Name: isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

אנו מודים לפרופ &#39;אמריטוס ז&#39;אן קלוד Perriard ואוולין Perriard (מכון שוויצרי פדרלי לטכנולוגיה, שוויץ) למבוא לטכניקות בידוד לעכברוש בילוד ושריר לב עכבר. ברצוננו להודות לפרופ &#39;ג&#39;ו חן ופרופ&#39; סילביה אוונס (UCSD, ארה&quot;ב) על תמיכתם. עבודה במעבדה של EE מומנה על ידי MRC קריירה הקמת גרנט. SL נתמך על ידי מסלול K99/R00 להעניק עצמאות מ-NIH / NHLBI (HL107744). TMM נתמכה על ידי מלגה הבתר מאיגוד הלב האמריקאי (11POST7310066).

ההליך הבא מתאר 16,17 פרוטוקול בן יומיים לבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. כל הפתרונות עקרים או עקרים מסונן. כל הכלים הם מעוקרים על ידי עיקור משטח עם 75% אתנול. פרט למיצוי הרקמה הראשוני, כל הצעדים שבוצעו במכסת מנוע בתרבית תא זרימה למינרית סטרילי. פרוטוקול זה מיועד לבידוד של לב עכבר בילוד מהמלטה אחת ושתיים (ים) - כ 5-14 גורים, אך הוא עשוי להיות מותאם לגדלי המלטה גדולים ושריר לב בילוד חולדה. שימוש במדיה בקנה מידה / אנזים כמתאים. לעבודה עם מכרסמים בילוד, עיינו בהנחיות המקומיות שלך באוניברסיטה וכללים שנקבעו על ידי המחוקק ו / או תוכניות טיפול בבעלי חיים, ולדבוק בפרוטוקול שאושר על בעלי החיים המוסדי שלך. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC), ולדבוק fedeתקנות RAL ומדינה. יום 1. 1. בידוד של רקמת לב מעכברי ילודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) בתוספת 20 מ&quot;מ BDM 6-8, ולפזר לשתי מנות חיידקי סטרילי מונחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של מדיום בידוד ב50 מיליליטר צינור פלקון חרוטי סטרילי. שמור את כל הפתרונות על קרח. לעקר מספריים (אחד מעוגל; ישרה אחד), ומלקחיים (מעוגלים, דומון מס &#39;7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים בילוד בן 1-3 ימים הם שטופים במהירות ב75% אתנול פתרון לעיקור פני השטח. גורים הם ערופים באמצעות מספריים סטרילי (ישר), והחזה נפתח לאורך עצם החזה כדי לאפשר גישה לבית החזה והלב (איור 1 א, משלימה הסרט S1). תגובה טכנית: ניתן להשתמש בעכברים יילודים יותר מ 3 ימים, אבל לגרום לתאי קיימא פחות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבבות המחולציםהגוף עם מספריים מעוגלים והועבר מייד לצלחת המכילה חיידקי 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ&quot;מ BDM, על קרח. כל הצעדים הבאים מבוצעים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת ריאה, כלי גדול יותר (ואטרייה, אם רוצה). לבבות לשטוף בפתרון 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ&quot;מ BDM (על קרח) כדי להסיר דם. העברה שטפה את לב מהמנה ראשונה למנה השנייה בקטריאלי המכילה 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ&quot;מ BDM (על קרח) באמצעות מלקחיים או כף מחוררת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה ניקתה / שטף את לב לירידה של מדיום בידוד (כ 250 μl; איור 1 ג) בצלחת שלישית בקטריאלי (על קרח) ולהשתמש במספריים מעוגלים לברר בלבם לחתיכות (כ 0.5-1 מ&quot;מ 3, או קטנים יותר קטנות; איור 1D, 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הלבבות טחונים לתוך חרוטיצינור המכיל 10 מיליליטר של מדיום הבידוד (על קרח), ודגירה עם תסיסה עדינה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה. </li></ol> יום 2. 