Os autores gostariam de reconhecer o financiamento do Japão Agência de Ciência e Tecnologia Investigação exploratória de Tecnologia Avançada (JST-ERATO), a Nova Energia e Tecnologia Industrial Development Organization (NEDO), e do Programa de Promoção da Inovação Estratégica Cross-ministerial (SIP), Japão .

1. Preparação de Formulações Peptide-Based <ol><li> Preparar soluções de estoque de cada péptido como se segue: (KH) 9 -BP100 (1 mg / mL ou 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) e (BP100) 2 K 8 (70 uM). Pesa-se a quantidade necessária de cada péptido num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar água ultrapura autoclavada para dissolver o péptido. Misturar bem por pipetagem repetida até se obter uma solução límpida. </li><li> Amplificar e purificar o plasmídeo de ADN (pADN), ADN de cadeia dupla (dsDNA) e ARN de cadeia dupla (ARNcd) de acordo com metodologias moleculares padrão. Em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga, fazer soluções de reserva com uma concentração de 1 mg / ml (pADN e dsDNA) ou 400 nM (ARNcd). </li><li> Preparar a solução da proteína com uma concentração de 7 uM, através da dissolução de 1 mg de proteína (por ex., Álcool-desidrogenase, ADH) em pó em 1 ml de solução de carbonato de sódio (0,1 M, pH 9). Marcar a proteína com fsondas luorescent tais como rodamina B (RhB) de acordo com protocolos convencionais para permitir a visualização microscópica da proteína entregue nas células. </li><li> Combinam-se as respectivas componentes num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. <ol><li> Para formulações de péptido-pADN segmentação do citoplasma, adicionar 6,4 mL de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 20 ul de pADN (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 773.6 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Utilizar a construção de pADN concebido para expressão nuclear (P35S-RLuc-TNOS, Tabela 1). </li><li> Para formulações de péptido-pADN segmentação da mitocôndria, adicionar 6,6 mL de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) a 20 ul de pADN (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C e, em seguida, adicionar 2,4 mL de BP100 (1 mg / ml). Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 256; C, durante mais 15 min. Adicionar 771 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Utilizar a construção de pADN concebido para expressão mitocondrial (pDONR-COX2: rluc, Tabela 1). </li><li> Para formulações de péptido-dsDNA, adicionar 5,1 mL de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) e 8 ul de ADNcd (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 786.9 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. </li><li> Para formulações de péptido-dsRNA, adicionar 50 ul de (KH) 9 -BP100 (800 nm) para 50 ul de ARNdc (400 nM) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 700 uL de água sem RNase para diluir a solução para um volume final de 800 ul. </li><li> Para formulações de péptido-proteína, adicionar 16 ul de (BP100) 2 K 8 (70 uM) a 16 ul de ADH (7 uM) e misturarbem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 768 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. </li></ol></li><li> Permitir que as formulações para estabilizar durante 15 min a 25 ° C. </li></ol> 2. Caracterização das formulações Peptide-Based <ol><li> Transfira cada solução (800 mL) numa cuvete para análise dinâmica de espalhamento de luz (DLS). Determinar o diâmetro hidrodinâmico e polidispersidade índice dos complexos formados com um Nanosizer zeta, usando um 633 nm do laser de He-Ne a 25 ° C com um ângulo de detecção de retrodifusão de 173 °. </li><li> Na sequência de medições de tamanho, transferência de cada solução (800 ul) para uma célula capilar dobrado para medições de potencial zeta em parâmetros padrão de constante dieléctrica, índice de refracção e a viscosidade da água a 25 ° C. </li><li> Observar um pequeno volume da solução do complexo, utilizado para a análise de DLS, por microscopia de força atómica (AFM). Depósito de 10 ul de solução de complexo sobre a superfície recém exposta clivado de uma folha de mica e deixar a mica ao ar durante a noite seca num prato de petri de plástico coberta. </li><li> Adquirir uma imagem dos complexos em ar a 25 ° C, utilizando um braço de suporte de silício com uma constante de 1,3 N / m mola em modo tapping 27,28. </li></ol> 3. A infiltração das folhas das plantas <ol><li> Use plantas cultivadas em solo velhos 3 semana (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 ou choupo 26). Transfectar pelo menos 3 folhas de servir como triplicado, para a quantificação da expressão de genes ou a entrega de proteína. </li><li> Carregar uma seringa de plástico de 1 ml sem agulha com 100 ul de solução do complexo, para a transfecção de uma folha. Posicionar a ponta da seringa na superfície abaxial da folha. </li><li> Pressione a ponta da seringa contra a folha ligeiramente e pressionar o êmbolo