Name: in vivo microinjection and electroporation of mouse testis
Uploaded: 2014-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis at JoVE.com

אנו מודים בירגיט Westernstroeer של המרכז של רפואת הפוריות והאנדרולוגי באוניברסיטת מינסטר להוראת microinjection האשכים. חוץ מזה, אנחנו מודים לאורסולה Antkewitz ופטרה Reckling לקבלת סיוע טכני. אנו מודים לקרן המחקר הגרמנית (DFG) לתמיכה בעבודה זו (WE2458 / 10-1). &#160;

כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המקומית האתיקה (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, מקלנבורג מערב פומרניה-, גרמניה). .1 פלסמיד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת פלסמיד, שימוש ערכות פלסמיד טיהור (ראה טבלת חומרים) או בשיטות דומות עם חיץ הסרת רעלן הפנימי כדי שניתן תהיה להימנע מתגובות חיסוניות של בעלי החיים. בצע את ההוראות של המדריך. להעסיק DDH 2 O כדי לדלל את פתרון פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את הפסולת על ידי ספינינג פתרון DNA במהירות המרבית (20,000 XG). ואז לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז פלסמיד עם ספקטרופוטומטר (ראה חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז פלסמיד עם DDH 2 O ל 1-3 מיקרוגרם (DNA) / μl. הערה: ריכוזים נמוכים יפחיתו את יעילות transfection, ואילו ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לפתרון הזרקה צמיג מדי. חוץ מזה,יעילות transfection תלוי בגודל של פלסמיד ולהיבדק בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה, להכין תערובת פתרון עם לפלסמיד μl דוגמא 40 יחד עם 5 μl PBS (10x) ו -5 ירוקים μl מהיר (0.5%). גרין המהיר נחוץ למעקב אחר תהליך ההזרקה. רצוי, להשתמש PCR-צינורות קיר דקים או Parafilm. הערה: בהתאם לגודל של האשך, בהיקף של 20-50 μl יהיה צורך לכל אשך. </li></ol> 2 הכנת Microinjection פיפטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנימי ורוסיליקט (ראה טבלת חומרים) להכנת טפטפות microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי זכוכית עם חולץ נימים אנכי (ראה טבלת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה נימים עם מלקחיים על ידי ברכות פסים. טיפ הוא בדרך כלל 50-80 מיקרומטר בקוטר ואורכו כ 1 סנטימטר. נסה להימנע מטיפים שהם ארוכים מדי כמו אלה הם לא נוקשה מספיק כדי לחדור את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, sharpen הקצה ב30 מעלות ל45 ° זווית באמצעות beveler micropipette (ראה טבלת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פיפטה microinjection עם לערבב פתרון הזרקה (ראה פלסמיד הכנה). ליישם את הפתרון לחלק האחורי של נימי הזכוכית עם מזרק קטן. הערה: נסה להימנע מבועות אוויר בעת טעינה, אחרת אלה יהיו להזריק לתוך אבוביות הזרע יחד עם פתרון פלסמיד, ולכן יפחית את המוליכות כמו גם ואולי לגרום נזק לרקמות. </li></ol> .3 הרדמה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הפעולה בתנאי ספטית על ידי שימוש בחומר סטרילי (כלומר, מזרק, מחט, מכשירי ניתוח, וכו &#39;). זה יקטין זיהום של בעלי החיים ולהבטיח שיעורי הישרדות טובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברי זכרים לelectroporation בגיל 6-8 