The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף

אורגניזם המודל C. elegans מספק מערכת ניסיונית חזקה. זה קל לתרבות ומייצר צאצאים זהים גנטי בשפע עם מחזור חיים 3.5 יום מביצה ללהתרבות מבוגר (דרך שלבי זחל לנוער L1 עד L4). בשל גודלו הקטן, זה יכול להיות מבוגר בנוחות ב96-גם צלחות, להקל הקרנת מתחם. אנו מציגים פרוטוקול הקרנה פנוטיפי המבוסס על זנים של ג elegans הפועלים כin vivo חיישנים של רמות אנרגיה. 14 הפרוטוקול ישים לכל מעבדה, אם כי נדרש luminometer צלחת 96-היטב וקבינט סטרילי. זה חשוב כדי למנוע זיהום במבחנים על ידי שימוש בטכניקת מעבדה טובה. אם עובד באופן ידני, את המספר המרבי של צלחות נמטודות השגה הוא 13 לכל ניסוי המאפשר בדיקה של 2x צלחות תרופת 96-היטב וכולל שתי צלחות רכב. נציגי תוצאות מוצגות למורכבת המיטוכונדריה אני מעכב rotenonדואר, גנרטור paraquat סופראוקסיד, oxaloacetate ביניים מחזור חומצת לימון וארבע תרכובות עם פעילות מעכבת גחלילית בלוציפראז ידועה. שתי התרכובות הראשונות הובילו לירידה בפליטת אור כפי שחזו ואילו oxaloacetate הוביל לשיפור, עשוי לנבוע מדור גדול יותר של ה- ATP. ערכות נתונים oxaloacetate גם להדגים את השונות המהותיות בניסויים מבוססים על לוציפראז גחלילית ככתב. מינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים הם מומלץ לוודא חוסן של תגובות לתרכובות בלתי ידועות. העיכוב של פעילות לוציפראז גחלילית היה מזוהה עם assay במבחנה באמצעות ערכה מסחרית. 3 אחד המתחמים הביאו לעלייה משמעותית בקרינת GFP בקנה אחד עם מעכב הגדלת הרמות של גחלילית בלוציפראז באמצעות קשירת האנזים של לוציפראז פעיל מתויג GFP אתר, והופך אותו ליותר יציב. 15 במקרים מסוימים(לא במקרה הספציפי הזה) זה יכול להוביל לרמות גבוהות של פליטת אור כאשר המעכב שנעקר על ידי מצע עודף. 15 הוא, לכן, חשוב שלא לפרש את התוצאות בטעות מתרכובות שאינטראקציה עם אנזים הגחלילית כירידה או עליית רמות ה- ATP / פונקציה של המיטוכונדריה. שינויים באות הארה לעתים קרובות למדי לתאם עם מדידות נוספות של בריאות כגון תנועה, התפתחות וצמיחה. כדוגמא, מתחם הוא מעכב לוציפראז חשוד אם ירידה דרמטית באות פליטת אור מזוהה אך תולעים הם נבדלים מבקרות על ידי תצפית מיקרוסקופית. עלייה בקרינת GFP, לא מוסברת על ידי גידול או autofluorescence מתחם, יכולה גם להצביע על מעכב. מספר מעכבי לוציפראז 15 ידוע וכבר נכנס לPubChem. לכן במקרה הראשון, זה תרגול טוב להתייעץ מידע על מעכבי לוציפראז מוחזקים על ידי PubChem; אחרי testing של השפעות המתחם במבחני חוץ גופייה עם האנזים המטוהר 3 ו / או אישור של השפעות על תפקוד המיטוכונדריה ידי אמצעים נוספים. 16,17 מדידות הקרינה GFP מאפשרות זיהוי של רמות לוציפראז גחלילית (וזיהוי הפוטנציאל של כמה מעכבי אנזים בלוציפראז כפי שפורט לעיל) מה שהופך את מקרה חזק למדידת נקודת קצה זו לצד פליטת אור במידת האפשר. נורמליזציה של קריאות פליטת אור לGFP היא גם אמצעי לטיפול חשבונאי בשינויים במספרי תולעת בין בארות (אם כי זה יכול גם להיות מושגת על ידי הכללה של משכפל טכני מרובה). לרגישות רבה יותר, חשוב להפחית הקרינה רקע מקריאות. הפרוטוקול מעריך את התרומה של ההשעיה החיידקים לקרינת הרקע, לעומת זאת autofluorescence