著者は、技術の発展に原稿の生産に貢献しダウリングラボのメンバー（アーロンReifler、トレント·ウォー、アンジェラバスタ、ウィリアム·テルファー）に感謝したい。この作品は、トーブマン研究所、ミシガン大学の小児科、および筋ジストロフィー協会（JJD MDA186999）と国立衛生研究所（JJD 1K08AR054835）からの補助金の一部はによって資金を供給された。

1。ポリ-L-リジンコートしたカバーガラスの製造（時間：1時間） コー​​ティングしたカバーは、急速な筋線維の沈降との密着性を可能にします。これは、筋線維アイソレーション（以下、工程2）の解離工程中に行ってもよい。 <ol><li>カットして60ミリメートルペトリ皿（どのブランド）の底にパラフィルムを配置します。 </li><li> 60ミリメートルの組織培養皿にパラフィルム上の顕微鏡カバーガラススリップ（直径12mm）を配置し、24ウェルプレートの単一のウェルに個別に配置します。 </li></ol>注1：これらの小さな丸いカバースリップは、筋線維数を集中し、過剰な抗体の使用量を減らすのに役立つ。 注2：他のサイズのカバーグラスは動作しますが、使用した試薬および胚のボリュームは、それに応じて調整する必要があります。 <ol start="3"><li>ピペットシャーレ内の各カバーガラス上にポリ-L-リジン溶液（0.01％）の50〜200μL。 </li><li>カバースリップは、少なくとも1のHO座ってできるように37℃でのUR長いインキュベーションは否定的な結果には影響しません。 </li><li>カバーガラスからポリ-L-リジン溶液を除去し、100μlの1X PBS最小で二回洗う。 </li><li>カバーグラスを乾燥させる。 </li><li>カバースリップは今筋線維の準備ができている。 </li></ol>注3：無菌性を保証するために、コーティングはフード内でかつオートクレーブカバースリップ上で行うことができる。 注4：底にパラフィルムで60ミリメートルペトリ皿にしてください。このセットアップでは、筋線維のメッキと免疫標識（後の手順）中に使用されます。 代替案1：代わりに、使用直前にコーティングカバースリップを、コーティングされたカバースリップのストックを使用することができる。 2ミリリットルのポリ-L-リジンの最小値を含む60ミリメートルのペトリ皿は、多数のカバースリップを含有する4℃で保存することができる。この代替では筋線維のためのカバースリップを処理するためにステップ1.5から開始します。 代替2：私たちも、ポリ-L-オルニチンでのコートカバースリップ。 T彼は、より労働集約的であるが、ポリ-L-オルニチンでコーティングしたカバーガラスをUV処理することができるので、長期培養に有用である。 UV処理と慎重な無菌テクニックと一緒に暮らすの筋線維は、一般的に4-7日の培養で維持することができる。 2。筋線維のゼブラフィッシュ胚とメッキ（：1から3時間の時間）の解離注：標準のプロトコルは3 DPF（日後受精）の胚に最善適用されます。 <ol><li>標準1.5ミリリットル遠心管にゼブラフィッシュ胚を移し、可能な限り余分な魚の水を除去する。典型的には、より少ないけれどもチューブ当たり10〜20の胚を使用することができる。以上の20〜25の胚を使用すると、多くの場合、過剰な濃度の製剤が得られる。 <ol><li> ＃5鉗子を使用して手動で、解離前絨毛膜を除去します。あるいは、化学的絨毛膜の除去は、10〜15分間プロナーゼ処理によって達成される。一般的に、絨毛膜の前の除去にのみ必要とされるときMUTの事前確認アリ表現型または形態が必要とされる、または段階を使用するときに胚を自然に絨毛膜から孵化される場合。 </li></ol></li><li>胚を含むチューブに、CO 2の独立したメディアの900を添加する。 </li><li> 100コラゲナーゼタイプIIのμL、最終濃度3.125 mg / mlの解離を開始します（31.25ミリグラム/ 1X PBSで希釈したミリリットルの在庫コラゲナーゼ溶液）を追加します。コラゲナーゼIVはまた、解離のために使用することができる。 </li><li>オービタルシェーカー上で胚を回転させ、チュレーション用P1000ピペットマンを使用して、室温で30分ごとに粉砕する。 </li></ol>注2：慎重に胚の解離を監視し、プロトコル障害の最も一般的な理由である以上、または解離の下（特に上で）。消化のための時間は粉砕、チューブあたり胚の数、および胚の時代の強さに応じて異なります。また、骨格筋の変異体からの胚（野生型に比較して）以下であることが多い。 ノート3：胚歳あたりの平均消化時間= 1時間1 DPF、2 DPF = 1.5時間、3 DPF = 2時間、および= 2-2.5時間4 DPF。 <ol start="5"><li>何胚全体が表示されていない、まだ固体部分がまだ表示されているとき、消化を停止する- これは過剰消化を防ぐために不可欠です。 </li><li>ペレット細胞に3〜5分間0.8から2.3 XGで解離胚と遠心管。 </li><li>ペレット化した細胞からの上清を除去し、CO 2の独立したメディアで2回洗う。 </li><li>細胞を再懸濁するため、新鮮なCO 2の独立したメディアを追加します。 1mlの典型的に10〜20胚のプレップのために使用される。ボリュームは、胚番号に基づいてスケーリングすることができる。 </li><li> P1000ピペットを用いて、70μmのフィルターを介して胚サスペンションを渡します。これは準備から不要な破片を除去するのに役立ちます。 </li></ol>注4：胚の懸濁液は、さらに不要な破片を除去するために40μmのフィルターを通して再度濾過することができる。二重ろ過から、回復がapproximです1ミリリットルの出発体積からately 800μL。 <ol start="10"><li>各ポリ-L-リシン被覆カバーガラスに筋線維懸濁液の約50〜100μLを加える。 </li></ol>注5：底にパラフィルムでペトリ皿のステップ2.9を実行して、先に調製した。パラフィルムをコートしたカバーガラスをオフに実行しているから、筋線維のサスペンションを保持します。蒸発を防ぐためにカバーされたペトリ皿にしてください。 <ol start="11"><li>筋線維は、室温でコーティングしたカバーガラス上に約1時間を決済することができます。 </li></ol>注6：筋線維は、5〜10分以内に安定し始めます。しかしながら、良好な筋線維結合のために、1時間（1〜2時間）の最小を推奨します。筋線維が長いために解決できるようにすると、準備に害を与えない。 （一晩を含む）より長いインキュベーションのために、抗生物質を培地に添加することができる。抗生物質や、無菌技術を用いて生きた培養は通常、1〜2日間維持することができる。 <ol start="12"><li>ライブMyofibersこの時点で観察することができる。胚2 DPFの筋繊維、後に横紋と細長い細胞（ 図1）として認識されます。この時点では、筋線維現在ライブ解析用または免疫標識の準備ができている。 </li></ol>注7：胚DPF 1からの骨格筋は、細長い明確横紋繊維プレートはありません。その代わりに、大規模なmyoballsが表示されます。また、ペレット化相ポスト解離（ステップ2.6）中に、1のdpf myoballsペレットを達成するために、5000×gで8分間遠心分離し、最低される必要がある。この段階で胚の解析のために、骨格筋23で特異的にEGFPを発現するトランスジェニックラインを使用することをお勧めします。これは、他のソース対筋起源からの細胞の同定を可能にする。 3。解離ゼブラフィッシュ筋線維の蛍光免疫染色（時間：約1日） 3.1。免疫標識<ol><li>の一部を除去コー​​ティングされたカバーガラスに付着した筋線維からメディア</li><li> 4％パラホルムアルデヒドやメタノールを用いて細胞を固定します。 PFAの場合は、メディアの容量½削除して、PFA、同量と交換してください。 、総ボリュームを削除し、PFAの50〜100μlで交換し、さらに10分間固定した後、室温で10分間固定してください。アルコール固定のために、氷冷メタノールまたはアセトンは、それぞれ、10分又は5分間、4℃で適用することができる。 </li><li>筋線維を少なくとも1×PBSまたは1x PBSで3-5X +0.1％のTweenを洗う。