2. רקמות אנזימתי עיכול וציפוי של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ב15 מ&quot;ג של תערובת collagenase / dispase (Roche), ולפזר את תערובת האנזים ב10 מיליליטר 5 L15-המדיום השלימו עם 20 מ&quot;מ BDM (בינוני עיכול). סינון סטרילי בינוני העיכול במכסת מנוע תרבית תאים לתוך צינור סטרילי חדש 50 מיליליטר פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום 30 מיליליטר L-15 תוספת 20 מ&quot;מ BDM, ובינוני ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מעיל תרבית תאים עם פתרון קולגן (Sigma C-8919) למינימום של 1 שעה. הסר פתרון קולגן (ניתן לעשות שימוש חוזר) ומנות תרבית תאי קולגן מצופים יבשות במכסת מנוע תרבית תאי זרימה למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור חרוטי המכיל לבבות המעוכלים מראש מ4 ° C. יש מצטברים שברי רקמה (איור 1G). בואו שברי הרקמה לשקועהחלק התחתון של הצינור ולהסיר את supernatant (לוודא שלא יאבדו את כל שברי רקמה;. בדרך כלל, כ 1 מיליליטר של מדיום הבידוד עשוי להישאר בצינור). הוסף 5 מיליליטר של מדיום עיכול ו5 מיליליטר של L-15 תוספת 20 מ&quot;מ BDM לברי רקמה והשעית חמצן באמצעות חמצן או אוויר דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צינור חרוטי החתום המכיל שברי רקמת לב במדיום עיכול ל37 ° C אמבט מים למשך כ -2 דקות כדי להתאים את הטמפרטורה של פתרון העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שברי רקמת לב על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה של 20-30 דקות (לדוגמא שייקר על 37 מעלות צלזיוס, מוגדר לא יותר מ60rpm). זמני עיכול עשויים להיות תלויים במידה רבה על תערובת אנזים ומספר הרבה זהירות:. תקופות דגירה ארוכות יותר או ריכוזי אנזים גבוהים יותר עשויות להפחית את כדאיות תא. </li></ol> תגובה טכנית: אנו ממליצים שימוש בתערובת collagenase / dispase מרוש (Cat.No.: 102,69638001) שיש לו מעט מאוד שונות הרבה להרבה. האנזים הקלאסי לבידוד של שריר לב עכבר הוא טריפסין ו / או סוג collagenase השני 3,16-20 זמין וורטינגטון (חתול לא CLS-2). עם זאת, ביצועים של collagenase השני עשויים להיות שונים באופן מהותי מהרבה להרבה. וורטינגטון מאפשר בדרך כלל לבדיקה של כמה הרבה collagenase כדי לייעל את זמני עיכול ואנזים שימוש. לחלופין, וורטינגטון מוכר ערכת בידוד cardiomyocyte בתערובת אנזים נבדקה מראש כלל שיכול להיות מותאם לבידוד של cardiomyocytes עכבר (מס &#39;חתול: NCIS) 17. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תא מסננת סטרילי (40-100 רשת ניילון מיקרומטר) ב50 מיליליטר סטרילי הטרי צינור בז חרוטי. מסננת תא טרום רטובה עם 5 L-15 מיליליטר בתוספת 20 מ&quot;מ BDM. שברי רקמת העדינות triturate באמצעות פיפטה תרבית תאי 10 מיליליטר רטוב מראש במשך כ 10-20 פעמים. שברי הרקמה צריכים בעיקר לפזר במהלך שלב זה, משחררים את התאים לתוך suspension (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שברי רקמה גדולים יותר משקעים וsupernatant העברה המכיל תאים מושעים לתוך צינור חרוטי טרי דרך תא מסננת (איור 1I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את שברי רקמות מעוכלים ב5 בינוני עיכול מיליליטר ו דגירה של 5-10 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול מתמשך של שברי רקמה שנותרו, בעדינות triturate רקמות ל10-20 פעמים ולהוסיף לתאי צינור המכיל חרוטי מלעכל הראשון דרך מסננת תא. יש לשטוף את תא מסננת עם 5 L-15 מיליליטר בתוספת 20 מ&quot;מ BDM כדי לאפשר מעבר של כל התאים מתעכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור חרוטי Centrifugate המכיל שריר לב על תנאים למשך 5 דקות ב300 סל&quot;ד (כ XG 50-100). הסר את supernatant (המכיל בעיקר fibroblasts ותאי האנדותל) ותא גלולה מחדש להשעות ב10 מיליליטר ציפוי בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ל10 צלחת תא סנטימטר התרבות (איור 2 א) ו דגירה של 1שעה -3 בחממת תרבות תא. צעד לפני ציפוי זה מסיר fibroblasts ותאי אנדותל (איור 2), שידבק לצלחת ללא ציפוי תרבית תאים (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף את שריר לב שאינו חסיד מ10 צלחת תרבות סנטימטר (תאים מחדש להשעות ידי pipetting בינוני ציפוי מעל הצלחת שוב ושוב), ותאי resuspended להעביר צינור סטרילי חרוטי צנטריפוגות פלקון (15 מיליליטר או 50 מיליליטר). אופציונאלי: חזור על השלב טרום ציפוי להסיר fibroblasts נוסף מתא השעיה. אם תרצה, תאי פיברובלסטים ואנדותל חסיד יכולים להיות מתורבתים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים (למשל על ידי השימוש בhemocytometer נויבאואר, trypan הדרה כחולה מכתימה 21). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים לתוך צלחות תרבית תאי קולגן מצופה בצפיפות של כ 1.5 x 10 5 תאים לכל 2 סנטימטר (איור 2 ד, וראה גם הערות בטבלה 1 בציפויוציפוי). הנח כלים בתרבית תאי חממה ולהשאיר באין מפריע במשך 12-18 שעה כדי לאפשר לדבקות והפצה של שריר לב. </li></ol> יום 3 - תרבות של שריר לב בילוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תחזוקה וprewarm ב37 אמבט מים C °. עיין בטבלת 1 לתוספת של מעכבי התפשטות או סוכני chronotropic, או הליך transfection liposomal של cardiomyocytes עכבר בילוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר ציפוי, שריר לב צריך דבק בצלחת תרבית תאים בצורה אופטימלית ולהתחיל באופן ספונטני לחוזה (איור 2E, 2F; משלימה הסרט S2; עיין בטבלה 2 לבעיות נפוצות במהלך הליך בידוד / התרבות). החלפת ציפוי בינוני עם בינוני תחזוקה, ותרבות ל1-5 ימים נוספים. שנה בינונית במידת צורך. </li></ol>