נמטודות לא היווה (הגבלה של assay הנוכחי, קריטית במיוחד לכל סטו הזדקנותבהתחשב בכך שמת עליות autofluorescence נמטודות עם גיל). גם autofluorescence של תרכובות מבחן צריך להיות מוערך במקביל. הנורמליזציה GFP הייתה נראית הכרחית שבו חוקרים מבקשים להתאים את הפרוטוקול כדי להשוות בריכות ATP סלולריות במוטציות גנטיות שונות או אחרי ההשתקה של גנים שונים, במטרה לשלוט על כל הבדלי מתח ברמת הביטוי של transgene פליטת אור. פרמטרים קריטיים בפרוטוקול כוללים את השלב ההתפתחותי שבו חשיפה היא יזם, אורך החשיפה, וקבלת מספרים דומים של נמטודות בבארות שונות. חשיפה יכולה להתחיל בכל שלב של התפתחות של נמטודות, אולם שלב L3 ומעלה עדיפה. משלב זה והלאה, נמטודות תלויה בזרחון חמצוני לפיתוח לבגרות, כפי שמעיד גידול מאוד משמעותי בתוכן mtDNA, צריכת חמצן ורמות ה- ATP. 18,19,20 הפרוטוקול הנוכחי יוזם ירידייור בשלב L4. הסיבה לaliquoting נמטודות ל96-גם צלחות רק בשלב זה (ולא כאשר הם סיפקו ראשון עם מזון בשלב L1), היא שלמרות צלחות מונחות בתאים לחים כדי למזער אידוי, מידת האידוי עדיין מתרחשת ב החממה שלנו רועד, נראית כטיפין קטנות מאוד להרכיב על העפעפיים (זה לא יכול להיות בעיה עם חממות רועדות אחרות). על ידי aliquoting נמטודות לצלחות ממש לפני התוספת של תקני סמים, ריכוז התרופה בפועל אינו מושפע מכל וריאציה קטנה בנפח בשל התאדות. טעינת צלחת נמטודות עם רכב היחיד היא שימושית כדי לבדוק שנמטודות חולקו באופן שווה בין בארות. כל הבדלים מובהקים לרכב רק צלחת יהיו מעידים על טכניקה לקויה מחלק נמטודות לבארות. אורך החשיפה הוא גורם חשוב לשקול. אם השפעות על מצב אנרגיה באופן עצמאי של צמיחה של עניין, פרוtocol יכול להיות שונה כדי להתאים חשיפות קצרות יותר (מתגובות כמעט מיידיות ל, למשל, 2 שעות). מצד השני, כניסה של תרכובות לג רקמות elegans עשויות לקחת קצת זמן. לדוגמא נדרשות 12-24 שעות כדי להשיג ריכוזים פנימיים מרביים של רזברטרול ו5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUDR). 21 לכן, חשיפה ארוכה יותר (18 עד 24 שעות) עשויות להיות מוצדקות על מנת למקסם את רמות חשיפה. זמן החשיפה צריך להיות מוגבל לפעמים שאינם מאפשרים רמות משמעותיות של רבייה להתקיים בבאר. אנו ממליצים שהזמן התפתחותי הכולל של נמטודות נשמר תחת 66-67 שעות. למרות נוח, נמטודות הם מעוברת עד אז ויזמה egglaying. עם זאת מצאנו קריאות פליטת אור מהכנות ביצה להיות זניח (לא מוצג). ביטוי transgene מונע sur-5 האמרגן מזוהה ראשון רק 01:58 שעות וחצי לאחר הפריה בשלב 100 התא 22 וגקליפת הביצה hitinous עשויה להגביל כניסה של luciferin. אחרים מצאו כי ביצי embryonated לא תרמו באופן משמעותי לחילוף החומרים של מבוגרים הרה להולדת. 23 עם זאת, תנאים המאפשרים ייצור צאצאים משמעותי יש להימנע. אם העדיף, לוח הזמנים הניסיוניים יכול להיות מוזזים לאחור: יש לנו יזמנו בעבר חשיפה לרעלן סביבתי בשלב (36 שעות) הזחל מאוחר L3 וביצעו מדידות פליטת אור וGFP ב 55 שעות 2 רקעים לחלופין, גנטיים שתנאים סטריליים. יכול לשמש כדי למנוע ייצור צאצאים, כמו למשל FER-15 (B16) השני; FEM-1 מוטציה כפולה IV (hc17) אשר יכול להישמר על 15 מעלות צלזיוס, אך הוא סטרילי בC ° 25. 