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתחל טיפול משכך כאבים לאחר ניתוח, לספק את העכבר עם משככי כאבים הוסיף שתיית מים ביום לפני הניתוח. זה התחתures שיכוך כאבים מקדים במקרה של hypodipsia סבירות גבוהה שלאחר ניתוח (צריכת מים פחת). לשם כך, לחשוף את מי שתייה עם למשל השעיה איבופרופן ילדים (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל). גם מי שתיית תרופות צריכים להיות מסופק ביום אחד ושתיים מהתאוששות בריכוז זהה. משמעות הדבר היא מנה יומית של 7.5 מ&quot;ג / קילוגרם, תקף למשקל 5 מ&quot;ל / מי שתיית ד וגוף של 25g במשך 8 שבועות בגילי C57BL / 6J. משטר משכך כאבים זה מבטיח הקלה על כאב בסיסית והתאוששות מואצת יחד עם גבוהה רווחה 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת ההרדמה עובדת פתרון ביום של ניתוח, לערבב 10% Ketamin ו2% Xylazin ב1: 1 (ראה טבלת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרדים את החיה, להחיל משקל גוף 0.25 מ&quot;ל / 100 מ&quot;ג תת עורי הרדמה (Ketamin = 0.125 גר &#39;/ קילוגרם; Xylazin = 0.025 גר&#39; / קילוגרם). השתמש באתר הזרקה בין האגן וגפיים על מנת למנוע נזק לאיברים ולפציעתם של העכברים. בדרך כלל, יש צורך ב10 דקותעד העכבר בהרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את עיני עכבר עם משחה וטרינר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את מעצר הרדמה עמוק, שניכר על ידי היעדר מוחלט של תגובה. לשם כך, פשוט צובט את הבוהן של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הניתוח, להסיר שיער בבטן עם מכונת גילוח חשמלי או דומה ולחטא את אזור הפעולה עם sterilium או דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך הגחון ישירות מעל בלוטות preputial במרכז אזור הבטן. באותו מקום, למשוך ראשון עור משם ולערוך בו קיצוץ רוחבי עורית קטנה של כ 8-14 מ&quot;מ. לאחר מכן, ימשיך לאורך שכבת שרירי הבטן. הערה: הנגע צריך להיות קטן ככל האפשר כדי להפחית את הפגיעה בבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את רפידות שומן בבטן בזהירות כדי לחשוף את האשכים המצורפים והנח אותו על וילון לפני מוכן עמיד למים חד פעמי נייר ממש ליד אתר החתך (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במשקפת לfind צינור efferent כמטרת ההזרקה. Efferent ductus מזוהה כצומת כלי דקה שבין האשכים ויותרת האשך. הוא ממוקם בסמוך לעורק אשכים הבולט. Ductus פועל כמעט בזווית של ° 45 לעורק ובעליל נכנס epididymidis Caput. הערה: בהתאם לגילו של העכבר, ductus בדרך כלל נקבר ברקמת שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים עדינים כדי לנקות את צינור efferent של רקמת השומן הזה. אחרי זה, למקם את ductus שוחרר ברצועת נייר סטרילי כדי להבטיח את הנראות ברורות של הצינור מבלי לפגוע בסביבה. </li></ol> .4 Microinjection וDNA Application <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את פיפטה microinjection, אשר נטענה עם פתרון פלסמיד ליחידת micromanipulator / מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט המקבילה microinjection לצינור efferent עם הקצה והצביע לעבר אשך ךטה&quot; (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפינצטה בסדר ולהפשיט את הצינור מעל פיפטה microinjection. ודא