המחברים מבקשים להודות לחברים במעבדה דאולינג (אהרון Reifler, טרנט וו, אנג&#39;לה באסטה, וויליאם טלפר) שתרמו לפיתוח של הטכניקה ולייצור של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מכון טאובמן, המחלקה לרפואת הילדים באוניברסיטת מישיגן, ובחלק ממענקים מניוון השרירים האגודה (JJD MDA186999) והמכונים הלאומיים לבריאות (JJD 1K08AR054835).

1. Coverslips הכנת פולי-L-ליזין מצופה (זמן: 1 שעות) coverslips הציפוי מאפשר ליישוב myofiber מהיר והידבקות. זה עשוי להתבצע במהלך שלב הניתוק של בידוד myofiber (שלב 2 להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור ולמקם Parafilm על החלק התחתון של צלחת פטרי 60 מ&quot;מ (מותג כלשהו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו תלושי לכסות מיקרוסקופ זכוכית (בקוטר מ&quot;מ 12) על Parafilm בצלחת תרבית רקמת 60 מ&quot;מ או למקם אותם באופן אישי בבארות בודדות של 24 גם צלחות. </li></ol> הערה 1: coverslips העגול הקטן אלה מסייעים להתרכז מספרי myofiber ולצמצם את השימוש בנוגדנים עודף. הערה 2: coverslips גודל אחר יעבוד, עם זאת, הכמויות של חומרים כימיים ועוברים המשמשים צריכים להיות בהתאם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50-200 μl של פתרון poly-L-ליזין (0.01%) על כל מכסה זכוכית בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את coverslips לשבת לפחות אחד הוur ב 37 ° C. incubations יותר לא להשפיע לרעה על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר-L-ליזין פולי פתרון ממכסה הזכוכית ולשטוף פעמיים עם מינימום של 100 PBS μl 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר coverslips לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips מוכן לmyofibers עכשיו. </li></ol> הערה 3: כדי להבטיח סטריליות, ציפוי יכול להיעשות במכסת מנוע ועל coverslips autoclaved. הערה 4: שמור על צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם Parafilm בתחתית. התקנה זו תשמש במהלך ציפוי myofiber וimmunolabeling (מאוחר יותר צעדים). 1 אלטרנטיבי: במקום coverslips הציפוי מייד לפני השימוש, ניתן להשתמש בם מניית coverslip מצופה. צלחת 60 מ&quot;מ פטרי המכילה מינימום של 2 מיליליטר פולי-L-ליזין יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס המכילה coverslips רב. עם חלופה זו מתחילה בצעד 1.5 לעבד את coverslips לmyofibers. חלופה 2: אנחנו גם coverslips מעיל בפולי-L-ornithine. Tשלו הוא יותר עבודה אינטנסיבית, אבל הוא שימושי עבור culturing לטווח ארוך יותר, כי coverslips מצופה פולי-L-ornithine יכול להיות UV שטופל. עם טיפול UV וטכניקה סטרילית זהירה בדרך כלל יכול להישמר myofibers החי בתרבות מן 4-7 ימים. 2. דיסוציאציה של עוברי דג הזברה וציפוי של myofibers (זמן: 1 עד 3 שעות) הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי הטוב ביותר חל עד 3 DPF (לאחר ימי הפריה) עוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי דג הזברה לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר סטנדרטי ולהסיר כמה שיותר מים דגים עודפים ככל האפשר. בדרך כלל, ניתן להשתמש בם 10-20 עובר לכל צינור, אם כי פחות. באמצעות יותר מ 20-25 עוברים לעתים קרובות תוצאות בהכנה של צפיפות יתר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר chorions לפני הניתוק, באופן ידני באמצעות # 5 מלקחיים. לחלופין, ההסרה סיסית כימי מושגת עם טיפול Pronase 10-15 דקות. בדרך כלל, ההסרה הקודמת של סיסית נחוצה רק כאשר אישור מראש של mutפנוטיפ או מורפולוגיה נמלה נדרש, או בעת שימוש בשלבים שבו עוברים הם בקעו באופן טבעי מהסיסי שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 900 μl של CO 2 תקשורת עצמאית לצינור המכיל את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של collagenase הסוג השני 100 μl, ריכוז 3.125 מ&quot;ג / מיליליטר סופי (פתרון collagenase המלאי ב31.25 מ&quot;ג / מיליליטר מדולל ב 1x PBS) להתחיל דיסוציאציה. גם Collagenase IV יכול לשמש לדיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב עוברים על שייקר מסלולית, וtriturate כל 30 דקות ב RT באמצעות Pipetman P1000 לטחינה הדקה. </li></ol> הערה 2: לפקח על ניתוק עובר בזהירות; מעל או מתחת לניתוק (בעיקר יותר) הן הסיבות הנפוצות ביותר לכישלון פרוטוקול. פעמים לעיכול משתנות בהתאם לעוצמת טחינה דקה, מספר עוברים לכל צינור, וגיל העוברים. כמו כן, לעתים קרובות פחות (בהשוואה לסוגים פראיים) לעוברים ממוטציות שרירי שלד. פתק3: זמן עיכול הממוצע לגיל עובר: DPF 1 = 1 שעות, 2 DPF = 1.5 שעות, 3 DPF = 2 שעות, וDPF 4 = 2-2.5 שעה. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול כאשר לא כל עוברים גלויים, עדיין חתיכות מוצקות עדיין גלויות - זה חיוני כדי למנוע overdigestion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות עם עוברים ניתק ב0.8-2.3 XG במשך 3-5 דקות לתאי גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתאי pelleted ולשטוף 2x עם CO 2 תקשורת עצמאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת CO הטרי 2 תקשורת עצמאית לresuspend תאים. 1 מיליליטר משמש בדרך כלל לpreps של 10-20 עוברים. הנפח וניתן לשנותם מבוסס על מספר עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000, עובר השעיה עובר דרך מסנן 70 מיקרומטר. זה מסייע להסיר פסולת לא רצויה מההכנה. </li></ol> הערה 4: השעיה עובר יכולה להיות מסוננת בפעם שנייה דרך מסנן 40 מיקרומטר כדי להסיר פסולת לא רצויה נוסף. מסינון כפול, התאוששות היא approximately 800 μl מנפח התחלתי של 1 מיליליטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 50-100 μl של ההשעיה myofiber לכל coverslip מצופה פולי-L-ליזין. </li></ol> הערה 5: ביצוע שלב 2.9 בצלחות פטרי עם Parafilm על הקרקעית, שהוכן קודם לכן. Parafilm שומר ההשעיה myofiber את ההפעלה מcoverslips המצופה. שמור על צלחות פטרי מכוסות כדי למנוע אידוי. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר myofibers ליישב כ 1 שעות על coverslips המצופה בטמפרטורת חדר. </li></ol> הערה 6: myofibers יתחיל להתיישב בתוך 5-10 דקות. עם זאת, עבור קובץ מצורף myofiber טוב, מינימום של 1 שעות (1-2 hr) מומלץ. מאפשר myofibers להסתפק עוד לא יפגע בהכנה. לincubations יותר (כולל בלילה), ניתן להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת. עם אנטיביוטיקה וטכניקה סטרילית בדרך כלל יכולות להישמר תרבויות חיות עבור 1-2 ימים. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ &#39;בשידור חיyofibers ניתן לצפות בשלב זה. Myofibers מעוברים 2 DPF ומאוחר יותר יהיה לראות כתאים מפוספסים ומוארכים (איור 1). בשלב זה, myofibers מוכן לניתוח בשידור חי או לimmunolabeling עכשיו. </li></ol> באור 7: שריר שלד מ1 DPF עוברים אינו צלחת סיבים מוארכים וכברור מפוספסים. במקום זאת, myoballs הגדול גלוי. בנוסף, במהלך לאחר ניתוק שלב pelleting (שלב 2.6), 1 DPF myoballs צריך להיות centrifuged למינימום של 8 דקות בXG 5,000 להשיג גלולה. לניתוח של עוברים בשלב זה, מומלץ להשתמש בקו המהונדס להביע EGFP במיוחד בשרירי שלד 23. זה יאפשר זיהוי של תאים ממקור שריר לעומת מקורות אחרים. 3. הקרינה Immunostaining של myofibers דג הזברה הניתק (זמן: כ יום 1) 3.1. Immunolabeling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חלק שלתקשורת מmyofibers דבק coverslip המצופה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים באמצעות paraformaldehyde 4% או מתנול. לPFA, להסיר ½ נפח התקשורת ולהחליף עם אותה הכמות של PFA. תקן עבור 10 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר נפח כולל, להחליף עם 50-100 μl של PFA, ולתקן עבור נוספת 10 דקות. לקיבעון אלכוהול, מתנול קר כקרח או אצטון יכול להיות מיושם על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או 5 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף myofibers לפחות 3-5x עם 1x PBS או 1x PBS בתוספת Tween .0.1%. ממוצע לשטוף נפח 50-100 μl לכל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חסימת פתרון לmyofibers (עובד מלאי) ודגירה 20-60 דקות בטמפרטורת חדר. פתרון חסימה משתנות בהתאם לנוגדנים הראשוניים ומשניים. שני הנפוצים ביותר בשימוש במעבדה הם (1) 1x PBS, 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, 1% בסרום כבשים, 0.25% טריטון סופיים X-100 ו (2) X-100, 2 מ&quot;ג / מיליליטר טריטון 0.2% (0.2 % BSA) ו -5% בסרום כבשים / עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חסימת פתרון ולהוסיף נוגדנים עיקריים מדוללים או בנעילת פתרון או PBS. דגירה myofibers הלילה בשעה 4 ° C. הקפד גם Parafilm או לעטוף בניילון נצמד את צלחת פטרי המכילה coverslips טעון myofiber מצופה בנוגדן. חתיכות קטנות של מגבת נייר טבולה ניתן להוסיף ליצירת תא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן ראשוני מcoverslips ולשטוף coverslips 3-5x למשך 5 דקות עם PBS או פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים משני בריכוז מתאים בדילול מלא ב1x PBS או פתרון חסימה ל1-2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדנים משני ולשטוף myofibers 3-5x בPBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. </li></ol> 3.2. coverslips הרכבה <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1-2 טיפות של מגיב antifade לשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בזהירות את coverslip המצופה וimmunolabled באמצעות מלקחיים ומקום (myofibers למטה) coverslip על מגיב antifade בשקופית מיקרוסקופ. </li></ol> הערה 1: שימו לב לכיוון של גcoverslip oated הוא קריטי. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1-2 Kimwipes על משטח מוצק קשה. במהירות להפוך את השקופיות עם coverslips המצופה נח על מגיב antifade ולמקם אותו (coverslip למטה) על Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ אור לפינות של שקופית מיקרוסקופ כדי להסיר antifade העודף וליצור חותם חזק בין השקופיות וcoverslip </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לantifade שנותר לו להתייבש במשך 5-10 דקות ב RT, אז myofibers מוכן לתמונה (2A דמויות ו-B) או בחנות ב 4 ° C. </li></ol> 4. סידן הדמיה של תא חי באמצעות GCaMP3 ניתן לבצע ניסויי תא חיים בmyofibers לפני הקיבוע (בעקבות צעד 2.10). הפרוטוקול הבא מתאר הדמיה לחיות בmyofibers להביע 24 GCaMP3, מחוון סידן מקודדים גנטי, המתבטא על ידי האמרגן שרירי שלד הספציפי דג הזברה α-אקטין (pSKM) 23. לחלופין,בטכניקה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש צבעי מחוון סידן כגון פורע-2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עובר עם pSKM: GCaMP3 לבנות בשלב 1-2 התאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב3 DPF, לאסוף זחלים ולהכין myofibers כמפורט בסעיפים 1 ו -2. לאפשר myofibers לדבוק למינימום של 1 שעה. לטכניקה זו, coverslips מכין במנות 24 גם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל תקשורת עודפת, ולהוסיף 300 μl של תקשורת העצמאית הטרי CO 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. myofibers החיובי GCaMP3 צריך להיות גלוי תחת הקרינה ירוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המצלמה להקלטה, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון קפאין 30 מ&quot;מ בCO 2 תקשורת עצמאית. כדי לעורר את התאים, בעדינות פיפטה 300 μl של פתרון קפאין לתוך הבאר בהגדלה. בתוך 5-10 שניות, myofibers החיובי GCaMP צריך להגיב לקפאין עם גידול מהיר בקרינה (איור 3). MyofibERS עשוי גם להתכווץ. ראוי לציין, קפאין גורם לשחרור סידן מחנויות reticulum sarcoplasmic 25. סוכנים אחרים, כגון KCl 26 וryanodine 4, יכולים לשמש כדי לחקור שחרור סידן מתנהלת. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li><li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+myoplasmic+gap:+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li><li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction.">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li><li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors:+structure,+expression,+molecular+details,+and+function+in+calcium+release.">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity:+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan:+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease.">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey.">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li><li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy.">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Zebrafish+system.">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li><li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle.">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling,+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy.">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li><li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit.">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene,+CACNB1,+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants.">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li><li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles.">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=accordion,+a+zebrafish+behavioral+mutant,+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2++pump+SERCA1.">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים.

דג הזברה הוא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח שרירים ובתפקוד ב25,27,28 vivo. גם הם צמחו כנכס בעל ערך לדוגמנות מחלות שריר אנושי 14,15,20,29. אמנם ננקטו צעדים גדולים כדי לקדם את השימוש ויישום של דג הזברה לחקר תפקוד שרירים ומחלות שריר, יש צורך קריטי מת...

שריר שלד הוא רקמה מאוד מיוחדת אחראית ליצירת כוחות ההתכווצות הכרחיים לתנועתיות. התכווצות היא יזם באמצעות תהליך המכונה צימוד עירור והתכווצות (EC) שממיר את אותות חשמליים לשחרור סידן מחנויות תאית 1,2. שחרור סידן תוך תאי מפעיל את sarcomere לקצר וליצור כוח. הרכיבים ספציפיים הרבים של המכונות מולקולריות האחראים לתיווך צומת neuromuscular שידור 3, צימוד EC 4,5, והתכווצויות תלויות יקטין שרירן 6 ימשיכו להיות הנושא המתמשך של מחקר אינטנסיבי. בנוסף, חלבונים שמייצבים את קרום השריר במהלך 7,8 ההתכווצות לתווך שאיתות בין myofiber והמטריצה ​​תאית 7,9 זוהו ונחקרו בפירוט רב. מוטציות במספר גנים חשובים למבנה שרירפונקצית nd זוהה כגורמים למחלות שריר שלד אנושיים <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">(http://www.musclegenetable.org/).</a> מחלות אלו, מסווגים רחב כmyopathies שלד וניוון שרירים המבוססים על מאפיינים קליניים וhistopathologic, קשורות לחולשת שרירים, נכות לכל החיים, ו10,11 תמותה המוקדם. דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מצטיינת לדוגמנות ולומד מחלות שריר שלד אנושיות 8,12,13. זה כבר מועסק כדי לאמת את המוטציות גנטיות חדשות 8, מגדיר את ההיבטים חדשים של הפתופיזיולוגיה המחלה 14,15, ולזהות גישות טיפוליות חדשות 15,16. כוחו של דג הזברה לחקר מחלת שריר אדם מתייחס למספר רב של צאצאים, ההתפתחות המהירה של מבנה שריר ותפקוד, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה, ואת הקלות של מניפולציה גנטית ותרופתית של הזברה מתפתחתדגים 17. אנו ואחרים 12,18,19 לאחרונה פיתחנו טכניקה פשוטה לבידוד המהיר ויעיל של myofibers מדג הזברה מתפתחת. מתודולוגיה זו אפשרה הבחינה של myofibers בפירוט רב יותר מאשר יכול להיות מסופק על ידי ניתוח עובר שלם. הטכניקה נוצלה לאפיון של לוקליזציה subcellular חלבון 20 כמו גם לזיהוי מאפייני histopathologic חשובים כחלק ממחקרי אימות במודלים של מחלה חדשה שפותחו 21. יתר על כן, myofibers המבודד יכול בנוסף לשמש הדמיה חיות וללימודי אלקטרו 22, טכניקות שתאפשרנה החקירה של היבטים מרכזיים של תפקוד שרירים. הפרוטוקול הספציפי לבידוד myofiber, יחד עם שתי דוגמאות של ניסויים האנליטי שלאחר מכן, הוא מפורט בחלקים הנותרים של כתב היד הזה.

<table><tbody><tr><td>24-well culture plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Independent medium</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;alpha;-Actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR antibody</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מודל יקרת ערך לחקר תפקוד שרירי שלד ולחקר מחלות שריר אנושיים. למרות יתרונות רבים המוצעים על ידי ניתוח vivo של שרירי שלד בדג הזברה, לדמיין את סביבת החלבון המורכבת והמחוטב האחראי על תפקוד שרירים, במיוחד בכל עוברים, יכול להיות בעייתי. הפרעה זו נובעת מגודלו הקטן של שרירים שלד דג הזברה (60 מיקרומטר) ואת הגודל קטן עוד יותר של sarcomere. כאן אנו מתארים ולהדגים שיטה פשוטה ומהירה לבידוד myofibers שלד מעוברים וזחלי דג הזברה. אנו גם פרוטוקולים הממחישים טכניקות הכנת הודעה שימושיות לניתוח מבנה שרירים ובתפקוד. באופן ספציפי, אנחנו פירוט הלוקליזציה הבאה immunocytochemical של חלבוני שריר שלד והניתוח איכותני של שחרור סידן מגורה באמצעות הדמיה סידן תא חי. בסך הכל, בסרטון וידאו זהמאמר מספק שיטה ישר קדימה ויעילה לבידוד והאפיון של myofibers שלד דג הזברה, טכניקה המספקת צינור ללימודים שלאחר מכן מספר עצום של מבנה שריר ותפקוד.

immunolabeling ניאון של myofibers (איור 2) תמונות מראים דפוס ניאון תיוג צפוי מmyofibers immunostained לאחר בידוד וציפוי מוצלחים. Myofibers סומן בתווית עם או קולט אנטי ryanodine (1:100) (איור 2 א) או אנטי-α-actinin (1:100) (איור 2) נוגדנים, ולחש?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations at JoVE.com

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcellular חלבון, ופיזיולוגיה של שרירים.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  University of Michigan.  דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcell...

Video: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Developmental Biology

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Medicine

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...