24 השימוש בFUDR לגרום לעקרות אינו מומלץ כמו זה יכול בעצמו משפיע על חילוף חומרים נמטודות. 25 assay יכול גם להתבצע בזנים עם העור הקרני חדיר יותר כגון פסד של funct החלקייון אוטובוס-8 מוטציות שהם multidrug רגיש בשל להגדיל חדירות של תרופות. 26 זה יקלו חשיפות וריכוזים נמוכים מתחם קצרים יותר. התנאים להוספת luciferin לנמטודות אלה עשויים גם צריכים התאמה כלומר, 1% DMSO ו0.05% Triton-X100 במאגר הארה לא ייתכן שיידרשו כדי לשפר את זמינות luciferin. הפרוטוקול משתמש 1% DMSO כרכב למסירת מתחם. למרות שאינו קטלני, ריכוז זה של DMSO יש כמה תופעות ביולוגיות כפי שכבר דנו בפרסום קודם. 3 רבים של ספריות תרופה הזמינות ערוכים 100% DMSO, בריכוזים שיהיו מתאימים למבחנים מבוססי תאים לאחר הדילול של רכב 0.1%. ריכוזים גבוהים יותר מתחם נדרשים לעורר תגובות בג elegans בהשוואה לתאים אנושיים, כך שלעתים קרובות לא ניתן לערוך מבחני בנמוכים מ 1% DMSO. שוב, השימוש בזנים עםיותר העור הקרני חדיר עלול להוביל לבדיקה עם ריכוזים נמוכים של רכב. ריכוזים של% גבוהים יותר מאשר 1 DMSO אינם מומלצים. זמן דגירה סט עם luciferin לקראת קריאה צריך להיות דבק. כפי שניתן לראות בעבר, הארה מגיעה לרמות המרביות שלה בתוך דקות השניה לאחר הוספת luciferin, שנותר יציב יחסית ל5 דקות הראשונות, ואחריו ירידה הדרגתית איטית בהארה על 30 דקות הבאות 1. יכולים להתבצע תגובות הקינטית לכימי מסוים בשלב ראשוני זה של 30 דקות אחרי מחלק ראשוני של luciferin. הפרוטוקול כרוך צעד רעב הבא אוסף של ביצים כדי להשיג סנכרון של אוכלוסיית נמטודות. אנו ממליצים סנכרון של אוכלוסיות מבחן נמטודות מאז שלבי התפתחות שונים נבדלים ברמות ה- ATP סלולריות ועשויים להגיב באופן שונה לתרכובות הבדיקה. על ידי ביצוע הרעב במלא Sבינוני בניגוד לM9, נמטודות הבקיעה מסופקות עם מקור פחמן (אתנול), כך זחלים שלא לפתח אך לא מורעבות לחלוטין. 27,28 זה גם הוכח שנעצר L1 של דרוכים לתגובה מהירה למזון ו שיעור L1 נורמלי צמיחה מושגת בתוך 3 שעות לאחר אוכל הופך להיות זמין. 29 עם זאת, האפשרות שצעד הרעב עשוי לשנות את חילוף החומרים של ג לא ניתן לשלול elegans. 30 מסיבה זו באורך של רעב לא יעלה על 24 שעות (18 שעות מספיקות לסנכרון). ייתכן שיש לי מעבדות מסוימות את האפשרות של שימוש Biosorter קופאס לסנכרון גיל עוקף את צעד הרעב לגמרי. ייתכן שיש לי מעבדות אחרות העדפה להרחבת אוכלוסיית נמטודות על תקשורת מוצקה (צלחות NGM עם OP50) לפני ההלבנה (שלב 3.1) וזה יעבוד היטב גם. אנו משתמשים במדיום S במהלך חשיפת מתחם כמדיום סטנדרטי עבור culturing נמטודות, however תקשורת אחרת ניתן לבחור, למשל בינוני K או די מים קשים EPA משמש לעתים קרובות ללימודי ecotoxicological. 31,32 הפרוטוקול מספק אמצעי לסינון ולזהות מועמדים לבדיקות נוספות במונחים של ההשפעות על תפקוד המיטוכונדריה. בשלב הסינון ראשוני סביר להניח כי כמה תרכובות יהיו כבר החמיצו בשל נבדק רק אחד ריכוז, לכן מסכי תרופה לא צריכים להיחשב ממצה. יכולים להיות מאומתים על ידי להיטי השימוש בטכניקות להערכת היבטים שונים של תפקוד המיטוכונדריה לצריכת חמצן דוגמא, ג elegans זנים עם מיטוכונדריה GFP להביע, כתמים לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה ו / או מדידות ROS. 16,33,34 המשמעות הגדולה ביותר של המתודולוגיה היא להיות אמצעי לסינון מספר רב של תרכובות ו / או תנאים ברמת האורגניזם רב-תאית, וחשוב מכך כדי להיות מסוגל לנצל את הנְהִילוּת הגנטית דואר של ג elegans לחקור מנגנוני פעולה. הטכניקה עשויה לעזור להאיץ ולמצוא נתיבים חדשים לגילוי של תרכובות ויעדים מעניינים. זה שחזה כי השילוב של החיישן עם רקע גנטי הקשורים למחלות בבני אדם להקרנה של ספריות מתחם בהקשר רלוונטי מחלה יש הרבה מה להציע.