שהנימים נשמרות במקביל לצינור תוך משיכתו מעל. הערה: הליך זה הוא נוח יותר מאשר לחדור לספינה על ידי הזזת המחט עם micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המחט בזהירות לכיוון האשכים ולעצור בדיוק כפי שחודר אשך ךטה&quot; ישירות מתחת לalbuginea Tunica (איור 2 ג). הערה: במקרה של overreaching אשך ךטה&quot;, פתרון פלסמיד ידלוף למרחב הבין. זה מוביל בדרך כלל לכישלון של transfecting אבוביות זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה של פתרון פלסמיד לנצל microinjector עם ההגדרות הבאות: pi: 100 hPa ti,: 0.2 שניות, ומחשב: 0 hPa (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על כל תהליך ההזרקה על ידי התבוננות האשך מילוי מעמד בעזרת הצבע הירוק. תשמור על עצמך כי האשך מלא רק עד 2/3 שלה נפח עם plפתרון asmid (איור 2E). הערה: אם נפח ההזרקה הוא חריגה, רקמת האשך עלולה להיפגע. </li></ol> .5 Electroporation של אשך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאפשר electroporation היעיל, לספוג את האלקטרודות פינצטה בPBS (1x). הדבר מבטיח מוליכות נאותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצורה חלקה לסחוט את האשך בין האלקטרודות הרטובות (איור 2F). מדוד את ההתנגדות החשמלית עם electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוכחי לאשך. לבצע שמונה פולסים מרובעים של 40 V ב 4 אתרי אשך שונים עם משך קבוע של 50 זמן דופק אלפיות שני ו950 מרווח זמן אלפיות שני. </li></ol> .6 סגירת פצעים ולאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר electroporation נגמר, הנח את האשכים בחזרה במיקום המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את שכבת שרירים הפנימית עם תפר כירורגים (ראה חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור על ידי שימוש בקטעי תפר (ראה טבלת חומרים). משוך את שנינות העור עדפינצטה h. ודא שלא לכלול את השכבה השרירית. הנח את קטעים, כל אחד במרחק של לא יותר מ 5 מ&quot;מ. הערה: מאחר ותפר כירורגים יכול להיבלע על ידי העכבר, קליפים תפר הם העדיפו לסגירת הנגע בעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי להתאושש מהרדמה על מגבות נייר סטרילי להציב בכלוב סטרילי ריק עכבר, המזג על משטח חם 37 מעלות צלזיוס. הכרית צריכה להבטיח את ההתחממות של חצי אחד של כלוב יצירת שיפוע חום. לחיה זו מאפשרת לחפש את האזור הבודד, הכי הנוח בשל מגוון הטמפרטורה בכלוב. בנוסף, לכסות את העכבר עם גיליון של מגבת נייר סטרילי, כך שלחץ יכול להצטמצם עוד יותר. הערה: מאחר שמשטח גופו של העכבר הוא גבוה מרגיל ביחס למסת גוף, בהשוואה לבעלי חיים גדולים יותר, תמיכת התרמית היא בעלת חשיבות מיוחדת לשחזור מוצלח של מכרסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בעלי החיים המופעלים התעוררו באופן מלא, להעביר it להמשך התאוששות בכלוב עכבר חדש מצויד לחלוטין. אין לשים את החיה חזרה לכלוב שלה ישן או לקבוצה של עכברים. ודא שהכלוב הוא נקי וסטרילי ככל האפשר כדי למנוע זיהום פצע. לפקח על תהליך ההתאוששות כולו. כדי להעביר את העכבר בחזרה למתקן הטיפול בבעלי החיים, לחכות עד שהוא התאושש לחלוטין ונראה שהתנהג בצורה נורמלית. הערה: per- נוסף ואסטרטגיות לאחר ניתוח נדונים על ידי אל פריצ&#39;ט-Corning KR et 6. </li></ol>

<ol>
	<li>Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fact+or+fiction:+In+vitro+spermatogenesis.">Fact or fiction: In vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).</li><li>Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+in+vitro+spermatogenesis.">Models of in vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).</li><li>Zizzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+indicator+of+nonviral+transient+transfection+efficiency+in+endometrial+and+testicular+biopsies.">fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).</li><li>Williams, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+foreign+genes+into+tissues+of+living+mice+by+DNA-coated+microprojectiles.">Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).</li><li>Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=statistics,+and+energetics+of+lipid+membrane+electroporation+studied+by+molecular+dynamics+simulations.">statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations.</a> Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon.">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), (2011).</li><li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation.">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).</li><li>Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+germ+cell+transplantation:+an+experimental+approach+with+a+clinical+perspective.">Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective.</a> Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), (2011).</li><li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+developing+mouse+retina.">In vivo electroporation of developing mouse retina.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporated+transgene-rescued+spermatogenesis+in+infertile+mutant+mice+with+a+sertoli+cell+defect.">Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect.</a> Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).</li><li>Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrase+facilitates+long-lasting+foreign+gene+expression+in+vivo+in+mouse+spermatogenic+cells.">An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).</li><li>Umemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+mouse+testes+by+electroporation+and+its+influence+on+spermatogenesis.">Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis.</a> J. Androl. 26, 264-271 (2005).</li><li>Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+gene+expression+in+the+mouse+testis+by+localized+in+vivo+gene+transfer.">Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).</li><li>Hibbitt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+by+electroporation+allows+expression+of+a+fluorescent+transgene+in+hamster+testis+and+epididymal+sperm+and+has+no+adverse+effects+upon+testicular+integrity+or+sperm+quality.">In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality.</a> Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).</li><li>Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+mouse+spermatogenic+cells+using+green+fluorescent+protein+as+a.">In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a.</a> J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).</li><li>Dhup, S., Majumdar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+via+permanent+integration+of+genes+in+repopulating+spermatogonial+cells+in+vivo.">Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+of+testicular+germ+cells+and+transgenesis+by+using+the+mitochondrially+localized+jellyfish+fluorescent+protein+gene.">In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene.</a> FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).</li><li>Majumdar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+generation+of+transgenic+animals+to+evaluate+testis+genes+during+sexual+maturation.">A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation.</a> J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).</li><li>Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+germinal+stem+cells+by+ectopically+expressed+human+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+mouse+Sertoli+cells.">Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells.</a> Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).</li><li>Ike, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+analysis+of+the+mouse+ornithine+decarboxylase+antizyme+haploid-specific+promoter+using+in+vivo+electroporation.">Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation.</a> FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).</li><li>Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+RNAi+in+mouse+Sertoli+cells.">Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).</li><li>Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+murine+lactate+dehydrogenase+C+(Ldhc)+gene+expression.">Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression.</a> Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).</li><li>Yomgogida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+testis:+a+target+of+in+vivo+electroporation.">Mammalian testis: a target of in vivo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).</li><li>Hayes, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Evaluation+of+Analgesic+Regimens+for+Abdominal+Surgery+in+Mice.">An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).</li></ol>