平均洗浄量は、カバースリップあたり50〜100μLです。 </li><li>筋線維を解決（作業ストック）をブロックに追加し、室温で20〜60分間インキュベートする。ブロッキング溶液は、一次および二次抗体によって異なります。実験室で使用される2つの最も一般的なものは、（1）1×PBS、2 mg / mlのBSA、1％ヒツジ血清、0.25％トリトンX-100を最終的なものであり、（2）0.2％トリトンX-100、2 mg / mlのである（0.2 ％のBSA）および5％ヒツジ/ヤギ血清。 </li><li>ブロッキング溶液外し、Bのいずれかで希釈した一次抗体を追加溶液又はPBSをロックする。 4℃で一晩筋線維をインキュベートパラフィルムのいずれかにいることを確認し、または抗体でコーティングされた筋線維にロードされたカバースリップを含むペトリ皿をサランラップでラップします。湿らせたペーパータオルの小片を、加湿チャンバを作成するために添加することができる。 </li><li>カバースリップからの一次抗体を除去し、PBSまたはブロッキング溶液で5分間カバーグラスを3-5Xを洗う。 </li><li> 1X PBSまたはRTで1〜2時間ブロッキング溶液中に希釈した適切な濃度で二次抗体を加える。 </li><li>二次抗体を除去し、室温で5分間ずつ筋繊維PBS中の3-5Xを洗う。 </li></ol> 3.2。マウントカバースリップ<ol start="9"><li>顕微鏡スライドに退色防止剤の1〜2滴を適用します。 </li><li>慎重にピックアップコーティングされたとimmunolabledカバーガラスをピンセットと場所（筋線維ダウン）を使用して、顕微鏡スライド上の退色防止剤にカバースリップを。 </li></ol>注1：Cの向きに注意oatedカバーガラスは非常に重要です。 <ol start="11"><li>硬い固体表面上に1〜2キムワイプを置く。すぐに退色防止剤に載っコートしたカバーガラスとスライドを反転させ、キムワイプ上（下カバースリップ）に置きます。 </li><li>過剰退色を削除し、スライドとカバーガラスの間に緊密なシールを形成するために、顕微鏡スライドの隅に光の圧力を加える</li><li>退色はRTで5〜10分間乾燥さ残りを許可し、筋線維は、画像（ 図2AおよびB）または4℃で保存する準備が整いました</li></ol> 4。 GCaMP3を使用した生細胞カルシウムイメージング生きた細胞実験の前（ステップ2.10以下）に固定筋線維を行うことができる。次のプロトコルはGCaMP3 24、骨格筋の特定のゼブラフィッシュのα-アクチンプロモーター（pSKM）23で表さ遺伝的にコード化されたカルシウム指示薬を発現する筋線維のライブイメージングを説明します。別の方法として、この技術は、容易にこのようなフラ-2カルシウムインジケーター色素を使用するように適合させることができる。 <ol><li> pSKMで胚を注入：GCaMP3は1〜2細胞期の構築</li><li> 3 DPFで、幼虫を収集し、セクション1と2で説明したように筋線維を準備。筋線維は、1時間の最低付着することができます。この技術については、24ウェル皿にカバーガラスを製造することが必要である。 </li><li>慎重に余分なメディアを取り出して、室温で新鮮なCO 2の独立したメディアの300μlを加える。 </li><li>倒立顕微鏡で細胞を観察します。 GCaMP3正筋線維は、緑色の蛍光の下で表示されるはずです。 </li><li>必要に応じて、記録するためのカメラをセットアップします。 </li><li> CO 2の独立したメディアが30mmのカフェイン溶液を調製する。細胞を刺激するために、ゆっくりと拡大してウェルにカフェイン溶液を300μlをピペットで。 5月10日秒以内、GCaMP正筋線維は、蛍光の急激な増加（ 図3）とカフェインに反応する必要があります。 MyofibERSは、契約があります。注目すべきは、カフェインは、筋小胞体店25からのカルシウム放出を誘導する。例えば、26のKCl及びリアノジン4などの他の薬剤は、誘導性カルシウム放出を研究するために使用することができる。 </li></ol>

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Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

著者らは、競合する利害を宣言していません。

ゼブラフィッシュは、 生体内で 25,27,28 での筋肉の発達や機能を研究するための強力な脊椎動物のモデルシステムである。彼らはまた、人間の筋肉の病気14,15,20,29をモデル化するための貴重な資産として浮上している。長足の進歩は、筋機能および筋肉疾患の研究のためにゼブラフィッシュを使用して、アプリケーションを進めるためにとられているが、遺伝的?...

骨格筋は運動性のために必要な収縮力を発生させるための責任高度に特殊化組織である。収縮は、細胞内貯蔵1,2からのカルシウム放出に電気信号に変換興奮収縮（EC）のカップリングと呼ばれるプロセスを介して開始される。細胞内カルシウム放出は、力を短縮し、生成するサルコメアをアクティブにします。神経筋接合部の伝達3、ECカップリング4,5、およびアクチン-ミオシン依存性収縮6の媒介に関与する分子機構の多くは、特定のコンポーネントには、熱心な研究の継続的な主題であり続ける。また、収縮7,8および筋線維と細胞外マトリックスの7,9の間のシグナリング、その仲介の間に筋肉の膜を安定させるタンパク質が同定されており、非常に詳細に研究した。 筋肉構造aの重要な多数の遺伝子における変異番目の関数は、（ヒト骨格筋疾患の原因として同定されている<a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ）。臨床的および組織病 ​​理学的特徴に基づく骨格筋障害や筋ジストロフィーなど大きく分けて、これらの疾患は、筋力低下、生涯障害、早期死亡率10,11に関連している。ゼブラフィッシュは、モデリングおよびヒト骨格筋疾患8,12,13を研究するための優れたシステムであることが証明されている。それは、新たな遺伝子変異8を検証する疾患病態生理学14,15の新たな側面を定義し、新たな治療アプローチ15,16を同定するために使用されている。ヒトの筋肉疾患を研究するためのゼブラフィッシュのパワーが仔多数の筋構造および機能の急速な発展は、ゼブラフィッシュ胚の光学的透明度、及び現像シマウマの遺伝的および薬理学的操作の容易さに関する魚17。 私たちは、他の12,18,19は最近開発ゼブラフィッシュからの筋線維の迅速かつ効率的に分離するための簡単な技術を開発した。この方法論は、全胚分析によって提供できるよりもより詳細に筋線維の検査を可能にした。技術は、タンパク質の細胞内局在20の特徴付けだけでなく、新たに開発された疾患モデル21における検証研究の一環として、重要な組織病 ​​理学的特徴の識別に利用されてきた。さらに、孤立した筋線維は、さらにライブイメージング用および電気生理学的研究22、筋肉機能の重要な側面の問い合わせを可能に技術を使用することができます。その後の分析的実験の2つの例と一緒に筋線維の分離のための特定のプロトコルは、この原稿の残りの部分で詳しく説明している。

<table><tbody><tr><td>24-well culture plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Independent medium</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;alpha;-Actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR antibody</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

ゼブラフィッシュは、骨格筋機能を探索するため、およびヒト筋疾患を研究するための貴重なモデル系であることが証明された。ゼブラフィッシュにおける骨格筋のin vivo解析によって提供される多くの利点にもかかわらず、特に全体の胚では、筋肉の機能を担う複雑かつ微細構造化タンパク質環境を可視化する、問題となる可能性がある。この障害は、ゼブラフィッシュの骨格筋（60ミクロン）のサイズが小さく、筋節のさらに小さいサイズに起因しています。ここでは、説明し、ゼブラフィッシュの胚および幼生から骨格筋線維を分離するための簡単​​かつ迅速な方法を示しています。また、筋肉の構造および機能を分析するための便利なポストの調製手法を例示するプロトコルを含む。具体的には、詳細骨格筋タンパク質のその後の免疫細胞化学的局在化および生細胞カルシウムイメージングを介して刺激されたカルシウム放出の定性分析。全体として、このビデオ記事では、ゼブラフィッシュの骨格筋線維の単離および特徴、筋肉の構造と機能の無数のその後の研究のための導管を提供して技術が素直で効率的な方法を提供する。

筋線維の蛍光免疫標識（ 図2） 筋線維から予想される蛍光標識パターンを示す画像が正常な分離とめっき後に免疫染色。筋線維は抗リアノジン受容体（1:100）（ 図2A）または抗α-アクチニン（1:100）（ 図2B）抗体のいずれかで標識し、それぞれトライアドとZ帯の免疫染色を明らかにしてきた。使用した二次抗体は、アレクサフ...

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Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

ゼブラフィッシュは、骨格筋のヒト障害をモデル化するための新たなシステムである。私たちは、胚および幼虫のゼブラフィッシュから骨格筋筋線維を隔離するために迅速かつ効率的な方法が記載されている。この方法は、単一の骨格筋線維の形態、タンパク質の細胞内局在、および筋生理学の研究に適した高密度の線維調製物が得られる。

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K ビュー.  University of Michigan. ゼブラフィッシュは、骨格筋のヒト障害をモデル化するための新たなシステムである。私たちは、胚および幼虫のゼブラフィッシュから骨格筋筋線維を隔離するために迅速かつ効率的な方法が記載されている。この方法は、単一の骨格筋線維の形態、タンパク質の細胞内局在、および筋生理学の研究に適した高密度の線維調製物が得られる。 

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

生物学

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

医学

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

電気生理学的研究のための成体、幼若、幼虫および胚性ゼブラフィッシュからの心臓および血管平滑筋細胞の単離(英語)

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...