המטרה הכוללת של הליך זה היא הכימות המהיר של מצב האנרגיה של ג elegans in vivo עם נוף לשימוש זה כנקודת סיום בהקרנת מתחם. הרציונל מבוסס על הביטוי המהונדס של לוציפראז הגחלילית בג נמטודות elegans 1-3 באמצעות פלסמיד (1 pSLGCV <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> האנזים בלוציפראז הוא התמזגו לGFP חלבון פלואורסצנטי הירוק ובא לידי ביטוי בכל מקום וconstitutively בציטופלסמה (peroxisome לוציפראז מיקוד אות הוסר). זה מוביל לפליטת אור כאשר luciferin המצע מסופק אקסוגני. כתולעת היא שקופה, אור ניתן למדוד בluminometer כיחידות יחסי אור (RLU). דלקי ATP סלולריים תגובת פליטת אור וזמינותו קובעים את רמות האור מיוצרות. כתוצאה מכך, luminometry מציע convenienלא אומר להערכת רמות ה- ATP היחסית ועל ידי פונקציה של המיטוכונדריה הרחבה, מאז ייצור ATP מתרחש בעיקר במיטוכונדריה. קשר בין רמות תפקוד ופליטת האור של המיטוכונדריה כבר הוכיח בעבר באמצעות ההשתקה של גני המיטוכונדריה הובלת אלקטרונים שרשרת ונלווית תפוקת אור מופחתת. 1 זני פליטת אור שנוצרו היו מיועדים PE254 (feIs4) ו PE255 (feIs5) 1 (ראה רשימת חומרים) וניתן להשתמש בם לסירוגין. 3 מספר המחקרים מנוצל זני חיישן אלה לדווח על רמות ה- ATP הסלולריות in vivo לאחר חשיפה לכימיקלים xenobiotic שונים כגון אזיד הנתרן 1, 2 קדמיום, ביוב בוצת תמצית 3, 5&#39;-fluoro-2-deoxyuridine 6, וnitrosamine טבק ספציפי 7. גם הזנים היו שימושיים כדי לפקח על השפעות של חשיפה לקרינת אולטרה סגולה C <sעד&gt; 8 ואת ההשפעות של שיבוש תפקוד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. 1.9 גרסה מוקדמת של חיישן הארה המבטא את הגן בלוציפראז ללא היתוך GFP (PE39) שימשו גם בחקירת השפעות של מתכות כבדות ושל דרכי הנשימה . Uncoupler 10 זני PE254 וPE255 לשאת לוציפראז: הקרינה היתוך וGFP GFP הוצגה להגדיל באופן יחסי עם מסת נמטודות, מציע אמצעי נוח לנורמליזציה של ערכי הארה 6,9 ההשפעות של סכום ההפרש של תולעים בכל טוב יכולות להיות גם. נלקח בחשבון על ידי כולל משכפל טכני מרובה בassay (מינימום של 5 בארות לכל מצב). 3 הפרוטוקול מציע את האפשרות של ניטור vivo של רמות אנרגיה (בניגוד ליותר מבחינה טכנית מייגע במבחנה קביעות ATP) מאפשר הקרנת מתחם ולמקם מחדש בהקשר הפיזיולוגי של כל muהאורגניזם lticellular. ההליך יכול להתארך למגוון של רקע גנטי על ידי חציית transgene המשולב chromosomally לזנים מוטנטים זמינים ו / או על ידי השתקת גנים על ידי התערבות RNA; כך, תוך ניצול מלא של ג elegans כאורגניזם מודל. השיטה אמורה לעזור להפחית כישלון בשלב מאוחר של מועמדי סמים בשל רעילות המיטוכונדריה ולתרום תרומה לצמצום ניסויים בבעלי חיים גבוהים יותר.

