הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לחקור כיצד רקמות, כגון שרירי השלד, מווסתות את גודלן, מה שנותר שאלת מפתח בביולוגיה התאית וההתפתחותית עם השלכות פיזיולוגיות ורפואיות חשובות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שניתן לצפות ולמדוד צמיחה תאית בבעלי חיים חיים in vivo עם רמה גבוהה של דיוק מרחבי וזמני. התקדמות בהבנה הבסיסית של צמיחת שרירים מוקדמת יכולה להדגיש את המקורות ההתפתחותיים של בעיות שרירים מוקדמות ולהוביל לגילוי של Novo Therapeutics להגנה מפני אובדן שרירים אצל קשישים וחולים עם הפרעות בזבוז שרירים.
הכינו 1% LMA בצינור של 1.5 מיליליטר ושמרו אותו בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר. בחרו דגים להרכבה והרדימו כל דג באופן ארעי. כדי למנוע מכת חום, הסירו את ה-LMA aliquot מגוש החום ותנו לו להתקרר בדיוק מעל הגדרה.
קחו צלחת פטרי בקוטר 60 מיליליטר המצופה בשכבה של 1% LMA והניחו אותה על במה של מיקרוסקופ מנתח. מעבירים את הזחל עם פיפטה פסטר מפלסטיק של מיליליטר אחד על צלחת פטרי מצופה 60 מילימטר ומסירים כמה שיותר מדיום מועבר. לאחר מכן, עדיין באמצעות פיפטה פסטר, הניחו כמה טיפות של LMA על הדג וכיוונו במהירות את הזחל קרוב לפני השטח העליונים של ה-LMA עם הציר האנטרופוסטרי והדורסו-בנטרלי שלו בטווח של 10 מעלות מהאופקי, באמצעות מלקחיים או מחט זכוכית עדינה ומלוטשת באש לפני שה-LMA שוקע.
לחלופין, השתמשו בפיפטת פסטר מפלסטיק במיליליטר אחד. לאסוף את הזחלים עם מינימום דגים בינוני ולהעביר את הזחלים לתוך aliquot של LMA מקורר. אפשרו לזחל לשקוע במשך חמש שניות כדי להיות מוקף כולו ב-LMA.
לאחר מכן שלפו את הזחל והעבירו אותו בטיפה של LMA על צלחת הפטרי המצופה באגרוז. מקם במהירות את הזחל כפי שהוכח קודם לכן. אם הזחלים אינם מורכבים כראוי אופקית ליד פני השטח של טיפת האגרוז, להסיר ולהטמיע מחדש, ניתן לשלוף את הזחלים בקלות על ידי שאיבה עדינה באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק של מיליליטר אחד וניתן להסיר את LMA בעדינות באמצעות מגבונים כימיים.
המתן כ-10 דקות עד שה-LMA יתייצב. להציף את המנה עם כ 10 מיליליטר של דגים המכילים tricaine בינוני. כדי ללכוד ערימות קונפוקליות, תנו לדגים הרכובים לנוח לפחות 10 דקות לפני הסריקה, שכן מתרחשת נפיחות אגרוז.
טען את צלחת הדגימה לשלב של המערכת הקונפוקלית. אתר את הזחלים והתמקד בסומיט הרצוי. ניתן לבחור בסומיט 17 בגלל קלות הלוקליזציה שלו ליד פתח האוורור האנאלי וקלות ההדמיה.
בדוק על ידי ספירת סומיטים מהחזית. כדי ללכוד תמונות YS, הגדר כאילו כדי ללכוד ערימת Z. התחילו בהגדרת הנקודות העליונות והתחתונות של הדג.
ניתן ללכוד גם צד שמאל וגם צד ימין לפי הצורך, מה שמבטיח שכל סריקות ה-YZ המהירות לוכדות את האזורים הרצויים. כוון את אזור הסריקה עבור הדגים כפי שתוכנת הקונפוקל מאפשרת. מקמו את הדג עם ציר האנטרופוסטריור, במקביל לציר ה-dex של התמונה והציר הגבי במקביל לציר ה-Y עם סומיט 17 במרכז השדה.
התמקדו במישור ברמה בינונית במיוטום העליון, שבו כל חצאי הסומיט האפאקסיאליים וההיפאקסיאליים, יחד עם המיוספטה האנכית והאופקית נראים לעין ולוכדים תמונת XY ברזולוציה גבוהה. תן שם לקובץ ושמור את התמונה. כדי ללכוד את תמונות ה-YZ, ציירו קו גב לגחון מדויק על פני הסומיט שנבחר, בניצב לציר האנטרופוסטריור של הדג.
הוסף מיקום אנטרופוסטרי שנבחר, ולאחר מכן בצע סריקת קו מחסנית Z. חזור על סריקת קו YZ שלוש פעמים במיקומים אנטרופוסטריוריים מוגדרים לאורך המיוטום שנבחר כדי ללכוד את YZA, YZM ו- YZP. תן שם לתמונות אלה ושמור אותן עם תמונת XY הקשורה.