אף אחד.

השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחלות לב הפך סטנדרטיים במחקר לב וכלי דם. אפיון ביוכימי קרוב יותר של מודלים אלה (כלומר, לומדים את תגובות ישירות של תאי לב לגירויים ביוכימי או ביומכנית) בדרך כלל דורש הבידוד של רקמות לב או שריר לב. מחקרים חוקרים תגובות פיסיולוגי...

הדיווחים המוקדמים ביותר לניתוק והתרבות המוצלחים של תאי לב מכרסמים שתחילתה ב1960 של 1,2. גם אז, הררי ופארלי שמו לב ששריר לב בתרבית &quot;עשוי לספק מערכת ייחודית ללימוד הדרישות של ההתכווצות התקופתית [ואולי] לספק אמצעי קביעת התרומה של מסלולי מטבוליים שונים ל[ מכות] התהליך&quot;. למרות ששריר לב מבודד ומתורבת הררי ופארלי מחולדות צעירות, והפרוטוקול המקורי הותאם והותאם על ידי מדענים רבים במשך השנים, הליך הבידוד וculturing הכללי לא השתנה באופן משמעותי. עם זאת, אנזימים טובים יותר 3, פתרונות סטנדרטיים 4,5, והתוספת של הערוץ הפיך וBDM מעכבי ATPase שרירן כדי להגן על תאים במהלך הליך בידוד 6-9 השתפרו באופן משמעותי תא תשואה וכדאיות. מבוגרים לעומת cardiomyo בילודcytes יש לי cardiomyocytes המבודד ומתורבת מעכברים או חולדות בילוד מספר יתרונות על פני תרבויות של שריר לב מבוגר. בראש ובראשונה, הליך הבידוד ללבם עכבר או עכברוש בילוד הוא קל יותר ויקר פחות, בהשוואה לבידוד של שריר לב מעכבר בוגר או חולדה 10. cardiomyocytes ילודים הם הרבה פחות רגיש להשבה לטבע לבינוני מכיל סידן לאחר ניתוק, מאוד להגדיל תא תשואה. יתרון גדול נוסף הוא ששריר לב עכבר בילוד עובר טשטוש הבדלים מהיר יותר - מחזור redifferentiation שבדרך כלל תוצאות באופן ספונטני להכות תאים 20 שעות לאחר ציפוי, בעוד שבדרך כלל שריר לב מבוגר דורש לצעוד כדי לגרום להתכווצות. cardiomyocytes ילודים הם גם יותר בקלות transfectable עם שיטות transfection liposomal, ואילו שריר לב מבוגר דורש וקטורים ויראליים למסירה מוצלחת של ה-DNA המהונדס. בניגוד לcardiomyocyte בילודים, התרבות של cardiomyocytes מכרסמים המבוגר 11-13 מאפשרת לחקירות של השפלה myofibrillar והקמתה מחדש סופו של דבר את מנגנון ההתכווצות. שינויים מורפולוגיים האופייניים אלה בשריר לב בוגרים מתרחשים על פני תקופות של 1-2 שבועות. טשטוש ההבדלים - מחזור redifferentiation מלווה reexpression של התכנית הגנטית של העובר, ובכך מחקה שינויים פתולוגיים שנצפו בcardiomyopathies אדם 14. יתרון נוסף של שריר לב חולדה בוגר מעל התרבות של שריר לב בילוד הוא יכולת תרבות תאים אלה לפרקי זמן ארוכים. עכברוש לעומת cardiomyocytes עכבר יש הבידוד והתרבות של שריר לב בילוד חולדה כמה יתרונות על פני זו של שריר לב בילוד עכבר, כוללים תשואות גבוהות יותר של תאי קיימא ושיעורי transfection מוגברים. עם זאת, השימוש הרחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטי למחלות לב (כגון: &lt;/ Em&gt; העכבר בנוקאאוט חלבון Lim השרירים כמודל לcardiomyopathy מורחב 15) הוביל לעיבוד של הליך הבידוד לשריר לב שנלקח מעכברים בילוד. למרות שהפרוטוקולים המשמשים לבודד את שריר לב חולדה ועכבר בילוד הם כמעט זהים, טיפול גדול יותר יש לקחת בבחירת תמהיל אנזים מתאים לאפשרות השנייה. אכן, שריר לב עכבר בילוד הוא בדרך כלל רגיש יותר לoverdigestion, וכתוצאה מכך תא תשואה וכדאיות מופחתים. יתר על כן, צפיפות ציפוי צריכה להיות מותאמת, כי שריר לב שנלקח מעכברי יילודים הם מעט קטן יותר בהשוואה לתאי שמקורם בלב חולדה בילוד. עם שימושים רבים לחקירה של פרמטרים מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי ויומכנית, כמו גם לתהליך של myofibrillogenesis, שריר לב בילוד בתרבית הפכו לאחד המערכות המגוונות ביותר ללימודפונקציות תא לב במבחנה. הצעד הראשון לassay מוצלח לעומת זאת, תלוי במתודולוגיה קלה ואמינה לבודד את שריר לב עכבר בילוד. הפרוטוקול שלנו שואב את המתודולוגיה שלה ממקורות רבים והיה מותאם לשחזור וחוסן. אנו דנים בגורמים המשפיעים על cardiomyocyte תשואה וכדאיות, ולספק מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.