<table><tbody><tr><td>Orion II Microplate Luminometer</td><td>Berthold Detection Systems</td><td></td><td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>FLx800 fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>Ks 130 basic shaking platform</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Refrigerated incubator shaker</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>with eppendorf rotor A-4-44&amp;nbsp; (for 50/15&amp;#160;ml tubes)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Serological pipette</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Microscope slides</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Sterile spatula</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>for weighing out chemicals</td></tr><tr><td>0.22 mM Millex GP filters</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well assay plate</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Black plate clear bottom with lid</td></tr><tr><td>Nunc 96 well assay plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>White plate with lid</td></tr><tr><td>Reservoir reagent 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1</td></tr><tr><td>Storage box/damp chamber</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td></tr><tr><td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Store in aliquots at 4&amp;#160;&amp;deg;C,&amp;nbsp; seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td></tr><tr><td>D-Luciferin, potassium salt</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, keep at -20 &amp;deg;C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Purity 99.99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute to 10% in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; bioluminescent strains</td><td>Author&#039;s own laboratory</td><td>PE254, PE255</td><td>contain integrated arrays &lt;em&gt;feIs4&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)]&lt;/em&gt; respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of &lt;em&gt;luc::GFP&lt;/em&gt; by fluorescence microscopy (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pick 15 worms) every now and then.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

נציגי תוצאות כדי להמחיש את השיטה התקבלו לrotenone (איור 1), paraquat (איור 2), oxaloacetate (איור 3), ו 4 תרכובות שהרימו מעכבים כגחלילית בלוציפראז במהלך ההקרנה של ספריית תרופת 13 (איור 4). החשיפה לסמים החלה בשלב L4 בכל המקרים, אבל ניסויי חשיפת paraquat היו התחילו ב 41 שעות לאחר האוכל סיפק ראשון לנמטודות לעומת 45-46 שעות לתרכובות האחרות. הפרוטוקול מאפשר למידה של גמישות בבחירת הזמן לחניכה של החשיפה לסמים ואורך החשיפה. צריכים להיות דבקות פעמים עם זאת, למטרות הקרנה, מוגדרים נבחרו פעם אחת, לשחזור בין ניסויים. נקודות קצה יש למדוד על ידי זמן התפתחותי 66-67 שעות על מנת למנוע הטלת ביצים נרחבת ובקיעה של צאצאים בבארות. הנחיות לתזמונים מסופקות בTתוכל 1. Rotenone, מורכב המיטוכונדריה אני מעכב, הופחת פליטת אור לאחר שני חשיפות קצרות יחסית (שעה 2) ועוד (24 שעות) לטווח של ריכוזים (איור 1). במקרה זה, אין מדידות GFP נלקחו, אך מספר החזרות טכניות בשימוש (n = 6) מספיק כדי לאזן את כל הבדלים במספרי תולעת בין בארות 3. חשיפת 24 שעות היא חלון של זמן שבו נמטודות לגדול, ופיתוח איטי יותר כתוצאה מעיכוב אני מורכב היה צפוי לתרום לירידה בפליטת אור. זו אושרה על ידי תצפית ויזואלית תחת stereoscope עם התפתחות מאוחרת ראתה, במיוחד בריכוזים של 20 מיקרומטר ומעלה; בנוסף כמה קטלני היה שם לב מ -40 מיקרומטר (תצפיות איכותיות לא לכמת). לא קטלני נצפה לאחר חשיפת 2 שעות אבל השפעות על תנועת תולעת נראו. ירידה חדה בפליטת אור ביחס להביא עלינו כיבוש בקרותrred בריכוז הנמוך ביותר של 2.5 מיקרומטר rotenone נבדק, שלתופעות לא מזוהות בקלות על ידי תצפית ויזואלית מהירה ב -2 חשיפת HR. ירידה בפליטת אור זה עולה בקנה אחד עם ATP הסלולרי מופחת. עיכוב מקסימאלי הושג עם הריכוז הנמוך ביותר של rotenone משמש (2.5 מיקרומטר) מצביע על כך שצריכים להתבצע בכל ניסויים הבאים במיוחד מיקוד rotenone בין 0 ל 5 מיקרומטר [טווח הריכוז 0-160 מיקרומטר נבחר כחלק מהשוואה עם תרופות אחרות תחילה זוהה כבעלי השפעה משמעותית על 10 מיקרומטר (שיפורסם במקום אחר)]. Paraquat קוטל העשבים משפיע על תפקוד המיטוכונדריה דרך גידול של מיני חמצן תגובתי. הנה, אנחנו מדגימים את השפעתה על פליטת אור של ג PE254 מתח elegans לאחר חשיפה למגוון רחב של ריכוזים למשך 24 שעות (איור 2). כזן נושא לוק :: היתוך GFP, הקרינה GFP הייתה also נמדד כאמצעי לנורמליזציה. 6,9 Paraquat ירד פליטת אור, הקרינה GFP ופליטת אור מנורמלת באופן משמעותי. מבחן פוסט הוק-Dunnet הצביע על כך שהריכוזים של paraquat עם הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה ברכב היו 4 ו -8 מ&quot;מ לפליטת אור ופליטת אור מנורמל, כמו גם 2 מ&quot;מ לפליטת אור מנורמל. הריכוז רק הפחתת הקרינה GFP באופן משמעותי היה 8 מ&quot;מ, ריכוז שבו השפעות הצמיחה והתולעת המתה מדי פעם נראו (תצפיות איכותיות). הירידה בפליטת אור (ופליטת אור מנורמלת) הייתה גדולה יותר מזה של הקרינה, עולה בקנה אחד עם הירידה בתפקוד והשפעות על ייצור ATP במיטוכונדריה. Oxaloacetate ביניים מעגל חומצה הציטרית נבדק על ג PE254 מתח elegans בריכוז אחד של 8 מ&quot;מ, הוביל לעלייה בפליטת אור (איור 3). לא לזרוח GFPמדידות NCE התקבלו או תצפית חזותית נוספת שביצעה; עם זאת, כגון תגובה לריכוז יחיד הייתה זוכה לחשיפה נוספת מאשרות לטווח של ריכוזים, ותצפיות מפורטות יותר של השפעות. שיפור של פליטת אור על ידי המתחם הזה הוא לא מפתיע כפי שהוא יכול להיות הניח להוביל לפעילות גדולה יותר של מעגל החומצה הציטרית, עם ייצור סופו של דבר גדול יותר של ה- ATP (בכל זאת זה יהיה רצוי כדי לשלוט על כל השפעות על רמות לוציפראז על ידי הערכת הקרינה GFP בניסויים הבאים). ערכות נתונים oxaloacetate מוצגות חושפים את מידת ההשתנות בתגובה ראתה בניסויים מבוססים לוציפראז. מניסיוננו שונות זו תכונה של מערכת הבדיקה במיוחד לתנאי חשיפה פחות מזיקים. DDD00001434 התרכובות מעכבות גחלילית בלוציפראז, DDD0001477, DDD00000635 וDDD00023047 נבדקו הן במבחנה על ידי מסתכל על השפעות על puאנזים אחוז האימה וin vivo באמצעות ג לוק elegans: GFP להביע מתח. לא היו שום ראיות לכך שכל אחד מהתרכובות שנבדקו גרם למות נמטודות בתנאי החשיפה. כל 4 התרכובות השפיעו על הפעילות בלוציפראז במבחנה בריכוזים שנבדק 2 25 ו 100 מיקרומטר (איור 4 א). DDD00001434 נהרג הפעילות של לוציפראז המטוהר כמעט לחלוטין, אשר סיפק הצדקה אמינה לירידה הגדולה בin vivo פליטת אור (איור 4). אמנם, במבחנה ובמבחני vivo לא להשוואה ישירה, התגובה לDDD00023047 הייתה דומה בשני מבחני. DDD0001477 וDDD00000635 גרמו לירידה גדולה יותר בvivo מאשר במבחנה. תרכובות אלה נמסרו לתולעים חיים 22 שעות לפני מצע luciferin, ותוצאות עשויות לשקף שהם לא בקלות שנעקרו מהאתר הפעיל לוציפראז כאשר luciferin הפך available. לחלופין, DDD0001477 וDDD00000635 עלול להיות השפעה נוספת על רמות ה- ATP סלולריות. זה היה צריך להיות מוערך על ידי אמצעים שאינם כרוכים בלוציפראז גחלילית. של פתק היה השיפור החזק של אות ה- GFP בתולעים חיים החשופים למתחם DDD00000635. זה יידון בהמשך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> איור 1. מורכב המיטוכונדריה אני מעכב rotenone ירד מעמד האנרגיה של ג elegans כפי שנמדד על ידי פליטת אור של PE254 מתח. תולעי שלב מסונכרן L4 (45-46 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשף ל0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ו -160 מיקרומטר rotenone בDMSO 1% ל -2 שעה (קצרה) או 24 שעות (חשיפה ארוכה) קריאות קודמות של פליטת אור בהתאמה וב48 69 שעות של פיתוח תולעת לאחר סיפק מזון. פליטת אור (יחידות אור יחידה יחסית, RLU) באו לידי ביטוי כאחוז מהרכב (1% DMSערכי O). ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני בכל ריכוז rotenone (n = 6). כל הריכוזים שנבדקו הביאו הבדל מאוד משמעותי מבחינה סטטיסטית ביחס לשליטה ברכב (p &lt;0.001). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> איור 2. paraquat לחץ חמצוני ירד מעמד האנרגיה של ג PE254 elegans המתח באופן תלוי ריכוז (שנמדד על ידי פליטת אור). תולעים מסונכרן L4 שלב (לנוחות במקרה זה ב 41 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשף ל0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 או 8 paraquat מ&quot;מ עבור 24 שעות. הקרינה GFP (יחידות יחידה יחסית הקרינה, RFU) שימשה כדי לנרמל את נתוני פליטת אור (יחידת RLU), שני נקודות הקצה שהושגו בפיתוח משאבי אנוש 65. הנתונים באים לידי ביטוי כאחוז מפקדים (1% DMSO). ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני(N = 5 לריכוזים שונים; n = 18 עבור פקדים). כיוון אחד ANOVA: *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> איור 3. oxaloacetate ביניים מעגל חומצה הציטרית (8 מ&quot;מ) משופר פליטת אור של ג PE254 elegans מתח. תולעי שלב מסונכרן L4 (45-46 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשפו למוכנים טרי 8 oxaloacetate מ&quot;מ במשך 18 שעות ± 30 דקות. פליטת אור (RLU יחידה) הייתה לקרוא בזמן ההתפתחותי של שעות 63.5 שעות ± 1 ובאה לידי ביטוי כאחוז מהשליטה ברכב (DDH 2 O). עמודות שונות מייצגות ערכות נתונים שונות של 8 חזרות טכניות הוקצו 96 צלחות גם שונות בתוך אותו הניסוי. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 8). 2 דרך-ANOVA עם &#39;קבע&#39; ו &#39;ריכוז&#39; כגורמים: ̵6; &#39;p&gt; 0.05,&#39; סט עמ הריכוז &#39;&lt;0.001 וטווח האינטראקציה p&gt; 0.05. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> איור 4. בדיקה של תגובות ל4 תרכובות מספריית דנדי גילוי תרופות מתחם 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 וC4: DDD00023047) עם פעילות מעכבת ידועה על הארה לוציפראז גחלילית. (א) השפעה של תרכובות בפעילות של לוציפראז גחלילית מטוהר (נמדד כיחידות אור, RLU), מבוטא באחוזים של שליטה ברכב. ערכת CLSII פליטת אור ATP (רוש, מנהיים, גרמניה) שימשה על פי הוראות עם אותה הכמות של אנזים בלוציפראז aliquoted לבארות (96-W לבןell צלחות microtiter). ATP סופק בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו1 μl של מתחם (ריכוז סופי הצביע) או DMSO (1%) נוספו. אות הארה שולבה במשך 10 שניות. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 4). ניתוח: כיוון אחד ANOVA; * P &lt;0.05 או *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב. הבדלים בין 25 ל 100 מיקרומטר משמעותיים ביותר עבור C1 (DDD00001434; p &lt;0.001), ומשמעותי עבור C2 ו- C3 (בהתאמה DDD0001477 וDDD00000635; p &lt;0.05). (ב) בvivo מדידות של פליטת אור, פליטת אור מנורמלת לקרינת GFP ו הקרינה GFP של ג PE254 elegans מתח בזמן התפתחותי 67 שעות לאחר חשיפה לתרכובות מבחן במשך 22 שעות. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 8). ניתוח סטטיסטי (דרך-ANOVA אחת) בוצעה על הנתונים אספו מ3 ערכות נתונים (3 xn = 8). * P &lt;0.05 או *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב בהתאמה. בידולCES בין 25 ל 100 מיקרומטר רק מובהק סטטיסטי (p &lt;0.05) לפליטת אור מנורמלת בעקבות החשיפה לC4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שעה ביום </td><td> יום 1 </td><td> יום 2 </td><td> יום 3 </td><td> יום 4 </td><td> יום 5 </td><td> יום 6 </td><td> יום 7 </td><td> יום 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 4 </td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tד&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> שלב 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> סקירת טבלת 1. צעדי פרוטוקול להתבצע בכל יום של ניסויי נמטודות (סעיף 3) והציעה תזמונים.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K Views.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Video: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Behavior

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medicine

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

כימות מיטופגיה ב- C. elegans וקו תאים של סרטן הכבד

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

מחבר זרקור: זיהוי מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

Screenable

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים