The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen (Sterilbank) und mit vorab sterilisierten Materialien (durch Autoklavieren 126 ° C, 11 min). Eine LB-Platte mit ausgestrichen E. coli OP50 bei 4 ° C gehalten wird benötigt, streifen out auf frische LB-Platten zu restreak jeden Monat. 1. Die bakterielle Food (Escherichia coli OP50) Herstellung <ol><li> Tag 1 beimpft 2 x 5 ml LB in zwei Universal-Flaschen mit einer Einzelkolonie von E. coli OP50 und Platz im Schüttelinkubator bei 37 ° C (220 rpm) für 8 h. </li><li> Nach 8-stündiger Inkubation, verwenden Sie 2 ml E. coli OP50 LB-Kultur zu je 3 x 200 ml LB zu inokulieren Ort Kolben in Schüttelinkubator (220 UpM) O / N (17 Stunden) bei 37 ° C. </li><li> Wiegen 20 x 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schreibgewicht auf dem Schlauch. </li><li> Tag 2. Mit einem serologischen Pipette aliquote 30 ml O / N E. coli OP50 Kultur in das vorgewogen Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 7.741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand, halten Sie den Schlauch mit Deckel umgekehrt auf und lassen Sie es für einige Minuten stehen lassen. Mit einer Pipette zu entfernen überschüssiges Überstand, der im Deckel angesammelt haben kann. Wiegen des Rohres und berechnet das Gewicht des Pellets. </li><li> Berechnen die benötigt wird, um eine Suspension von 30 g / L bereitzustellen, und markieren dieses Volumen an der Rohrvolumens. Datum, Bezeichnung und Ort Röhrchen bei -20 ° C für den Einsatz innerhalb von 1-3 Monaten oder bei - 80 ° C, wenn die Speicherung länger als 3 Monate. </li><li> Bereiten Bakteriensuspension für den Anbau von Nematoden; ermöglichen Bakterienpellet auftauen und fügen erforderliche Volumen des S Komplettmedium 11,12 in jedes Röhrchen, Vortex vorsichtig, um Pellet resuspendieren, Pool Inhalte der verschiedenen Rohren, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Arbeiten unter sterilen Bedingungen. </li></ol> 2. Herstellung von Drug Standards in einer 96-Well-Plattenformat HINWEIS: Bei Verwendung eines Medikamentenbibliothek, sind Drogenplatten an einem einzigen bereitgestelltKonzentration der Verbindung in DMSO. Primärscreening werden Verbindungen in einer einzigen Konzentration zu testen. Anweisungen für die Vorbereitung der Drogenplatte für den Zweitverbindung Tests in einem Bereich von Konzentrationen zwischen 0 bis 160 &amp; mgr; M, nachdem eine statistische Signifikanz bei 10 uM ausgewählt. Die folgenden Schritte können angepasst, um andere Konzentrationen zu testen. VORSICHT! Folgen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Drogen (im allgemeinen Gesichtsmaske, Schutzbrille, Schutzhandschuhe sind erforderlich). <ol><li> Bereiten Drogenplatte mit Arbeitsnormen für den Zweitscreening: wiegen die erforderliche Menge an Verbindung in sterile 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten 16 mM Verbindung in DMSO (dh konzentrierte 100x relativ zum gewünschten Spitzenkonzentration für die Exposition). </li><li> Seriell zu verdünnen 16 mM Stamm 1: 2 in DMSO zu erhalten, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,25 mM Standards (steril). Diese sind 100x konzentriert und wird bis auf Endkonzentrationen von 0 (nur Vehikel) verdünnt werden,2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 &amp; mgr; M (in 1% DMSO) während der Arzneimittelexposition. </li><li> In einer Sterilbank, legen 20-50 ul pro Vertiefung der Verbindung Standards innerhalb einer Spalte einer 96-Well-Platte, zum Beispiel Plattenposition A1: 16 mm, B1: 8 mm, C1: 4 mm, D1: 2 mm, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0.25 mM Wirkstoff und H1: DMSO. Verwenden Sie verschiedene Spalten für Verdünnungsreihe von verschiedenen Drogen. </li><li> Aliquot Fahrzeug zu den Vertiefungen der Spalte 12 in dem Arzneimittel Platte. Hinweis: das Testen von Fahrzeugsteuer Spalten nach unten zusätzlich zu der Prüfung entlang der Zeile H zu erleichtern, so dass Fahrzeug in Positionen repräsentativ für die gesamte Platte getestet. HINWEIS: Jedes Medikament Platte für den Zweit Screening hält Verdünnungsreihe für maximal 11 verschiedene Medikamente getestet werden und der Fahrzeugsteuerung. </li><li> Label und Dichtungsplatte, mit Folie abdecken und Ort bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Nematode Experimente HINWEIS: Führen Sie alle Schritte under sterilen Bedingungen, aseptisch und mit vorher sterilisiert Materialien und Reagenzien. Pflegen C. elegans Stämme routinemäßig auf NGM-Platten mit E. coli OP50. 12 Vorgeschlagene Zeitpunkte für die verschiedenen Protokollschritte sind in Tabelle 1 angegeben. <ol><li> Tag 1 Aufgabe: bis Flüssigkultur von Biosensor-Stamm für die spätere Synchronisation eingestellt. <ol><li> Nehmen Sie Nematoden von einem 6 cm NGM Platte (mit viel jungen Larven, wo Lebensmittel ist soeben abgelaufen) in 2 ml S vollständig und zu übertragen, mit 30 g / l E. Kanne coli OP50 in S komplette (Gesamtvolumen 30 ml in einem 250 ml fassenden konischen Glaskolben). Inkubiere 3 Tage lang bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Tag 4 Task (gewähren ungefähr 30-35 min): Bleich Kultur, Eier zu ernten und Wurmpopulation zu synchronisieren. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte für 1 min, 600 x g. <ol><li> Bereiten Sie Bleichmittel-Lösung unmittelbar vor Gebrauch: zu je 16 ml 0,156 M KOH / NaOH 4 ml Bleichmittel. </li><li> Gießen Sie 2 x 14 mlWurmkultur in 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Erlauben Würmer durch die Schwerkraft (3 min) zu begleichen. Entfernen und entsorgen Sie Flüssigkeit über siedelt Nematoden. 5 ml Bleichlösung in jedes Röhrchen und starten Timer. Kombinieren Sie Datenträger in einem Rohr. </li><li> Kehren Rohr vorsichtig für 2 min, check Stereoskop für das Brechen von Würmern und der Veröffentlichung von Eier in Suspension. Wenn die meisten Eier freigesetzt werden oder an einer maximalen Zeit von 2 min in der Bleichlösung, zentrifugieren. </li><li> Überstand entfernen sorgfältig. Waschen Pellet 1x mit 14 ml S vollständig und Zentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen, 10 ml Bleichlösung und starten Timer (diese zweite Bleichstufe stellt sicher, dass die meisten der Wurm Karkassen zerfallen und nicht mehr unter Stereoskop sehen). Nach einer maximalen Zeit in Bleichlösung von 2 min, Zentrifuge. </li><li> Wash Pellet 3x in S abgeschlossen ist, vorsichtig dekantieren Überstand und Pellet in 14 ml S komplett nach jeder Zentrifugation. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Ei Pellet in 14 ml S complete. </li><li> Übertragen Sie die Lautstärke auf einen kegelförmigen Glaskolben. Inkubiere 18-24 h bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die geernteten Eiern schlüpfen O / N und Verhaftung Entwicklung bei der ersten Larvenstadium (L1) aus Mangel an Nahrung, damit sie alle auf der gleichen Stufe des Wachstums sein. </li></ol></li><li> Tag 5 Aufgabe: bis synchronisiert Wurmkulturen gesetzt für Drogentests. HINWEIS: Worms in Hungermedium suspendiert sind in der Regel an hydrophobe Kunststoffoberflächen wie beispielsweise Pipettenspitzen und Rohre entsprechen. 0,01% Tween-20 ist ein Tensid, hier verwendet, um Kunststoffoberflächen übertragen hydrophilere und eine größere Genauigkeit beim Zählen (0,01% Triton-X100 kann auch verwendet werden). Wenn Nematoden sind in der Bakterien ergänzten Medium, sie nicht dazu neigen, den Kunststoffstab. <ol><li> Bestimmen Sie Anzahl von schraffierten L1 in Kolben, Kolben zu halten beim Schütteln Plattform (160 Umdrehungen pro Minute). <ol><li> Nehmen Sie 3x 100 ul Proben von Kolben (mit einem sauberen Spitze jedes Mal) in einzelne 1,7 ml Mikroröhrchen mit 900 ul Flüssigkeit medium 0,01% Tween-20. HINWEIS: Aspire 100 ul Probe in die saubere Spitze nur einmal. Dann bei der Abgabe, Pipette nach oben und unten ein paar Mal in den zwischen ergänzten Medium, um alle Würmer an der Spitze anhaftenden freizugeben. </li><li> Zählen Sie die Nematoden in 4x 10 ul Tröpfchen aus jeder Dreifachverdünnungsröhrchen. Berechnen Sie Mittelwert und schätzen die Zahl der in der konischen Glaskolben vorhanden Würmer. </li></ol></li><li> Berechnen Sie das Volumen des schraffierten erforderlich, um mit 10 Nematoden pro 10 &amp; mgr; l Einrichtung einer 2 x 20 ml-Kultur Nematodensuspension. Erhöhen berechnete Volumen um 10%, für einige nachfolgende Nematodenverlust während Zentrifugationsschritte ausmachen. </li><li> (Vorgewogen) dekantieren Volumen in 2 x 15 ml Zentrifugationsröhrchen erforderlich. Wiegen Rohre tatsächliche Volumen verzichtet, Vortex vorsichtig zu erhalten und stellen Sie die Lautstärke, indem überschüssiges Volumen mit einer 5 ml Pipette (nur der sterile Spitze sollte das Rohr geben) zielen. </li><li> Make up Volumen bis 14 ml mit frischem S vollständig warh Nematoden. Zentrifuge (1 min, 600 g). Entfernen und entsorgen Sie Stand mit darauf, dass die Nematoden Pellet stören. </li><li> 5 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50 zu pelletiert Nematoden. Übertragen die 5 ml in jedem Röhrchen in eine konische Glaskolben mit 15 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50. Notieren Sie sich Zeit Nematoden wurden zuerst mit Nahrung versorgt. </li><li> Schüttelkolben sanft (160 rpm), nehmen Sie 9 x 10 &amp; mgr; l Tröpfchen auf Objektträger (mit frischen Spitzen jedes Mal), um Nematoden zählen und zu bestätigen, durchschnittlich etwa 10 (± 2) pro 10 &amp; mgr; l. </li><li> Platzieren Nematoden Kolben in Schüttelinkubator bei 20 ° C, 160 Upm für 42-44 Std. </li></ol></li><li> Tag 7 Aufgabe: Übertragung Nematoden auf 96-Well-Platten und initiieren Arzneimittelexposition. <ol><li> Kombinieren Nematodenkulturen in einem einzigen Kolben, halten wirbelnden Kolben vorsichtig und legen Sie 3 x 4 ml Nematodenkultur in 60 ml sterile Trog. Zeigen Trog auf einem Schütteltisch (160 rpm). </li><li> Verwenden Sie 8 channel Pipette 25 ul suspendiert Nematoden pro Well von 96-Well schwarze Mikrotiterplatten mit einem flachen transparenten Boden Aliquot (für die Aufnahme sowohl Lumineszenz und Fluoreszenz-Messwerte, oder weiße Platten für Lumineszenz-only). Deckel mit Deckelplatte und beiseite stellen. <ol><li> Nach oben von je 2 Platten setzen, stellen weitere 2 x 2,5 ml Nematoden im Trog, um verlorene Volumen zu ersetzen (halten Sie einen &quot;Totvolumen&quot; in Rinne von ca. 7 ml). </li><li> Bis 13/14 Platten mit Nematoden gesetzt. 11 Nematodenplatten werden benötigt, um zwei 96-Well-Platten Medikament testen. Der 12. Nematodenplatte wird ausschließlich mit Fahrzeug als eine Steuerung geladen werden. Die 13. Platte wird verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz am Tag 8 (siehe unten) festzulegen. Eine zusätzliche Platte für den Einsatz vorbereitet werden sollen Fehler bei der Einrichtung auftreten. </li></ol></li><li> Aliquot 74 ul S komplett in jede Vertiefung und Ort Platte in einer feuchten Kammer (siehe Materialliste) in einem Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) until bereit aliquoten Testverbindungen an der vorgewählten Entwicklungszeit (zB 45 h 30 min nach Essen zur Verfügung gestellt). [Volume pro Vertiefung ist jetzt 99 &amp; mgr; l]. </li><li> Auftauen Drogenplatte (n) zu testen. </li><li> Verwenden Sie Mehrkanalpipette um Nematodenplatten mit Drogen Einrichten, Ändern Spitzen jedes Mal. Erhalten Sie 5 min pro Platte mit 96 Vertiefungen für die Aliquotierung Droge. <ol><li> Nehmen Sie 1 ul vom 1. Säule der Drogenplatte und in den Spalten 1-5 von einer Platte, die Nematoden; wiederholen vom 2. Spalte in der Drogenplatte in Spalten 8-12 der Platte, die Nematoden. 1 ul Fahrzeug Spalten 6 und 7 der Nematode Platte. Hinweis: 100-Verdünnung der Verbindung / Fahrzeugs: Das Gesamtvolumen pro Vertiefung in dem Fadenwurm Platte werden 100 &amp; mgr; was zu einem 1 sein. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang durch Zugabe von 1 &amp; mgr; l des 3. / 4-ten Spalte des Medikaments Platte, um Spalten 1-5 / 8-12 des zweiten Fadenwurm Platte; Fahrzeug in den Spalten 6 und 7 des Fadenwurms Platte.</li><li> Weiter zum übrigen Drogenbodenkolonnen zu testen. Richten Sie ein Minimum von einem Nematoden Platte mit Fahrzeug in alle Vertiefungen durch Abtasten von Spalte 12 der Arzneimittelplatte. Platz Platten zurück in feuchten Kammern im Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) für 20 bis 22 h (siehe Hinweis für Tag 8). </li></ol></li><li> Part-Vorbereitung der Lumineszenz-Puffer zum nächsten Tag: add DMSO und 10% Triton-X-100 auf das erforderliche Volumen des S vollständig auf 1% DMSO und 0,15% Triton X-100 zu erhalten. Lassen Sie 5 ml pro Platte Lese für Lumineszenz, plus 1 ml zur Grundierung Luminometer Injektor. </li></ol></li><li> Tag 8 Aufgabe: Lesen experimentellen Endpunkten - Fluoreszenz und Biolumineszenz. (GFP Fluoreszenzmesswerte werden als ein Mittel, um Daten zu normalisieren Biolumineszenz empfohlen). HINWEIS: Richten Sie den Endpunkten von 66-67 Stunden nach dem Essen zu lesen, um Nematoden, um signifikante Nachkommen Produktion unter den beschriebenen Versuchsbedingungen zu verhindern. <ol><li> Richten Sie Platte, die als Hintergrund Steuerung für GFP Messwerte zu verwenden. Combine auch Inhalte vom 13. Platte in eine 15-ml-Tube. Erlauben Nematoden zu begleichen (2-3 min). Verwenden Sie Überstand, um eine Mikroplatte (schwarz mit transparentem Boden) mit 100 ul Bakteriensuspension pro Vertiefung zu laden. <ol><li> Beachten Sie Hintergrundsteuerplatte unter Mikroskop notieren Brunnen, wo Nematoden zu sehen. Auszuschließen diese vom Hintergrundschätzung in nachfolgenden Datenanalyse verwendet. </li></ol></li><li> Lesen Fluoreszenz jeder Platte mit 96 Vertiefungen, einschließlich der Hintergrundsteuerung. (Einstellungen: Optik von der Unterseite der Platte; Filter 485/20 Anregungs; 528/20 Emissions.) </li><li> Bereiten Puffer für Lumineszenz-Messungen: add Luciferin (20 mM) auf Teil vorbereitet Puffer (vom Vortag), Lumineszenz-Puffer mit 1% zu erhalten DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) und 0,3 mM Luciferin (3x ). Prime Luminometer Injektor 6x mit 150 ul Puffer Lumineszenz. <ol><li> Vorheriger Schritt wird davon ausgegangen 1% DMSO als Fahrzeug während Arzneimittelexposition. Als Vehikel Wasser ist, stellen Sie die Zusammenarbeitncentration DMSO in Lumineszenz-Puffer auf 3% (dh 3 ×). </li></ol></li><li> Arbeiten mit einer Platte zu einem Zeitpunkt. Dispense 50 ul Lumineszenz Puffer pro Vertiefung. (150 &amp; mgr; l Endvolumen in gut; 3x Verdünnung von Lumineszenz-Puffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 und 0,1 mM Luciferin Endkonzentrationen.) Unmittelbar am Bewegungstisch und starten Timer. <ol><li> Nach 3 min auf Schütteltisch (160 rpm), lesen Sie Lumineszenz (1 Sekunde pro Messung). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Subtrahieren durchschnittliche GFP Hintergrund Lesen von Fluoreszenz Ergebnisse. Teilen Sie Biolumineszenz durch entsprechende GFP Lesen. <ol><li> Wenn eine hohe GFP-Wert wird für Nematoden in eine Verbindung ausgesetzt detektiert messen Fluoreszenz der Verbindung auf ihren eigenen, für jede Verbindung, Fluoreszenz zu berücksichtigen. Wenn höher als der Durchschnitt, verwenden Sie diese als Hintergrund statt. </li></ol></li><li> Express Biolumineszenz, GFP normalisierten Biolumineszenz einnd GFP-Fluoreszenz-Daten als Prozentsatz des Durchschnittswerts für die Fahrzeugsteuerung in jeder Platte. </li><li> Plot Durchschnittswerte und Fehlerbalken für jede Konzentration. </li><li> Test auf statistische Signifikanz unter Verwendung von 2-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Wirkung von &#39;Konzentration&#39;, &#39;Experiment&#39; und ihre Wechselwirkung (jeder Datenpunkt bezieht sich auf eine einzige gut), und verwenden Sie den Dunnett-Test als post-hoc-Test (vs . Fahrzeugsteuerung). HINWEIS: Wenn das &quot;Experiment&quot; oder die &quot;Interaktion&quot; Begriffe sind signifikant, können weitere Experimente erforderlich, um Antwort zu bestätigen. Wo keine Variabilität zwischen Experimenten ist aus der Beobachtung der Datengrundstücke ersichtlich ist, kann ein Einweg-ANOVA auf gepoolten Daten aus unabhängigen Experimenten durchgeführt werden. <ol><li> Für die statistische Analyse der Platte (n) nur mit Fahrzeug, wählen Sie alle Vertiefungen in den Spalten 6 -7 und alle Vertiefungen in der Reihe H als Kontrollgruppe (das sind die Positionen während Verbindung Tests routinemäßig Fahrzeug zugeordnet). </li&gt; </ol></li></ol>

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	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Der Modellorganismus C. elegans stellt ein leistungsfähiges experimentelles System. Es ist leicht, Kultur und produziert reichlich genetisch identische Nachkommen mit einer 3,5 Tage Lebenszyklus vom Ei bis zum Reproduzieren Erwachsenen (über juvenile Larvenstadien L1 bis L4). Aufgrund seiner geringen Größe, kann es bequem in 96-Well-Platten gezüchtet werden, die Erleichterung Substanz-Screening. Wir präsentieren eine phänotypische Screening-Protokoll basierend auf Stämme von C. elegans, die als in vivo Sensoren von Energieniveaus dienen. 14 Das Protokoll ist anwendbar auf jedes Labor, obwohl eine 96-Well-Platte Luminometer und einem sterilen Gehäuse ist nicht notwendig. Es ist wichtig, um eine Kontamination in Assays durch die Verwendung eines Labortechnik verhindern. Wenn sie manuell arbeiten, ist die maximale Anzahl der Nematodenplatten erzielbare 13 pro Versuch ermöglicht die Prüfung von 2x 96-well Platten Medikament ist und zwei Fahrzeug-Platten. Repräsentative Ergebnisse sind für die mitochondriale Komplex I Inhibitor Rotenon vorgestellte, die Superoxid-Generator Paraquat, dem Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat und vier Verbindungen mit bekannten Leuchtkäfer-Luciferase-inhibitorische Aktivität. Die ersten beiden Verbindungen führte zu einer Abnahme der Biolumineszenz wie vorherwohin Oxalacetat führte zu einer Verbesserung, eher von größer Erzeugung von ATP führen. Die Oxalacetat Datensätzen auch die intrinsische Variabilität bei Experimenten basierend auf Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu demonstrieren. Ein Minimum von drei unabhängigen Experimenten sind ratsam, um die Robustheit der Antworten auf nicht bekannten Verbindungen festzustellen. Inhibition der Firefly-Luciferase-Aktivität war erkennbar mit einem in vitro-Assay unter Verwendung eines kommerziellen Kits. 3 Eine der Verbindungen führte zu einem erheblichen Anstieg der GFP-Fluoreszenz, die mit dem Inhibitor die Erhöhung des Niveaus der GFP-markierten Luciferase durch Bindung an das Luciferase-Enzym die aktive Stelle und macht sie stabiler. 15 In einigen Fällen(in diesem besonderen Fall) kann dies zu erhöhten Werten von Biolumineszenz 15 führen, wenn der Inhibitor durch überschüssiges Substrat verschoben wird. Es ist daher wichtig, nicht zu Ergebnissen irrtümlich aus Verbindungen, die mit dem Glühwürmchen-Enzyms in Wechselwirkung zu interpretieren, wie verringerte oder erhöhte ATP-Spiegel / Funktion der Mitochondrien. Veränderungen in Lumineszenzsignal korrelieren oft mit zusätzlichen Messungen der Gesundheit wie Bewegung, Entwicklung und Wachstum. Als ein Beispiel, ist eine Verbindung, ein Verdächtiger Luciferase-Inhibitor, wenn ein dramatischer Rückgang der Biolumineszenz-Signal erkannt wird, aber Würmer sind nicht von Kontrollen durch mikroskopische Beobachtung. Eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz, nicht durch das Wachstum oder die Autofluoreszenzverbindung erläutert, kann auch auf eine Inhibitor. Eine Anzahl von Luciferase Inhibitoren 15 sind bekannt und wurden in PubChem eingegeben. Daher in erster Linie ist es gute Praxis, Informationen über Luciferase Inhibitoren durch PubChem gehalten zu konsultieren; gefolgt von testing der Wirkungen der Verbindung in in vitro-Tests mit dem gereinigten Enzym 3 und / oder die Bestätigung von Wirkungen auf die Funktion der Mitochondrien durch zusätzliche Mittel. 16,17 GFP-Fluoreszenz-Messungen ermöglichen die Erkennung von Glühwürmchen-Luciferase-Ebenen (und das Potenzial Nachweis einiger Luciferase-Enzym-Inhibitoren, wie oben erörtert) machen ein starkes Argument für die Messung dieser Endpunkt neben Biolumineszenz, soweit möglich. Normalisierung der Messwerte auf Biolumineszenz GFP ist auch ein Mittel zur Berücksichtigung der Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Vertiefungen (obwohl dies auch durch Einschluss von mehreren technischen Wiederholungen erreicht werden). Zu einer höheren Empfindlichkeit, ist es wichtig, um Hintergrundfluoreszenz von den Messungen subtrahiert. Das Protokoll beurteilt Beitrag der Bakteriensuspension auf die Hintergrund-Fluoreszenz jedoch Nematodenautofluoreszenz ist nicht für (eine Begrenzung der Strom Assay für jede Alterungs stu besonders kritisch entfielenstirbt da Nematoden Autofluoreszenz steigt mit dem Alter). Autofluoreszenz der Testverbindungen sollten auch parallel bewertet werden. GFP Normalisierung scheint unverzichtbar, wo Forscher wollen Protokoll anzupassen, um zelluläre ATP-Pools in verschiedenen genetischen Mutanten oder nach dem Schweigen der verschiedenen Genen zu vergleichen, um für Dehnungsunterschiede auf dem Niveau der Expression des Transgens Biolumineszenz steuern. Kritischen Parameter innerhalb des Protokolls sind die Entwicklungsstufe, bei der Belichtung initiiert wird, der Dauer der Einwirkung und Erhalten ähnliche Anzahl von Nematoden in verschiedenen Vertiefungen. Die Belichtung kann in jedem Stadium der Entwicklung der Nematoden L3 Stadium beginnen jedoch älter ist vorzuziehen. Von diesem Zeitpunkt an, Nematoden sind abhängig von der oxidativen Phosphorylierung für die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter, wie durch einen sehr deutlichen Anstieg der mtDNA Gehalt, Sauerstoffverbrauch und ATP-Spiegel zeigt. 18,19,20 Das vorliegende Protokoll initiiert Ausstellungenure im L4-Stadium. Der Grund für das Aliquotieren von Nematoden auf 96-Well-Platten in diesem Stadium nur (und nicht, wenn sie zum ersten Mal mit der Nahrung im L1 Stufe vorgesehen ist), ist, dass obwohl Platten in feuchten Kammern angeordnet, um Verdampfung zu minimieren, eine Verdampfungsgrad noch auftritt unsere Schüttelinkubator, wie sehr kleine Tröpfchen bilden auf den Deckeln zu sehen (das kann nicht ein Problem mit anderen Schüttelinkubatoren sein). Aliquotieren von Nematoden, Platten unmittelbar vor der Zugabe von Arzneimittel-Standards, dem eigentlichen Wirkstoffkonzentration nicht durch irgendeine kleine Veränderung des Volumens durch Verdunstung beeinflusst wird. Laden eines Nematodenplatte mit dem Vehikel allein ist sinnvoll, zu prüfen, ob Nematoden wurden gleichmäßig zwischen Vertiefungen verteilt. Signifikante Unterschiede für das Fahrzeug nur Schild wäre bezeichnend für schlechte Technik werden bei der Abgabe die Nematoden in die Vertiefungen. Die Belichtungsdauer ist ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Wenn Auswirkungen auf den Energiestatus unabhängig von Wachstum sind von Interesse, die Pro-Protokoll modifiziert werden, um kürzere Expositionen (fast unmittelbaren Reaktionen auf, zum Beispiel, 2 h) unterzubringen. Auf der anderen Seite, Eintrag von Verbindungen in C. elegans Geweben kann einige Zeit dauern. Beispielsweise 12-24 h erforderlich sind, um maximale innere Konzentrationen von Resveratrol und 5-Fluor-2&#39;-desoxyuridin (FUdR) zu erreichen. 21 daher eine längere Belichtungszeit (18 bis 24 h) kann gerechtfertigt Belichtungspegel zu maximieren. Die Belichtungszeit sollte auf Zeiten, in denen nicht ein erhebliches Maß an Wiedergabe, um Platz in der gut zu nehmen beschränkt werden. Wir empfehlen, dass die Gesamtentwicklungszeit von Nematoden unter 66-67 h gehalten. Obwohl praktisch, sind Nematoden bis dahin trächtig und haben Eiablage begonnen. Dennoch fanden wir Biolumineszenz-Messwerte von Eierzubereitungen vernachlässigbar zu sein (nicht dargestellt). Die sur-5-Promotor gesteuerte Expression des Transgens zuerst erkannt nur zwei bis zweieinhalb Stunden nach der Befruchtung bei der 100-Zellstadium 22 und der chitinous Eierschale ist wahrscheinlich, um den Eintritt von Luciferin zu begrenzen. Andere haben festgestellt, dass embryonierten Eiern nicht wesentlich dazu beitragen, den Stoffwechsel von schwangeren Erwachsenen. 23 jedoch zu vermeidende Bedingungen, die für bedeutende Nachkommen Produktion sind. Falls gewünscht, kann der experimentellen Zeitskala wieder verschoben werden: Wir haben zuvor initiierten Exposition gegenüber einem Umweltgift am späten L3 Larvenstadium (36 hr) und aus Biolumineszenz und GFP-Messungen bei 55 h durchgeführt 2 Alternativ genetischen Hintergründen, die bedingt steril sind. kann verwendet werden, um Nachkommen Produktion zu verhindern, wie zum Beispiel die fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV-Doppelmutante, die bei 15 ° C gehalten werden kann, ist aber sterile bei 25 ° C. 24. Die Verwendung von FUDR zur ​​Sterilität induziert wird nicht empfohlen, da dies kann selbst betreffen Nematodenstoffwechsels. 25. Der Test konnte auch in Stämmen mit permeabler cuticles wie partielle Verlust-Funkt geführt werdenIonen-Bus-8-Mutanten, die Multidrug-sensitive aufgrund Lässigkeit von Medikamenten zu erhöhen. 26 Dies wird kürzere Belichtungen und niedrigere Verbindungskonzentrationen erleichtern. Die Bedingungen für das Hinzufügen von Luciferin zu diesen Nematoden müssen möglicherweise auch Anpassung dh 1% DMSO und 0,05% Triton-X100 in der Lumineszenz-Puffer kann nicht verlangt werden Luciferin Verfügbarkeit zu verbessern. Das Protokoll verwendet 1% DMSO als Vehikel für Verbindung Lieferung. Obwohl nicht tödlich, diese Konzentration des DMSO hat einige biologische Wirkungen, wie wir in einer früheren Veröffentlichung. 3 diskutiert Viele der verfügbaren Medikamentenbibliotheken werden in 100% hergestellt DMSO, bei Konzentrationen, die nach Verdünnung Fahrzeug für zellbasierte Assays sein wird bis 0,1%. Höhere Konzentrationen der Verbindung erforderlich sind, um Antworten in C hervorzurufen elegans, wenn sie mit menschlichen Zellen, so daß es oft nicht möglich, Tests bei weniger als 1% DMSO durchzuführen, verglichen. Wiederum ist die Verwendung von Stämmen mitlässiger Nagelhaut kann auf die Prüfung mit geringeren Konzentrationen von Fahrzeug zu führen. Konzentrationen von DMSO von über 1% sind nicht zu empfehlen. Eine Reihe Inkubationszeit mit Luciferin vor Lesungen sollten eingehalten werden. Seinen Maximalpegel innerhalb der zweiten Minute, wie zuvor gezeigt, erreicht Lumineszenz nach Zugabe von Luciferin, relativ stabil bleibt für die ersten 5 min, gefolgt von einer langsamen Abnahme der Lumineszenz schrittweise über die nächsten 30 min 1. Kinetischen Antworten auf eine bestimmte Chemikalie kann während dieser ersten Phase von 30 min nach der anfänglichen Dosierung von Luciferin durchgeführt werden. Das Protokoll beinhaltet eine Hungersnot Schritt nach der Entnahme von Eiern, um die Synchronisation der Nematodenpopulation zu erreichen. Wir empfehlen Synchronisation von Nematodentest Populationen seit verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden sich in zellulären ATP-Spiegel und können unterschiedlich auf die Testverbindungen zu reagieren. Durch die Durchführung der Hunger in S KomplettMedium gegenüber M9 werden die Brut Nematoden mit einer Kohlenstoffquelle (Ethanol) 27,28 versehen, so daß Larven entwickeln sich nicht, sind aber nicht vollkommen ausgehungerte. Es hat sich auch gezeigt, dass L1 verhaftet sind für eine schnelle Reaktion auf Lebensmittel grundiert und normale L1 Wachstumsrate wird innerhalb von 3 Stunden nach dem Essen zur Verfügung steht 29 jedoch die Möglichkeit erreicht., es, dass der Hunger-Schritt kann den Stoffwechsel von C. ändern elegans kann nicht ausgeschlossen werden. 30 Aus diesem Grund ist die Länge des Hungers sollte 24 Stunden nicht überschreiten (18 Stunden ist ausreichend für die Synchronisation). Einige Labors haben die Möglichkeit, mit Hilfe eines Copas Biosorter für Alter Synchronisation Umgehung des Hungers Schritt ganz. Andere Laboratorien können eine Präferenz für die Erweiterung des Nematodenpopulation auf festen Medien (NGM-Platten mit OP50) vor dem Bleichen (Schritt 3.1) haben, und das wird auch gut funktionieren. Wir verwenden S Medium während der Verbindung Exposition als Standardmedium für Nematodenkultivierung, however andere Medien ausgewählt werden, zum Beispiel K Medium oder EPA mäßig hartem Wasser werden oft für ökotoxikologische Untersuchungen verwendet. 31,32 Das Protokoll bietet eine Möglichkeit, zu screenen und zu Kandidaten für weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien zu identifizieren. Auf der Stufe der primären Screening ist es wahrscheinlich, dass einige Verbindungen wird durch nur eine Konzentration getestet sehen wurden daher Drogen-Bildschirme sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden. Zugriffe kann durch die Verwendung von Techniken zur Bewertung verschiedener Aspekte der mitochondrialen Funktion beispielsweise der Sauerstoffverbrauch, C. validieren elegans-Stämme mit GFP-exprimierenden Mitochondrien, Flecke für mitochondriale Membranpotential und / oder ROS-Messungen. 16,33,34 Die größte Bedeutung der Methodik ist es, eine Einrichtung zum Sortieren von großen Anzahl von Verbindungen und / oder Bedingungen an der vielzelligen Organismen Pegel haben, und vor allem in der Lage sein, die Vorteile der th nehmene genetische Lenkbarkeit von C. elegans, um Wirkmechanismen zu untersuchen. Die Technik kann helfen, zu beschleunigen und zu finden, neue Wege zur Entdeckung interessanter Verbindungen und Ziele. Es ist vorgesehen, dass die Kombination des Sensors mit genetischen Hintergründen mit menschlichen Krankheiten für das Screening von Substanzbibliotheken in einem krankheitsrelevanten Kontext zugeordnet wird viel zu bieten haben.

Der Zweck dieses Verfahrens ist die schnelle Quantifizierung des Energiestatus von C. elegans in vivo im Hinblick auf die mit dieser als ein Endpunkt in Verbindung Screening. Das Grundprinzip ist bei der transgenen Expression der Luciferase in dem Fadenwurm C. basierend elegans 1-3 über das Plasmid pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> Die Luciferase-Enzyms zu dem grün fluoreszierenden Protein GFP fusioniert ist und konstitutiv und ubiquitär im Zytoplasma exprimiert (die Luciferase Peroxisomen-Targeting-Signal entfernt wurde). Dies führt zu einer Lichtemission, wenn das Substrat Luciferin wird exogen bereitgestellt. Da die Schnecken transparent ist, kann das Licht in einem Luminometer als relative Lichteinheiten (RLU) gemessen werden. Zellulären ATP-Kraftstoffe der Biolumineszenzreaktion und seine Verfügbarkeit bestimmt die erzeugte Lichtpegel. Folglich bietet Luminometrie eine convenient Mittel zur Bewertung in Bezug ATP-Spiegel und durch die Erweiterung der mitochondrialen Funktion, da die ATP-Produktion erfolgt hauptsächlich in den Mitochondrien. Eine Verbindung zwischen mitochondrialen Funktion und Biolumineszenz Ebenen zuvor durch das Silencing der mitochondrialen Elektronentransportkette Gene und damit einhergehenden reduzierten Lichtleistung gezeigt. 1 Die Biolumineszenz-Stämme erzeugt wurden PE254 (feIs4) bezeichnet und PE255 (feIs5) 1 (siehe Materialliste) und können untereinander ausgetauscht werden. 3 Eine Reihe von Studien haben diese Sensor-Stämme verwendet werden, um auf die zelluläre ATP-Spiegel in vivo berichten nach Exposition gegenüber verschiedenen xenobiotischen Chemikalien wie Natriumazid 1, Cadmium 2, Abwasser Schlammextrakt 3, 5&#39;-Fluor-2-desoxyuridin 6 und eine tabakspezifische Nitrosamin 7. Die Stämme sind auch nützlich gewesen, um Auswirkungen der Bestrahlung mit UV-C-Strahlung zu überwachen <sbis&gt; 8 und Wirkungen der Störung der mitochondrialen Atmungskette. 1,9 Eine frühe Version Lumineszenzsensor das Luciferase-Gen exprimieren, ohne GFP-Fusion (PE39) wurde ebenfalls in die Untersuchung der Wirkung von Schwermetallen und eines Atmungs verwendet . Entkoppler 10 Stämme PE254 und PE255 tragen das Luciferase: GFP-Fusions und GFP-Fluoreszenz wurde gezeigt, proportional mit Nematodenmasse zu erhöhen und bietet ein bequemes Mittel zur Normalisierung der Lumineszenz-Werte 6,9 Die Auswirkungen der Unterschiedsbetrag von Würmern pro Vertiefung kann auch sein. indem mehrere technische Replikate in dem Test (mindestens 5 Vertiefungen pro Bedingung) berücksichtigt. 3 Das Protokoll bietet die Möglichkeit der in vivo-Überwachung von Energieniveaus (im Gegensatz zu technisch umständlich in vitro ATP Bestimmungen) ermöglicht Wirkstoff-Screenings und Neupositionierung im physiologischen Kontext der gesamten multicellular Organismus. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von genetischen Hintergründen durch Kreuzung der chromosomal integriertes Transgen in verfügbar Mutantenstämme und / oder durch Abschaltung von Genen durch RNA-Interferenz verlängert werden; somit unter voller Nutzung der C elegans als Modellorganismus. Das Verfahren soll helfen, Spätphasenausfall von Wirkstoffkandidaten zu reduzieren durch mitochondriale Toxizität und einen Beitrag zur Verringerung der höheren Tierversuche.

<table><tbody><tr><td>Orion II Microplate Luminometer</td><td>Berthold Detection Systems</td><td></td><td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>FLx800 fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>Ks 130 basic shaking platform</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Refrigerated incubator shaker</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>with eppendorf rotor A-4-44&amp;nbsp; (for 50/15&amp;#160;ml tubes)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Serological pipette</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Microscope slides</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Sterile spatula</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>for weighing out chemicals</td></tr><tr><td>0.22 mM Millex GP filters</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well assay plate</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Black plate clear bottom with lid</td></tr><tr><td>Nunc 96 well assay plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>White plate with lid</td></tr><tr><td>Reservoir reagent 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1</td></tr><tr><td>Storage box/damp chamber</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td></tr><tr><td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Store in aliquots at 4&amp;#160;&amp;deg;C,&amp;nbsp; seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td></tr><tr><td>D-Luciferin, potassium salt</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, keep at -20 &amp;deg;C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Purity 99.99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute to 10% in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; bioluminescent strains</td><td>Author&#039;s own laboratory</td><td>PE254, PE255</td><td>contain integrated arrays &lt;em&gt;feIs4&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)]&lt;/em&gt; respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of &lt;em&gt;luc::GFP&lt;/em&gt; by fluorescence microscopy (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pick 15 worms) every now and then.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Repräsentative Ergebnisse, um das Verfahren zu veranschaulichen wurden Rotenon (Abbildung 1), Paraquat (Abbildung 2), Oxalacetat (Abbildung 3) und 4-Verbindungen, die sich als Leuchtkäfer-Luciferase-Hemmer im Screening einer Medikamentenbibliothek 13 (Figur 4) aufgenommen wurden erhalten. Das Medikament Exposition wurde auf der L4-Stadium in allen Fällen begonnen, aber die Paraquat Exposition Experimente wurden bei 41 h begann nach dem Essen als erster Nematoden zur Verfügung gestellt im Vergleich zu 45-46 Stunden für die anderen Verbindungen. Das Protokoll ermöglicht eine Flexibilität bei der Auswahl der Zeit für die Initiierung der Exposition und der Belichtungslänge. Zu Screening-Zwecken, Untergangszeiten sollten eingehalten werden, wenn ausgewählt, für die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten werden. Endpunkte sollte von 66-67 h Entwicklungszeit, um umfangreiche Eiablage und Schlüpfen der Nachkommen in den Vertiefungen zu verhindern, gemessen werden. Richtlinien für die Zeitpunkte sind in T bereitgestelltLage 1. Rotenon, einem mitochondrialen Komplex I-Inhibitor, verringert Biolumineszenz, nachdem beide relativ kurz (2 h) und längere Belichtungszeiten (24 h), um einen Bereich von Konzentrationen (Abbildung 1). In diesem Fall wurden keine GFP Messungen vorgenommen, aber die Anzahl der technische Replikate verwendet (n = 6) ist ausreichend zu glätten irgendwelche Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Wells 3. Die 24-Stunden-Exposition ist ein Fenster der Zeit, über die Nematoden zu wachsen, und langsamere Entwicklung als Folge der komplexen I Hemmung wurde erwartet, dass sie auf den Rückgang der Biolumineszenz beizutragen. Dies wurde durch visuelle Beobachtung unter Stereoskop mit verzögerter Entwicklung angesehen, insbesondere bei Konzentrationen von 20 uM und darüber bestätigt; zusätzlich einige Letalität von 40 &amp; mgr; M bemerkt (qualitative Beobachtungen nicht quantifiziert). Kein Letalität wurde nach 2 h Exposition beobachtet, die jedoch Auswirkungen auf die Schneckenbewegung beobachtet. Ein starker Rückgang der Biolumineszenz relativ zu Kontrollen OCCUbei der niedrigsten Konzentration von Rotenon Rred getestet 2,5 um, für die Effekte wurden nicht einfach durch schnelle visuelle Beobachtung bei 2 St. Exposition erkannt. Dieser Rückgang der Biolumineszenz ist konsistent mit reduzierten zellulären ATP. Maximale Hemmung wurde mit der niedrigsten Konzentration von Rotenon verwendet (2,5 uM), die anzeigt, dass alle nachfolgenden Experimente gezielt Rotenon sollte zwischen 0 und 5 &amp; mgr; M [der Konzentrationsbereich 0-160 uM durchgeführt werden erzielt wurde als Teil eines Vergleichs mit anderen Arzneimitteln ausgewählt zunächst als erhebliche Auswirkungen bei 10 uM identifiziert (an anderer Stelle veröffentlicht)]. Das Herbizid Paraquat wirkt mitochondrialen Funktion durch Erhöhung von reaktiven Sauerstoffspezies. Hier, auf Biolumineszenz von C. zeigen wir seine Wirkung elegans Stamm PE254 nach Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen über 24 Stunden (Abbildung 2). Als der Stamm trägt eine luc :: GFP-Fusions, GFP-Fluoreszenz wurde also als Mittel zur Normalisierung gemessen. 6,9 Paraquat verringert Biolumineszenz GFP-Fluoreszenz und normalisiert Biolumineszenz bedeutend. Dunnet die post-hoc-Test zeigte, daß die Konzentrationen von Paraquat mit signifikanten Unterschieden in Bezug auf die Fahrzeugsteuerung wurden 4 und 8 mm für Biolumineszenz und normalisiert Biolumineszenz sowie 2 mM für normierte Biolumineszenz. Die einzige Konzentration GFP-Fluoreszenz signifikant reduziert war 8 mm, eine Konzentration, bei der Wachstumseffekte und die gelegentliche toten Wurm wurden (qualitative Beobachtungen) zu sehen. Die Abnahme der Biolumineszenz (und normalisiert Biolumineszenz) größer war als die der Fluoreszenz, die mit verringerten mitochondrialen Funktion und Auswirkungen auf die ATP-Produktion. Der Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat auf C getestet elegans-Stamm PE254 bei einer einzigen Konzentration von 8 mM, führte zu einer Zunahme der Biolumineszenz (Abbildung 3). Kein GFP fluoreszierennce Messungen erhalten wurden oder zusätzliche visuelle Beobachtung durchgeführt wird; aber solche Reaktion auf einen einzigen Zusammenschluss weitere bestätigende Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen, und detailliertere Beobachtungen von Effekten zu verdienen. Eine Verbesserung der Biolumineszenz durch diese Verbindung ist nicht überraschend, da sie postuliert, dass eine größere Aktivität des Zitronensäurezyklus führen, wobei letztendlich größere Produktion von ATP (werden dennoch wäre es ratsam, für alle Auswirkungen auf die Luciferase-Niveaus durch die Beurteilung GFP-Fluoreszenz zu steuern In nachfolgenden Experimenten). Die angegebenen Oxalacetat Datensätze zeigen das Ausmaß der Variabilität in Reaktion auf Luciferase-basierte Experimente gesehen. Nach unserer Erfahrung diese Variabilität ist eine Funktion des Testsystems vor allem für weniger schädlich Expositionsbedingungen. Die Glühwürmchen-Luciferase-Inhibitorverbindungen DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 und DDD00023047 wurden sowohl in vitro, indem du Auswirkungen auf den pu getestetrified Enzym und in vivo unter Verwendung des C. elegans luc: GFP-Stamm,. Es gab keinen Beweis, daß irgendeiner der getesteten Verbindungen verursachte Nematoden Tod unter den Belichtungsbedingungen. Alle 4 Verbindungen beeinflußt, die die Luciferase-Aktivität in vitro auf die 2 Konzentrationen getestet 25 und 100 um (4A). DDD00001434 tötete die Aktivität des gereinigten Luciferase fast vollständig, die eine glaubwürdige Begründung für die große Rückgang der in vivo Biolumineszenz (4B) zur Verfügung gestellt. Obwohl die in vitro und in vivo-Tests nicht direkt vergleichbar sind, die Antwort auf DDD00023047 war in beiden Assays. DDD0001477 und DDD00000635 verursacht einen größeren Rückgang in vivo als in in vitro. Diese Verbindungen wurden in den lebenden Würmer 22 Stunden vor dem Luciferin-Substrat bereitgestellt, und die Ergebnisse können zu reflektieren, dass sie nicht leicht aus der Luciferase aktiven Stelle verschoben, wenn Luciferin wurde avaiEtikett vorzeigen. Alternativ DDD0001477 und DDD00000635 kann eine zusätzliche Wirkung auf die zelluläre ATP-Spiegel. Dies müsste durch die Glühwürmchen-Luciferase an keine beurteilen. Bemerkenswert war die starke Verbesserung der GFP-Signal in Live-Würmer DDD00000635 Verbindung ausgesetzt. Dies wird nachfolgend erörtert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die mitochondriale Komplex I-Inhibitor Rotenon verringert den Energiestatus von C. elegans durch Biolumineszenz-Stamm PE254 gemessen. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 Stunden nach dem Essen um Larven L1 vorgesehen) auf 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 uM Rotenon in 1% DMSO für 2 frei hr (kurz) oder 24 Stunden (Langzeitbelichtung) vor Lesungen der Biolumineszenz jeweils in 48 und 69 h Schnecken Entwicklung nach dem Essen zur Verfügung gestellt. Biolumineszenz (Einheit relativen Lichteinheiten, RLU) wurde als Prozentsatz des Fahrzeugs (1% DMS exprimiertWerte O). Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen an jedem Rotenon Konzentration (n = 6). Alle getesteten Konzentrationen führte zu einer statistisch hochsignifikant Differenz zur Vehikelkontrolle (p &lt;0,001). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Abbildung 2. oxidativen Stressor Paraquat verringert den Energiestatus von C. elegans-Stamm PE254 in einer konzentrationsabhängigen Weise (durch Biolumineszenz gemessen). Synchronized L4-Stadium Würmer (der Einfachheit halber im vorliegenden Fall auf 41 Stunden nach dem Essen um L1-Larven zur Verfügung gestellt) wurden auf 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 oder 8 ausgesetzt mM Paraquat 24 h. GFP-Fluoreszenz (Einheit relativen Fluoreszenzeinheiten, RFU) wurde verwendet, um Biolumineszenz-Daten (Einheit RLU), beide Endpunkte bei 65 Personalentwicklung erhalten normalisieren. Daten sind als Prozentsatz der Kontrollgruppe (1% DMSO) ausgedrückt. Fehlerbalken zeigen SEM von technischen Replikaten(n = 5 für verschiedene Konzentrationen; n = 18 für die Kontrollen). Einweg-ANOVA: *** p &lt;0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat (8 mm) verstärkte die Biolumineszenz von C. elegans Stamm PE254. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 h nach Nahrung zu L1-Larven zur Verfügung gestellt) ausgesetzt waren frisch zubereitet 8 mM Oxalacetat 18 h ± 30 min. Biolumineszenz (Einheit RLU) wurde bei einer Entwicklungszeit von 63,5 h ± 1 h lesen und wurde als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt Fahrzeug (ddH 2 O). Verschiedene Spalten stellen verschiedene Datensätze von 8 technische Replikate auf verschiedene Platten mit 96 Vertiefungen in dem gleichen Experiment zugeordnet. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). 2-Wege-ANOVA mit &quot;set&quot; und &quot;Konzentration&quot; als Faktoren: ̵6; Set &#39;p&gt; 0.05, &quot;Konzentration&quot; p &lt;0,001 und Interaktionsterm p&gt; 0.05. EIN <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Abbildung 4. Prüfung der Antworten auf 4 Verbindungen aus der Dundee Wirkstoffforschung Verbindungsbibliothek 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 und C4: DDD00023047) mit bekannter Hemmaktivität auf Glühwürmchen-Luciferase-Lumineszenz. (A) Wirkung von Verbindungen auf die Aktivität der gereinigten Glühwürmchenluciferase (gemessen als Lichteinheiten, RLU), ausgedrückt als Prozentsatz der Fahrzeugsteuerung. Der ATP-Biolumineszenz CLSII Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen mit der gleichen Menge an Luciferase-Enzym in die Vertiefungen (weiße 96-w aliquotiert verwendetell Mikrotiterplatten). ATP wurde zu einer Endkonzentration von 10 uM und 1 ul der Verbindung vorgesehen (Endkonzentration angegeben) oder DMSO (1%) zugegeben. Lumineszenzsignal wurde 10 sec integriert. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 4). Analyse: one-way ANOVA; * p &lt;0,05 bzw. *** p &lt;0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. Unterschiede zwischen 25 und 100 &amp; mgr; M von großer Bedeutung für C1 (DDD00001434; p &lt;0.001) und eine signifikante für C2 und C3 (jeweils DDD0001477 und DDD00000635; p &lt;0,05). (B) In-vivo-Messungen der Biolumineszenz, Biolumineszenz normiert auf GFP-Fluoreszenz und GFP-Fluoreszenz von C elegans Stamm PE254 mit 67 h Entwicklungszeit nach Exposition mit Testverbindungen für 22 Std. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). Die statistische Analyse (Ein Weg-ANOVA) durchgeführt auf gepoolten Daten aus drei Datensätzen (3 xn = 8). * p &lt;0,05 bzw. *** p &lt;0,001 in Bezug auf jeweilige Fahrzeugsteuerung. Differences zwischen 25 und 100 uM nur statistisch signifikant (p &lt;0,05) für normierte Biolumineszenz nach Einwirkung C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Uhrzeit </td><td> Tag 1 </td><td> Tag 2 </td><td> Tag 3 </td><td> Tag 4 </td><td> Tag 5 </td><td> Tag 6 </td><td> Tag 7 </td><td> Tag 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 4 </td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Schritt 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Übersicht über die Protokollschritte, die an jedem Tag der Nematoden Experimenten (Abschnitt 3) durchgeführt werden und schlug Timings.

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A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K Aufrufe.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Serie: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Forschung

Biochemie

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Verhalten

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologie

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medizin

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Quantifizierung der Mitophagie in C. elegans und einer Leberkrebszelllinie

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autor im Rampenlicht: Nachweis der Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

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Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen