / P) יחס והשפעתם על מאפייני biophysical של מכלולים. עם הגדלת פפטיד יחס DNA, ניסוחים מבוססים פפטיד להקטין בגודלו בשעת מעבר הערכים זיטה-פוטנציאל שלהם משלילי לחיובי./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> טבלה 1: אפיון והערכה של פורמולציות פפטיד המבוסס השונה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> טבלה 2: השוואה בין פפטיד מבוסס ואחרים טכנולוגיות משלוח DNA קיימים עבור צמחים שלמים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Views.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Video: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochemistry

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Chemistry

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Biology

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Immunology and Infection

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

העברת מולקולות בצמחים באמצעות מכשיר עירוי ישיר

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

מחבר זרקור: מכשיר עירוי ישיר להעברת מולקולות בצמחים  

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

מכשיר עירוי ישיר להעברת מולקולות בצמחים

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video