פרוטוקול זה כונה שיטת ארבע הפרושים וניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנת זן או ImageJ. כדי ליצור תא גירוי, קחו צלחת באר בגודל 6 על 35 מילימטרים וצרו שני פתחים קטנים בקוטר של פחות מחמישה מילימטרים, במרחק של סנטימטר אחד זה מזה בכל צד של כל באר באמצעות ברזל הלחמה צר. לאחר שנוצר, ניתן לעשות שימוש חוזר בתא הגירוי.
משחילים זוג חוטי כסף או פלטינה דרך הפתחים של כל באר. ניתן ליישם את חומר ההדבקה הרב פעמי ליד הפתחים כדי לשמור על החוטים במקומם ולהבטיח הפרדה של סנטימטר אחד בין החוטים. בשלושה ימים לאחר ההפריה, פצלו את הדגים לשלושה תנאים, דג בינוני בקרה, לא פעיל ולא פעיל פלוס גזע.
עבור קבוצות גזע לא פעילות ולא פעילות, מרדימים זחלים 72 שעות לאחר ההפריה עם טריקיין 0.6 מילימולרי. עבור הדגים הבינוניים לשלוט דגים, להשאיר אותם unanesthetized. הכינו 60 מיליליטר של 2% אגרוז במדיום דגים.
המיסו אותו ביסודיות באמצעות מיקרוגל ותנו לו להתקרר. לאחר מכן מוסיפים tricaine ויוצקים לפחות ארבעה מיליליטר לתוך כל באר של חדר הגירוי. הוסיפו מיד מסרקים בהתאמה אישית, בעלי ארבע בארות בין האלקטרודות.
יש להמתין 10 דקות עד שהג'ל יתייצב. הסר מסרקים בזהירות כדי ליצור ארבע בארות מלבניות. מלאו כל באר במי טריקיין והניחו זחל אחד מורדם, לא פעיל פלוס גזע בכל באר באמצעות מיקרו פיפטה, כאשר הגישה האנטרופוסטרית שלהם ניצבת לאלקטרודות.
בדקו תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי המנתח אם כל דג מורדם במלואו בתוך כל תא היטב. חבר מגרה אלקטרופיזיולוגי מתכוונן, יוצר דפוסים, לתא באמצעות בקר קוטביות, באמצעות תפסי תנין המחוברים לכל אלקטרודה בצד אחד של התא. לאחר מכן עוררו את הדג כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט.
בדקו באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהדגים מגרים. הגירוי החשמלי אמור לגרום להתכווצות דו-צדדית נראית לעין ולתנועה קלה אחת לחמש שניות בעקבות הפרמטרים המתוארים. לאחר הגירוי, יש להסיר בזהירות דגים מכל באר על ידי שטיפתם בעדינות עם פיפטה מפלסטיק ולחזור לאינקובטור במדיום דגים טרי המכיל טריקאין.
יוצקים את מי הטריקיין מתוך התא ומשתמשים במלקחיים כדי לחתוך ולהסיר את האגרוז מכל באר, לשטוף את הבארות במי ברז ולאפשר להן להתייבש. לצורך ניתוח גודל השריר, המכונה שיטת ארבע הפרוסות, התקבלו תמונות XY ו- YZ של שריר זחל דג זברה וחושב נפח הסומיט. נצפה מתאם חזק בין שיטת ארבע הפרוסה לשיטת הערימה המלאה, אם כי שיטת ארבע הפרושים נתנה הערכת נפח מעט גדולה יותר.
ניתוח נפחי של המיוטומים הסמוכים של סומיטים 16 ו-18 גילה שכל סומיט היה גדול בכ-7% מזה שמאחוריו. חקירה נוספת העלתה כי שיטת שתי פרוסות, הדורשת רק מדידת YZ אחת, נתנה הערכה מדויקת למדי של נפח המיוטום. המיוטום גדל באופן ניכר באורכו ובאזור החתך בין יומיים לחמישה ימים לאחר ההפריה, מה שהוביל לעלייה מתמדת בנפח.
שריר שנעשה לא פעיל על ידי טריקיין הרדמה בין היום השלישי לרביעי לאחר ההפריה הפחית משמעותית את נפחו, מה שמצביע על כך שצמיחת שריר הזחל הייתה תלוית פעילות. שונות גדולה יותר בהקטנת גודל המיוטום נצפתה בעת מדידת נפח המיוטום בארבעה ימים לאחר ההפריה, בהשוואה למדידת כל דג בודד בשלושה וארבעה ימים לאחר ההפריה. עם זאת, לא נצפה הבדל משמעותי בנפח המיוטום בין שתי השיטות למדידת מיוטום.
מדידת מספר הסיבים בתוך המיוטום, כמו גם נפח הסיבים הממוצע, גילתה כי הפעילות שולטת בשני ההיבטים התאיים של הגדילה. ודא כי הזחלים מורדמים לחלוטין באמצעות tricaine מוכן טרי. הרדמה חלקית תוביל לתוצאה משתנה.
כידוע, הזחלים מגיבים בצורה נמרצת יותר לגירוי חשמלי. שיטה זו, בשילוב עם תעתיק במורד הזרם וניסויים פרמקולוגיים, חשפה תובנות חדשות על האופן שבו חישת כוח מניעה צמיחה בשרירי השלד.