<table><tbody><tr><td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) &lt;sup&gt;6-8&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;), filter sterilize, can be kept at 4 &amp;#176;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture&lt;sup&gt;46,47&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td></tr><tr><td>Collagenase type II&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td>Worthington</td><td>CLS-2</td><td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td></tr><tr><td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td><td>cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td><td>cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>e,g, cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank&amp;#8217;s balanced salt solution; without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;) &lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt;</td><td>cellgro</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>cell-culture grade</td></tr><tr><td>horse serum</td><td>cellgro</td><td>35-030-CV</td><td>cell-culture grade</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;</td><td>cellgro</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>C-6645</td><td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>phenylephrine</td><td>Sigma</td><td>P-6126</td><td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C or -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>isoproterenol hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>I-6501</td><td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C or -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>0.1% collagen solution</td><td>Sigma</td><td>C-8919</td><td>extracellular matrix for coating</td></tr><tr><td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>alternative to Sigma collagen solution</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>appropriate filter size:40 &amp;#956;m-100 &amp;#956;m</td></tr><tr><td>syringe filter 0.2 &amp;#956;m</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>for sterile filtration of digestion medium</td></tr><tr><td>straight scissors</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>curved scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 7 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>perforated spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td>optional, for transfer of heart tissue</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>live cell staining</td></tr><tr><td>Neubauer hemocytometer</td><td>Prosource Scientific</td><td>3500</td><td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>20 ml syringe</td><td>BD Medical</td><td>14-820-19</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>30 mm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>for standard culture of cardiomyocytes</td></tr><tr><td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>for live cell imaging with inverted microscope</td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>172958</td><td>for preplating</td></tr><tr><td>Escort III</td><td>Sigma</td><td>L3037</td><td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>52887</td><td>substitute for Escort III</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Buffers and media: &lt;/strong&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Isolation medium (filter sterilize)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 20 mM BDM&lt;br/&gt; 0.0125% trypsin&lt;br/&gt; in HBSS&lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt; (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Digestion medium (filter sterilize)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 20 mM BDM&lt;br/&gt; 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix&lt;br/&gt; in L15 medium&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Plating medium&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 65% DMEM high glucose&lt;br/&gt; 19% M-199&lt;br/&gt; 10% horse serum&lt;br/&gt; 5% fetal calf serum&lt;br/&gt; 1% penicillin/streptomycin&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Maintenance medium&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 78% DMEM high glucose&lt;br/&gt; 17% M-199&lt;br/&gt; 4% horse serum&lt;br/&gt; 1% penicillin/streptomycin&lt;br/&gt; &lt;em&gt;optional:&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 1 &amp;#956;M AraC&lt;br/&gt; 1 &amp;#956;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; The plating and maintenance medium can be stored at 4 &amp;#176;C for up to 6 months.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

שריר לב בילוד תרבותי כבר מזמן משמש ללמוד myofibrillogenesis ופונקציות myofibrillar. שריר לב בתרבית מאפשר חקירה קלה ומניפולציה של מסלולים ביוכימיים, וההשפעה שלהם על המאפיינים ביומכניים של ספונטני להכות שריר לב. פרוטוקול 2 הימים הבאים מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. אנו מראים כיצד לנתח בקלות את לב מילודים, לנתק את רקמת הלב ולהעשיר את שריר לב מתאי אוכלוסיית לב. אנחנו דנים בשימוש בתערובות אנזים שונות לתא דיסוציאציה, וההשפעות שלהם על תא את יכולת הקיום. שריר הלב המבודד יכול לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי או ביומכנית. אנו מותאמים הפרוטוקול לחוסן ושחזור, על ידי שימוש בפתרונות רק זמינים מסחרית ואנזים מתערבב שshהשתנות קטנות ow הרבה להרבה. אנחנו גם להתמודד עם בעיות נפוצות הקשורות לבידוד והתרבות של שריר לב, ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.

באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבודדים לבבות מ8 עכברי יום אחד ישן בילוד (איורים 1 א, 1 ב &#39;, משלים הסרט S1). לאחר הכביסה וקוצץ את הלבבות עם מספריים (איורים 1C-1F), שברי רקמה היו מעוכלים מראש במדיום בידוד במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. בעקבות predigestion <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

62.5K Views.  King’s College London.  תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ...

Video: Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

בידוד וCryopreservation של שריר לב עכברוש ילודים

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Developmental Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Neuroscience

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Medicine

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...