da seringa lentamente enquanto exerce uma contra-pressão com a idedo NDEX de uma mão de látex de luvas do lado oposto. infiltração bem sucedida pode ser observado como o espalhamento de uma área embebido em água na folha. Rotular as folhas infiltradas para facilitar a identificação. </li><li> Incubar a folha transfectado para durações optimizadas seguinte infiltração com péptido-pADN (12 hr), o péptido-dsADN (12 hr), o péptido-ARNcd - formulações (9 48 h) e péptido-proteína (6 h) sob as seguintes condições: 16 luz hr / 8 h escuro, a 22 ° C para A. thaliana e álamo, ou luz constante 24 horas a 29 ° C para N. benthamiana. </li></ol> 4. Avaliação da eficiência de transfecção <ol><li> Extirpar toda a folha transfectadas de plantas menores (por exemplo., A. thaliana) ou uma secção de 1 cm2 da região infiltrada por plantas maiores (por exemplo., N. benthamiana). </li><li> Para as experiências de transfecção utilizando a luciferase da Renilla (Rluc) vector repórter, determinar a transfectioN eficiência quantitativamente usando um Kit de Ensaio Rluc. <ol><li> Colocar cada folha excisada ou secção da folha em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 uL de 1 x tampão de ensaio de Rluc lise por tubo. Do mesmo modo, preparar lisados ​​de folhas de controlo não transfectadas (em triplicado). </li><li> Moer a folha usando um pilão de homogeneização e incubar o lisado resultante a 25 ° C durante 6-10 h. </li><li> Centrifugar o lisado a 12.470 x g numa microcentrífuga durante 1 minuto. Transferir 20 uL do ligado clarificado para um poço de uma microplaca de 96 poços, e utilizar o volume remanescente para quantificação da concentração total de proteína usando um kit de ensaio de BCA proteína de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Adicionar 100 ul de 1 × Rluc Assay Substrate (diluídas usando o Tampão de Ensaio Rluc) para o poço e mistura por pipetagem lenta. Coloque a microplaca num leitor de microplacas multimodo e iniciar a medição. </li><li> Subtrair a luminescência de fundo (média do nãoN-transfectadas triplicado) de luminescência de cada amostra experimental. Calcular a proporção de fotoluminescência (unidades de luz relativa, RLU) para a quantidade de proteína (mg). </li></ol></li><li> Para experiências de transfecção utilizando proteína fluorescente (GFP) vector repórter verde ou proteína fluorescente etiquetado (por exemplo., ADH-RhB), observar a fluorescência usando um microscópio confocal de varrimento laser. <ol><li> Corte as bordas de uma folha inteira (para auxiliar a remoção dos espaços de ar), enquanto uma folha em corte pode ser utilizado tal e qual. Retirar o êmbolo de uma seringa de 10 ml e colocar cada secção da folha ou folha excisada na seringa. </li><li> Substituir o êmbolo e empurrá-lo suavemente para o fundo da seringa sem esmagamento da folha. Tirar água para a seringa até que seja cerca de metade cheio. </li><li> Aponte a seringa para cima e empurre o êmbolo para remover o ar da seringa através da ponta. Cobrir a ponta da seringa e puxar lentamente o êmbolo para expelir o ar a partir da Leaf. Repita esse processo várias vezes até que a folha aparece translúcida. </li><li> Cobrir a superfície de uma lâmina de microscópio com fita adesiva. Cortar uma área quadrada na fita suficientemente grande para acomodar a amostra da folha usando uma lâmina, e retire a peça quadrada de fita adesiva com uma pinça para criar uma câmara de amostra. A fita irá servir como um espaçador entre a lâmina e lamela. </li><li> Coloque a folha na câmara com a superfície abaxial para cima e virado para preencher a área da câmara com água restante. Selar a folha no interior da câmara com uma lamela de vidro e para fixar as bordas da lamela com fita adesiva. </li><li> Examine a amostra de folha utilizando o microscópio confocal de varrimento laser sob uma objetiva de 40X ou uma objetiva de imersão 63X de água. GFP ou RhB fluorescência pode ser visualizado em comprimentos de onda de excitação de 488 nm ou 555 nm, respectivamente. </li></ol></li></ol>

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G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

As etapas críticas no âmbito do protocolo que foram identificados empiricamente são discutidos. Por infiltração seringa, as formulações com base em peptídeos são introduzidos nos espaços aéreos no interior da folha da planta através do estomas. Para garantir a absorção máxima da solução, o processo de infiltração deve ser realizada quando as plantas são sob condições que são favoráveis à abertura estomática isto é., Fornecidas com água suficiente e durante o período de luz. No que diz respeito à preparação de complexos de transfecção, para formulações que envolvem uma combinação de dois péptidos (para entrega de ADN alvo-mitocondrial), a sequência de adição de cada componente é crucial e não deve ser invertido. Existem muitas modificações plausível para o procedimento. Uma outra opção para a infiltração de células vegetais é o uso de infiltração por vácuo, que é capaz de introduzir a solução do complexo em plantas inteiras e / ou parciais, incluindo tecidosmeristemas apicais. Para este procedimento alternativo, as plântulas são submersas na solução de transfecção, e com base na pressão gerada pelo vácuo, os complexos de péptido de transporte de carga são forçados através do estomas e para as células vegetais (Yoshizumi, T., dados não publicados). A expressão do gene transiente, com base em estudos que utilizam células de animais, foi demonstrado que o aumento de concentrações de ADN superiores 29-31. É importante notar que a proporção de péptido de ADN afecta as propriedades biofísicas (tamanho, carga superficial) de complexos (Figura 4), o que influencia a eficiência da transfecção; Assim, a proporção óptima necessita de ser mantida, mesmo com o aumento da concentração de ADN. Uma das principais vantagens em utilizar péptidos como um agente de entrega de genes / proteínas é que a sua sequência é passível de ajuste para cumprir uma função desejada. Por exemplo, o domínio de direccionamento mitocondrial do péptido transportador descrito neste pernoy pode ser substituído por sequências cloroplasmático ou peroxisomais-alvo para localização para essas organelas. Enquanto é possível a transformação de cloroplastos em plantas usando vários biolística 32-34, nem o Agrobacterium, nem o método de biolística poderia introduzir genes para a mitocôndria ou outros organelos além do núcleo (Tabela 2). Não existem limitações rígidas gama de hospedeiros para a transfecção à base de péptido, ao contrário do método baseado Agrobacterium (Tabela 2). Até agora, as formulações para a transfecção de A. thaliana, N. benthamiana e choupo foram optimizados (Tabela 1), mas o método pode também ser aplicado para a Nicotiana tabacum, cultivar tomate Micro-Tom, arroz (com base em experiências preliminares), e outras plantas mono e dicotiledóneas. Como, no entanto, não há nenhuma limitação conhecida no tamanho do transgene quando os péptidos são utilizados umvectores de transfecção. Em contraste, as moléculas de ADN grandes têm sido encontrados para reduzir a eficácia de transformação de Agrobacterium métodos mediados por 35,36, e um limite de tamanho superior para os transgenes de cerca de 200 kb foi avaliado 37-39. Usando biolística, por outro lado, grandes fragmentos de DNA pode ser cortado durante a preparação ou fornecimento em plantas 38. Embora nenhum limite superior tenha sido determinada para a transformação biolística até agora, constrangimentos físicos foram encontrados para restringir o tamanho do DNA que pode ser transferido para muito menos do que 150 kb 40. Os principais benefícios da utilização do sistema à base de péptido para a transferência de genes em comparação com as abordagens actuais funcionem com Agrobacterium ou bombardeamento de microprojécteis, discutidas acima, encontram-se resumidos na Tabela 2. Existem alguns limitações para este método, tal como está. Em primeiro lugar, direcionados entrega de pDNA para organelas específicas, tais como o mitochondria, foi provado ser possível através de uma simples combinação de, sequências de penetração de células e organelas-trânsito se ligam ao DNA, embora a eficiência foi baixa. expressão do transgene pode ser detectada, por microscopia confocal, apenas numa pequena população de mitocôndria dentro das células. Assim, outras modificações são necessárias para: (i) aumentar a translocação de mais complexos através da membrana celular / organelar, e (ii) melhorar a dissociação e a transferência de pADN do péptido transportador para o organelo alvo para expressão. Em segundo lugar, a utilização deste sistema de entrega de ADN, a expressão transiente de genes repórter exógenos foi conseguida com sucesso no compartimento citosólico e mitocondrial de células. incorporação estável e a expressão dos genes introduzidos no genoma nuclear da planta / organelar não tenham sido ainda estabelecido, no entanto, devido à ausência de estratégias de selecção adequados. Embora reconhecendo que existem áreas para melhoria ou mais desenvolvimento, a estratégia de derivados de peptídeo descrito aqui permanece uma técnica simples e versátil, que abriu o caminho para a entrega de várias cargas em diversos tipos de plantas.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2358">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(KH)9-BP100 peptide</td>
			<td style="width:355px;">Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- 
			KHKKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(BP100)2-K8 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- 
			KYLKKKKKKKK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP100 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cytcox-(KH)9 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- 
			KHKHKHKHKHKH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP5 siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHS siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL and 10 mL Plastic Syringes</td>
			<td>TERUMO Corporation</td>
			<td>SS-01T, SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>151212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">96-Well Flat-Bottom Plate</td>
			<td>Asahi Glass Co., Ltd.</td>
			<td>3860-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Adhesive Tape</td>
			<td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>No. 835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Alcohol Dehydrogenase</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">A-7011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Seiko Instruments Inc.</td>
			<td>SPI3800, SPA 300HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>AFM5300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cantilever</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>K-A102001593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cork Borer</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td>Z165220</td>
			<td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coverslip</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">C02261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cuvette</td>
			<td style="width:355px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:315px;">759116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Folded Capillary Cell</td>
			<td style="width:355px;">Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forceps</td>
			<td style="width:355px;">Shimizu Akira Inc.</td>
			<td style="width:315px;">Stainless pincet 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Homogenization Pestle</td>
			<td>Ieda Trading Corp.</td>
			<td style="width:315px;">9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mica</td>
			<td>Nisshin EM Co., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">LC23Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:315px;">BKA46472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices Corporation</td>
			<td style="width:315px;">Spectra MAX M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td>S011120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf Research&#174; plus</td>
			<td>3120000909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette Tips</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Plastic Petri Dish</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>1-7484-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Renilla Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega corporation</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Rhodamine B Isothiocyanate</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">283924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNase-Free Water</td>
			<td style="width:355px;">Qiagen</td>
			<td style="width:315px;">129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>199-01585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Surgical Blade and Handle</td>
			<td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Syringe Tip Cap</td>
			<td>Musashi Engineering Inc.</td>
			<td>NC-3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Weighing Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Zeta Potentiometer</td>
			<td>Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td>Zetasizer Nano-ZS</td>
			<td style="width:1235px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Uma matriz de cargas de ácidos nucleicos e de proteína foram introduzidas com sucesso em diferentes plantas utilizando os péptidos designados como vectores de entrega. Interacções electrostáticas entre cargas e péptidos catiónicos carregados negativamente, resultou na formação de complexos de transfecção que pode ser directamente infiltrada em folhas de plantas utilizando uma seringa sem agulha (Figura 1). (Formulações optimizadas empiricamente determinadas nestes estudos 21,23-26) para a transfecção de células de planta estão listados na Tabela 1, em que cada tipo de uma vasta gama de cargas entregues (pADN, dsDNA, dsRNA e proteína) é representado. Os diâmetros médios de todas as formulações à base de péptidos estavam no intervalo de aproximadamente 150-300 nm. Com base na análise de DLS, todas as formulações exibida polidispersidades de tamanho relativamente baixos, o que indica que os agregados de carga de péptido-formados têm uma distribuição de tamanho uniforme. As morfologias decomplexos entre o péptido e pADN (Figura 2A) ou proteína (Figura 2B), em mica, foram fotografadas por AFM. globulares complexos homogéneos foram observadas para ambos os combinações peptídicas-pADN e péptido-proteína, de acordo com os dados a partir de medições de DLS. Em termos de potencial zeta de complexos (Tabela 1), pDNA- e complexos dsDNA derivados tiveram cargas de superfície líquida negativa, enquanto complexos baseados em dsRNA tinha uma carga de superfície quase neutro. complexos de péptido-proteína, por outro lado, foram carregados positivamente. As eficiências de peptídeo-pDNA e formulações peptídeo-dsDNA em mediar a transfecção de A. thaliana ou N. benthamiana como sistemas modelo de plantas foram avaliados quantitativamente como qualitativamente. O ensaio de expressão do gene RLuc foi utilizado para a quantificação dos níveis de expressão do gene (Tabela 1), portanto, para este experimento ou pADNdsDNA que codifica o gene RLuc deve ser utilizado para complexação com os respectivos péptidos veiculares. Usando o (KH) 9 -BP100 / pDNA formulação, a entrega e expressão de pADN dirigido ao núcleo pode ser alcançado depois de um período de incubação de 12 h, com uma RLU / mg valor estimado de cerca de 1 x 10 5. Para entrega direccionada-mitocondrial e expressão de ADNp, uma combinação de péptidos, Cytcox- (KH) 9 e BP100, é necessário para a formação do complexo. Com o mesmo período de incubação de 12 h optimizada, no entanto, um nível muito mais baixo de transfecção (aproximadamente 1 x 10 3 RLU / mg) foi atingida. Enquanto isso, foi necessária período similar de incubação (12 h) e nível de expressão do gene (cerca de 1 × 10 3 RLU / mg) / gravadas para complexos baseados em dsDNA, também formulada usando o (KH) 9 -BP100 peptídeo. As avaliações qualitativas da expressão do gene foram realizadas por observação microscópica directa de folhas tratadas com complexos de preparEd usando pADN ou dsDNA que codifica o gene repórter da GFP. Em células transfectadas com complexos não-alvo de péptido-pADN, difundir fluorescência verde correspondente com expressão da GFP era claramente observado e verificou-se localizar no citosol (Figura 3A). diferenças distintas no padrão de localização de fluorescência da GFP foram evidentes nas células infiltradas com complexos de péptido-pADN-alvejado mitocondriais. Aqui, punctata fluorescência verde que colocalize com o corante mitocondrial era visível, confirmando a especificidade da expressão do gene exclusivamente no compartimento mitocondrial de células (Figura 3B). No caso de formulações de péptido-proteína, a conjugação da carga de proteína (ADH) para um fluoróforo (RhB) vai permitir a visualização da proteína entregue no compartimento intracelular. Dentro de um curto período de incubação de 6 horas, foi encontrada a proteína ADH-RhB (azul) para ser distribuído por todoo citosol e vacúolo das células infiltradas (Figura 3C). Enquanto isso, rápida e eficiente a infra-regulação da expressão de genes pode ser realizada em várias plantas que usam formulações de péptido-dsRNA. No primeiro experimento, folha A. thaliana foi infiltrada com peptídeo-dsRNA complexos para silenciar o gene chalcona sintase (CHS), responsável pela antocianina (pigmento vermelho) biossíntese sob condições de seca. A diferença na aparência de A. thaliana, sob as folhas normais (Figura 3D, um) e as condições de seca (Figura 3D, b) proporcionou um meio fácil avaliar CHS silenciamento utilizando a formulação de péptido-ARNcd optimizado (seta 1 indica a região infiltrada). No segundo experimento, os complexos de péptido-dsRNA foram infiltradas nas folhas de transgênicos A. thaliana que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP). Uma redução aparente na expressão YFP poderia ser visto nas células epidérmicas 9 h post-transfecção (Figura 3E, F). A eficácia da formulação na expressão de gene regulador de baixo em planta de um sistema diferente (choupo, 12 h pós-transfecção) foi também verificada (Figura 3G, H). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Figura 1: As formulações à base de péptido para a entrega de ácidos nucleicos e Cargas proteína em plantas vivas. Os péptidos transportadores concebidos consistem de policatiões conjugados com penetrante de células ou sequências de trânsito organelares. Policatiões permitem a ligação e / ou cargas de condensação de carga negativa, bem como de escape do compartimento endossomal seguinte internalização em células. A entrega de cargas em células e, subsequentemente, para organelos específicos é mediada por sequências penetrante celulares e sequências de trânsito organelares, respectivamente. Vários cargas que poderiam ser successfully entregue na planta incluem ácidos nucleicos, tais como pADN, ADNcd e ARNcd, bem como proteínas modelo, como albumina de soro bovino (BSA), álcool desidrogenase (ADH) e de citrino (uma variante de proteína fluorescente amarela). Moléculas bioactivas são capazes de formar complexos de transfecção com conjugados peptidicos através de interacções electrostáticas, que são introduzidos em folhas de plantas pela infiltração de uma seringa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Figura 2: as morfologias das formulações à base de péptido. (A) AFM amplitude imagem do (KH) 9 -BP100 formulação / pDNA em N / P 0.5. Altura da imagem de AFM de (BP100) 2 K 8 / formulação ADH em rati molar (B)o 10. Reproduzido com a permissão de fontes publicadas 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Figura 3: Avaliação da transfecção de microscópico Eficiências utilizando formulações à base de péptido optimizada. (A) a expressão citosólica GFP (verde), claramente distinto da autofluorescência cloroplasto (vermelho), foi observado nas células de mesófilo esponjosos de A. thaliana infiltrada com folhas (KH) 9 formulação -BP100 / pDNA (N / P de 0,5; 12 hr ). (B) a expressão de GFP (verde) foi detectado na mitocôndria (vermelha) nas células da epiderme da folha de A. thaliana infiltrada com Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulação pADN (N / P de 0,5 para cada peptídeoe; 12 h). imagens ampliadas de mitocôndrias com expressão GFP são apresentados no painel da direita extrema. (C) A entrega do ADH-RhB (azul) para as células mesofílicas esponjosos de A. thaliana folhas mediada por (BP100) 2 K 8 a uma razão molar de péptido / proteína de 10, visualizado 6 horas após a infiltração. (D) da folha de A. thaliana antes (a) e após (b) o tratamento com (KH) 9 -BP100 / formulação ARNcd (razão molar 2; 48 h), o que resultou na supressão da via de biossíntese de antocianina. Uma formulação semelhante contendo GFP5 ARNcd foi infiltrada na folha como controlo negativo (c). As setas 1 e 3 indicam a área infiltrada enquanto setas 2 e 4 indicam a área não infiltrada dentro da folha. (E) A. thaliana folhas que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) e (F) a fluorescência de YFP diminuída seguinte com infiltração<html> (KH) 9 -BP100 / formulação ARNcd (razão molar 2; 9 h). (G) As folhas de choupo transgénicos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) e (H) a diminuição da YFP fluorescência após infiltração com (KH) 9 formulação -BP100 / ARNdc (razão molar 2; 12 h). Reproduzido com permissão de fontes publicadas 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Figura 4: Variação de Peptide-to-DNA (N / P) e os efeitos sobre as propriedades biofísicas de complexos. Com o aumento da razão de péptido para ADN, as formulações à base de péptidos diminuir de tamanho, enquanto a sua transição valores de potencial zeta de negativo para positivo./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabela 1: Caracterização e avaliação de várias formulações com base em peptídeos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a> <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabela 2: Comparação de tecnologias existentes DNA de entrega baseado em Peptide e outros para plantas intactas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

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Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K visualizações.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

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Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can potentially increase risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Electroencephalography (EEG) and electrocardiography (ECG) are widely used clinical diagnostic tools to monitor for abnormal brain and cardiac rhythms in patients. Here, a technique to simultaneously record video, EEG, and ECG in mice to measure behavior, brain, and cardiac activities, respectively, is described. The technique described herein utilizes a tethered (i.e., wired) recording configuration in which the implanted electrode on the head of the mouse is hard-wired to the recording equipment. Compared to wireless telemetry recording systems, the tethered arrangement possesses several technical advantages such as a greater possible number of channels for recording EEG or other biopotentials; lower electrode costs; and greater frequency bandwidth (i.e., sampling rate) of recordings. The basics of this technique can also be easily modified to accommodate recording other biosignals, such as electromyography (EMG) or plethysmography for assessment of muscle and respiratory activity, respectively. In addition to describing how to perform the EEG-ECG recordings, we also detail methods to quantify the resulting data for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability, which we demonstrate in an example experiment using a mouse with epilepsy due to Kcna1 gene deletion. Video-EEG-ECG monitoring in mouse models of epilepsy or other neurological disease provides a powerful tool to identify dysfunction at the level of the brain, heart, or brain-heart interactions.

Here, we present a protocol to record brain and heart bio signals in mice using simultaneous video, electroencephalography (EEG), and electrocardiography (ECG). We also describe methods to analyze the resulting EEG-ECG recordings for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability.

Simultânea vídeo-EEG-ECG de monitoramento para identificar a disfunção Neurocardiac em modelos de Mouse de epilepsia

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

Um pipeline de bioinformática para analisar com precisão e eficiência os transcriptomas de MicroRNA em plantas

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...