מרטן מיכאליס, אלכסנדר Sobczak, ויואכים מ Weitzel מועסק במכון לביולוגיה של רבייה, לייבניץ המכון לביולוגיה חוות חיות (FBN), Dummerstorf, גרמניה, מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מחקר בתחום הביולוגיה של רבייה, במיוחד בתחום של פריון ויצירת תאי זרע באופן בלתי נמנע זכר מסתמך על אורגניזמים חיים. על מנת לבחון תפקוד אשכים, אין תרבית תאים מתאימה / מערכת במבחנה כבר נקבעה מסוגל משקף את כל השינויים מורפולוגיים המכריעים מspermatogonium דיפלואידי ...

יצירת תאי זרע של יונקים נחשב לתהליך מתוחכם של תאי גזע עצמי חידוש ברציפות עוברים מיטוזה, מיוזה ובידול על מנת להתפתח לתאי זרע הפלואידים בוגרים. שינויים מורפולוגיים אלה בניצוחו של תאים מסוגים שונים ולמרות ניסיונות עמוקים, זה עדיין בלתי אפשרי לחקות את התהליכים הללו בתא התרבות 1,2. לפיכך, מחקר על יצירת תאי זרע עד עכשיו מסתמך על אורגניזמים חיים כמודלים in vivo. באופן כללי, מחקרי תפקוד הגן מבוססים בדרך כלל על בעלי חיים מהונדסים. עם זאת, יצירה והשמירה של מודל חיה מסוג זה היא זמן רב, עלות אינטנסיבית ומורכבת למדי. זה מיוחס לתהליך הרבייה הארוך הנדרש ליצירת ושמירה על transgene לאורך הדורות. בנוסף, המניפולציה הגנטית של האורגניזם כולו על ידי הגישה המהונדס או נוק אאוט הוא נוטה לגרום לליקויים פיסיולוגיים כאשר מיקוד גרםenes עם פונקציות חיוניות באזורים רבים, למשל, מחוץ לאשך או מערכתי. יתר על כן, כמה שיטות transfection חולפות קשורות עם כמה חסרונות קריטיים. לדוגמא, חסרונות אופייניים להעברת גנים בתיווך וירוס הם הפרובוקציה האפשרית של immunoreactions ותקנות בטיחות נוספות, ואילו lipofection 3 וmicroparticle הפגזה 4 עלולה לגרום נזק לרקמות ומוגבלות לעומק תא מסוים ליעילות transfection מספיק. בניגוד לכך, electroporation (EP) כדרך נוספת נפוצה של transfection החולף נראה, להוות טכניקה מבטיחה למאפשר בtransfection vivo וin vivo ניתוח גנטי עולה בקנה אחד. באופן כללי, EP נקרא תופעה דינמית שתלוי במתח הטרנסממברני מקומי עם נקבוביות בתיווך כתוצאה מכך בתוך ננו שניות. t פערים אלה יכולים להישמר במשך אלפיות השניה, מספיקo להעניק גישה לDNA, RNA או מולקולות קטנות 5. כאשר המתח שיושם הוא גבוה מדי, האופי בדרך כלל החולף של EP הוא נוטרל עקב ייצור חום ואינדוקציה של permeabilization המקיף מדי עם נזק בלתי הפיך הסוגר של התא 5. כאן, אנו מראים כי electroporation הוא מערכת transfection יעילה וחסכונית שהוא מסוגל להיות מנוצל לשינוי אשך גנטי כדי להבהיר מאפיינים גנטיים אשכי in vivo. מאמר זה עוסק הכנת פלסמיד, microinjection באמצעות צינור efferent וelectroporation הבא של אשך עכבר. הליך זה יכול להיות האמצעי של בחירה כדי להשיג transfection מהיר, ספציפי והיעיל של אבוביות זרע של אשך עכבר in vivo כדי לחקור תהליכים של יצירת תאי זרע.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td>1-15 PK</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>vertical capillary puller</td></tr><tr><td>Microinjection capillaries</td><td>Clark</td><td>GC100-10</td><td>borosilicate standard wall</td></tr><tr><td>Micropipette beveler</td><td>Bachofer</td><td>Typ 462</td><td>rotating disk beveler</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Nepagene</td><td>CUY 21EDIT</td><td>square wave electroporator</td></tr><tr><td>Tweezer electrodes</td><td>Nepagene</td><td>CUY 650P5</td><td>5 mm &amp;Oslash; disk electrodes</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Cold light source</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection pump</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>homemade</td><td></td><td>XYZ cross table</td></tr><tr><td>Surgical instruments</td><td>FST</td><td></td><td>scissors, forceps, needle holder</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>FST</td><td>Dumont #5, #7</td><td>efferent ducts preparation</td></tr><tr><td>Michel clip applying stapler</td><td>FST</td><td>Michel, 12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Michel suture clips</td><td>FST</td><td>Michel, 12040-01</td><td>7.5 x 1.75 mm</td></tr><tr><td>Surgical suture</td><td>Catgut, Markneukirchen, Germany</td><td>Catgut 00</td><td></td></tr><tr><td>Syringe with 30 G needle</td><td>B. Braun</td><td>Omnican 40</td><td>to load micropipette and for anesthesia</td></tr><tr><td>Plasmid isolation kit</td><td>Promega</td><td>Cat. # A2495</td><td>plasmid Midiprep</td></tr><tr><td>Plasmid pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>Cat. #6084-1</td><td>CMV-promoter + EGFP</td></tr><tr><td>Plasmid pDsRed2-N1</td><td>Clontech</td><td>Cat. #6084-1</td><td>CMV-promoter + DsRed2</td></tr><tr><td>Fast Green dye</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>for dilution in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>10% Ketamine</td><td>Serum Werk, Bernburg, Germany</td><td>Urotamin</td><td>mix in a rate 1:1 with xylazine</td></tr><tr><td>2% Xylazine</td><td>Serum Werk, Bernburg, Germany</td><td>Xylazin</td><td>mix in a rate 1:1 with ketamine</td></tr><tr><td>Sterilium</td><td>Bode Chemie</td><td>Sterillium</td><td>disinfection</td></tr><tr><td>Vet ointment</td><td>S&amp;amp;K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron 5%, Augensalbe</td><td>opthalmic ointment to prevent eye dryness</td></tr><tr><td>To-Pro-3 iodide</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10x PBS, pH 7.4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen, Dolormin</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Consumer Health Care Germany</td><td>01094902</td><td>analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief</td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>T106.2</td><td></td></tr><tr><td>18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo microinjection and electroporation of mouse testis

תרומת וידאו ומאמר זה נותנת תיאור מקיף של microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. טכניקת transfection המסוימת הזה לתאי עכבר אשכים מאפשרת המחקר של תהליכים ייחודיים ביצירת תאי זרע. הפרוטוקול הבא מתמקד בtransfection של תאי עכבר אשכים עם בונה פלסמיד. באופן ספציפי, אנו משמשים וקטור הכתב pEGFP-C1, המבטא משופר חלבון ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 לבטא חלבון אדום ניאון (DsRed2). שני גני הכתב המקודדים היו תחת שליטתו של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV). לביצוע העברת גנים לתוך אשכים עכבר, בונה פלסמיד הכתב מוזרקות לתוך אשכים של עכברים חיים. לשם כך, האשכים של בעלי חיים מורדמים חשופים והאתר של microinjection מוכן. המקום המועדף שלנו שלהזרקה היא צינור efferent, עם אשך ךטה&quot; מחובר סופו של דבר כדרך תחבורה האנטומי של תאי הזרע בין האשך ויותרת האשך. בדרך זו, המילוי של אבוביות הזרע לאחר microinjection מנוהל מצוין ומבוקר בשל השימוש בפתרוני DNA מוכתם. לאחר התבוננות מילוי מספק של האשך על ידי מבנה אבובית הצבעוני שלה, האיבר electroporated. זה מאפשר ההעברה של פתרון דנ&quot;א לתוך תאי האשכים. בעקבות 3 ימים של דגירה, האשכים מוסרים ונחקרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק או אדום, הממחישים את ההצלחה transfection. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק להעברת דנ&quot;א או RNA- בונה לאשך עכבר חיים כדי (מעל) להביע או להפיל את הגנים, להקל בניתוח תפקוד גן vivo. יתר על כן, הוא מתאים ללימוד מושגי כתב או regula גן המשועראלמנטי טורים. לפיכך, היתרונות העיקריים של טכניקת electroporation הם ביצועים מהירים בשילוב עם מאמץ נמוך, כמו גם הציוד הטכני המתון וכישורים הנדרשים בהשוואה לטכניקות חלופיות.

ההגדרה הניסיונית לביצוע microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כפי שהוא משמש על פי הפרוטוקול מתוארת באיור 1. למרות שזה אפשרי לרכוש micropipettes תעשייתי מיוצר, העדפנו ליצור טפטפות שלנו על ידי משיכת (איור 1 א ) וbeveling (איור 1 ב) נימי זכוכית, כך שהם מצוי...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis at JoVE.com

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

in-vivo-microinjection-and-electroporation-of-mouse-testis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

27.8K Views.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN).  מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation. 

Video: In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Cancer Research

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes are critical for the investigations of spindle assembly and chromosome segregation in male meiotic division. The mouse spermatocyte is an ideal model for mechanistic studies of meiosis, however, the effective methods for the analyses of spermatocytes are lacking. In this article, a practical and efficient method for the in vivo inhibition of kinesin-7 CENP-E in mouse spermatocytes is reported. A detailed procedure for testicular injection of a specific inhibitor GSK923295 through abdominal surgery in 3-week-old mice is presented. Furthermore, described here is a series of protocols for tissue collection and fixation, hematoxylin-eosin staining, immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy. Here we present an in vivo inhibition model via abdominal surgery and testicular injection, that could be a powerful technique to study male meiosis. We also demonstrate that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and metaphase arrest in primary spermatocytes during meiosis I. Our in vivo inhibition method will facilitate mechanistic studies of meiosis, serve as a useful method for genetic modifications of male germ lines, and shed a light on future clinical applications.

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

This article reports an in vivo inhibition of CENP-E through abdominal surgery and testicular injection of GSK923295, a valuable model for male meiotic division. Using the immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy assays, we show that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and genome instability in mouse spermatocytes.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video