קציר איברי קצה שיווי משקל בתנאים פיזיולוגיים במהלך כריתת מבוך

כאן, אנו מתארים טכניקה לקצירת איברי קצה שיווי משקל אנושיים בתנאים פיזיולוגיים במהלך כריתת מבוך וניתוחם באמצעות צביעה חיסונית.

האוזן הפנימית האנושית החיה מאתגרת למחקר מכיוון שהיא עטופה בעצם קפסולה אוטית צפופה המגבילה את הגישה לרקמה ביולוגית. שיטות מסורתיות של היסטופתולוגיה של עצם טמפורלית מסתמכות על פרוטוקולי הסרת אבדן ארוכים ויקרים הנמשכים 9-10 חודשים ומפחיתים את סוגי ניתוח הרקמות האפשריים עקב פירוק RNA. יש צורך קריטי לפתח שיטות לגישה לרקמת אוזן פנימית אנושית טרייה כדי להבין טוב יותר מחלות אוטולוגיות, כגון מחלת מנייר, ברמה התאית והמולקולרית. מאמר זה מתאר טכניקה לקצירת איברי קצה שיווי משקל אנושיים מתורם חי בתנאים פיזיולוגיים. אדם עם מחלת מנייר ו'התקפי טיפות' שהיו עמידים להזרקת גנטמיצין תוך טימפנית עבר כריתת מבוך. לראשונה בוצעה כריתת מסטואידקטומיה מסורתית, וזוהו התעלות האופקיות והחצי עגולות העליונות (SCC). חלל המסטואיד מולא בתמיסת מלח מאוזנת כך שניתן היה לפתוח את המבוך בתנאים פיזיולוגיים יותר כדי לשמור על שלמות התא. אנדוסקופ אפס מעלות המתאים למערכת השקיה של נדן לניקוי עדשות שימש להדמיית חלל המסטואיד השקוע, ובור יהלום של 2 מ"מ שימש לשלד ופתיחת ה-SCCs האופקיים והעליונים, ואחריו הפרוזדור. האמפולות וחלק מצינורות התעלה עבור ה-SCC העליונים והרוחביים נקצרו. הרחם נקצר באופן דומה. הרקמה שנקטפה הונחה מיד במאגר קר כקרח ולאחר מכן נקבעה למשך שעה ב-4% פרפורמלדהיד בתמיסת מלח עם פוספט (PBS). הרקמה נשטפה מספר פעמים ב-1x PBS ואוחסנה במשך 48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. דגימות הרקמה עברו צביעה חיסונית עם שילוב של נוגדנים ראשוניים נגד tenascin-C (גביע), אונקומודולין (תאי שיער סטראולריים), קלרטינין (תאי שיער מסוג Calyx וסוג II), חלבון שלפוחית סינפטי 2 (סיבים ובוטונים זורמים), β-טובולין 1 (גביע ובוטונים אפרנטיים), ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. לאחר מכן נשטפו דגימות הרקמה והורכבו לבדיקת מיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונות חשפו נוכחות של תאי שיער אמפולרי ומקולרי ומבנים עצביים. פרוטוקול זה מדגים כי ניתן לקצור רקמת אוזן פנימית אנושית שלמה ואיכותית מתורמים חיים ועשוי לספק כלי חשוב לחקר מחלות אוטולוגיות.

האוזן הפנימית האנושית החיה מאתגרת למחקר בשל מיקומה בתוך עצם הקפסולה האוטית הצפופה של העצם הטמפורלית. כתוצאה מכך, הגישה לרקמה הפנימית האנושית הוגבלה, והחוקרים הסתמכו בעיקר על קצירת רקמות לאחר המוות. היסטופתולוגיה של עצם טמפורלית לאחר המוות (TBH) הייתה כלי קריטי להבנת מחלות אוטולוגיות אנושיות במשך למעלה מ-100 שנים ^1,2,3. רקמה ל-TBH מוכנה על ידי קציר לאחר המוות של העצם הטמפורלית, תהליך ארוך (9-10 חודשים) של הסרת אבדן והכנת רקמות, ואחריו צביעת המטוקסילין ואאוזין. בעוד ש-TBH יישאר כלי חיוני לחשיפת מידע חדש על האוזן הפנימית האנושית הבריאה והחולה, זמנים ארוכים לאחר המוות ושיטות עיבוד רקמות ארוכות וקשות מגבילים את התועלת שלו למטרות מסוימות, ומחייבים שיטות נלוות לחקר רקמת האוזן הפנימית האנושית. הדמיית תהודה מגנטית ברזולוציה גבוהה יכולה לדמיין איברי אוזן פנימית אך חסרה רזולוציה מספקת כדי לראות מבנים ברמה התאית או המולקולרית ^4,5. בשל אתגרים אלה, מחלות רבות באוזן הפנימית האנושית אינן מובנות היטב.

גישה חלופית היא קצירת רקמת האוזן הפנימית במהלך הניתוח. במהלך כריתת מבוך או כריתת שוואנומה שיווי משקל טרנסלברינתין, רקמות האוזן הפנימית מוקרבות בכוונה. רחם שנקטפו ממטופלים במהלך כריתת שוואנומה שיווי משקל טרנסלברינתין שימשו לאפיון מורפולוגיה של תאי שיער שיווי משקל ^6,7,8 ולחקר התחדשות תאי שיער ^9,10. לאחרונה, פותחו טכניקות לקצירת איברי האוזן הפנימית מתורמי איברים באמצעות גישה טרנס-קנאלית שניתן להשתמש בה כדי להסיר את הרחם ואיברי קצה שיווי משקל אחרים דרך חלון סגלגל מורחב עם טראומה מינימלית של רקמות^11,12. באמצעות טכניקה זו, ניתן היה לאפיין פרופילים טרנסקריפטומיים של תא בודד עבור הרחם האנושי¹³. עם זאת, טכניקות אלו חושפות את איברי האוזן הפנימית לתנאים לא פיזיולוגיים במהלך הקציר. באופן ספציפי, איברי האוזן הפנימית עלולים להיחשף להיעדר נוזל פרילימפטי וטבילה בהשקיה רגילה של קידוחי מלח, שיש להם הרכב יונים שונה מהותית מנוזל פרילימפטי. יתר על כן, קשה לדמיין את המבוך הקרומי המיובש, אפילו בהגדלה מקסימלית של המיקרוסקופ המנתח, מה שהופך את הדיסקציה הכירורגית הא-טראומטית למאתגרת. טראומה מכנית עלולה לפגוע עוד יותר ברקמות, והניסיון האנקדוטלי שלנו מצביע על כך שרקמת הניתוח לרוב אינה באיכות מספקת של צביעה חיסונית עקב נזק מכני וניוון תאי. יש צורך בטכניקות חדשות לקצירת רקמת אוזן פנימית אנושית באופן א-טראומטי למחקרים ביולוגיים שעשויים להבהיר מחלות אוזן פנימית אנושיות שאינן מובנות היטב. כאן אנו מתארים טכניקה תת-מימית לקצירת איברי קצה שיווי משקל אנושיים בתנאים פיזיולוגיים יותר במהלך כריתת מבוך וניתוחם באמצעות צביעה חיסונית.

פרוטוקול זה פותח באישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (IRB00203441) ובהתאם למדיניות המוסדית לשימוש ברקמות אנושיות ובחומר שעלול להיות מדבק. איסוף הרקמות בוצע במהלך כריתת מבוך, שהיא חלק מהטיפול הקליני הסטנדרטי במחלת מנייר עקשנית עם התקפי נפילה.

1. כריתת מבוך וקצירת רקמות

1. קבל את אישור מועצת הביקורת המוסדית המקומית (IRB), סקור את המדיניות המוסדית לשימוש בחומר אנושי וזיהומי, וקבל הסכמה לתרומת רקמות לפני השימוש בפרוטוקול זה. בצע קצירת רקמות במהלך כריתת מבוך כירורגית או גישה טרנסלברינתין לתעלת השמע הפנימית, המהווה חלק מהטיפול הקליני הסטנדרטי.
2. הכן את המטופל.
   1. לפני השראת ההרדמה, שוחח עם צוות ההרדמה על הימנעות משיתוק ארוך טווח כדי שניתן יהיה לעקוב אחר עצב הפנים.
   2. לאחר השראת הרדמה כללית, יש להחדיר את המטופל ולסובב את שולחן הניתוחים ב-180°. הנח אלקטרודות לניטור עצב הפנים וודא מתן טיפול מונע אנטיביוטי לפני הניתוח.
   3. יש להזריק 1% לידוקאין עם 1:100,000 אפינפרין לתעלת השמע החיצונית ולאזור הפוסט-אאוריקולרי. הכן את האוזן בצורה הסטנדרטית באמצעות בטדין.
3. השתמש בלהב #15 כדי ליצור חתך פוסט-אאורילינארי סטנדרטי (5-6 ס"מ) 1 ס"מ אחורי לקפל הפוסט-אאוריקולרי.
4. הרם את הרקמה הרכה הפוסט-אאוריקולרית.
   1. זהה את הפאשיה הזמנית בצורה עליונה והרם את דש העור הפוסט-אאוריקולרי מלפנים לכיוון תעלת האוזן.
   2. צור חתך פריוסטאלי סטנדרטי בצורת 7 והרם את הפריאוסטאום מלפנים עד לזיהוי עמוד השדרה של הנלה ותעלת האוזן הגרמית. הצב מחזירי אימון עצמי.
5. בצע כריתת מסטואידקטומיה.
   1. בצע כריתת מסטואיד מלאה, זיהוי הטגמן בצורה מעולה, סינוס סיגמואיד מאחור ודילול תעלת השמע החיצונית מלפנים.
   2. זהה את התעלה החצי עגולה האופקית ואת התהליך הקצר של האינקוס.
      הערה: אין לצלוחית את המסטואיד כדי להבטיח שהוא יישאר כלי המסוגל להחזיק נוזל לאיסוף רקמות מתחת למים.
6. זהה את התעלות החצי עגולות (SC).
   1. תחת המיקרוסקופ התפעולי (הגדלה פי 2-4), השתמש בקוץ יהלום גס של 3 מ"מ כדי להסיר את תאי האוויר הפרילבירינתים לרוחב ה-SC העליון, תאי האוויר התת-קשתים ותאי האוויר הרטרו-מבוכים מאחורי ה-SC האחורי, המשתרעים בצורה עליונה אל ה-SC המשותף.
7. טבלו את המבוך.
   1. טבלו את חלל המסטואיד בתמיסת מלח מאוזנת (BSS) ודמיינו את המבוך באמצעות אנדוסקופ אפס מעלות עם מערכת השקיה לניקוי עדשות.
   2. השתמש במערכת ההשקיה של מעטפת ניקוי העדשות כדי להשקות את חלל המסטואיד עם BSS, לשטוף דם ולאפשר הדמיה משופרת של המבוך.
8. קו כחול' SCs.
   1. תוך שמירה על רמה נאותה של BSS בחלל המסטואיד ושימוש באנדוסקופ להדמיה, השתמש בקוץ יהלום של 3 מ"מ כדי 'קו כחול' את כל שלוש התעלות החצי עגולות על ידי קידוח זהיר של עצם הקפסולה האוטית עד שהתעלה החצי עגולה מופיעה כקו כחלחל במבט עם האנדוסקופ.
   2. השקיה לסירוגין עם תמיסת BSS באמצעות מערכת ההשקיה כדי לשטוף דם ולהשיג הדמיה נאותה, כפי שמוצג באיור 1.
9. קציר אמפולות SC.
   1. תחת BSS, היכנס לכיפת התעלה החצי עגולה לרוחב ועקוב אחריה מלפנים עד לזיהוי האמפולות שלה. היכנס ל-SC העליון ועקוב אחר זה מדיאלית לכיוון האמפולות שלו, אותן ניתן לקצור עם האמפולות של ה-SC העליון.
   2. הרם את אמפולות ה-SC האופקיות והעליונות מהקריסטה באמצעות מחט רוזן והפרידו את הסיבים הנכנסים מהאפיתל והמבוך הקרומי. לאחר מכן, הסר את המבנים הללו.
   3. חצו את כיפת ה-SC האחורי ועקבו אחריה בצורה נחותה וקדמית לאמפולות שלה. באופן דומה, קצרו את האמפולות האחוריות של SC והניחו את כל הרקמה ב-BSS על קרח.
10. קציר מקולה.
    1. הסר את העצם בין אמפולות SC האופקיות והאחוריות כדי לחשוף את הפרוזדור. דפנות הקרום של הרחם ייקרעו עם הסרת האמפולות. כל עוד נשמרת רמת נוזלים, המקולה תישאר מחוברת מלפנים; הרם והסר אותו.
    2. השק יושב בתוך השקע הכדורי; הרם בחדות והסר אותו מהשקע. באופן דומה, הנח את דגימות הרקמה ב-BSS על קרח.
11. הובלת דגימות רקמה על קרח מחדר הניתוח למעבדה לקיבוע תוך שעה מרגע הקציר.

2. אימונוהיסטוכימיה והדמיה

1. תקן את הדוגמה.
   1. הנח את דגימת הרקמה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח 1x עם חוצץ פוספט (1x PBS) בטמפרטורת החדר (RT) עם נדנוד עדין או טלטול מסלולי (100 סל"ד) למשך שעה.
      הערה: תמיסת PFA של 4% (עבור 5 מ"ל בסך הכל): 625 מ"ל של תמיסת מלאי PFA של 32% + 500 מ"ל של 10xPBS + 3875 מ"ל של ddH₂O.
2. העבירו דגימות רקמה לתמיסת PBS 1x ושטפו 3x 15 דקות (או יותר במידת הצורך) ב-RT עם נדנוד עדין או טלטול מסלולי.
3. הסר רקמת חיבור עודפת מתחת למיקרוסקופ הניתוח ב-1x PBS ב-RT.
4. הסר אבנית מהדגימה.
   1. העבירו דגימות רקמה לחומצה אתילנדיאמינטטראצטית 5% (EDTA) בתמיסת PBS 1x כדי לנקות את האפיתל החושי מפסולת עצם עדינה ואוטוקוניה. הפעל דגירה למשך 15-30 דקות ב-RT, עם נדנוד עדין או טלטול מסלולי.
5. שוב, העבירו דגימות רקמה לתמיסת PBS 1x ושטפו 3x 15 דקות (או יותר במידת הצורך) ב-RT עם נדנוד עדין או ניעור מסלולי.
6. החל 125-200 מ"ל של מאגר חוסם 2x (2x BB) על כל דגימה ודגר למשך 1.5-5 שעות ב-RT או לילה (ON) ב-4 מעלות צלזיוס. הפעל את הדגירה תחת טלטול מסלולי מתמיד.
   הערה: 2x מאגר חוסם (2x BB): 1 גרם של אלבומין בסרום בקר (BSA) מומס בעד 5 מ"ל של 1x PBS בתוספת 0.5% Triton X-100. ה-BSA משמש כחומר חוסם לאתרי קשירת אנטיגן לא ספציפיים.
7. צביעה באמצעות נוגדנים ראשוניים.
   1. יש למרוח 120-150 מ"ל של שילוב של נוגדנים ראשוניים מומסים ב-1x BB לדילול הרצוי. יש למרוח נוגדנים נגד טנאסקין-C של ארנב בדילול של 1:200 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל), נוגדנים נגד אונקומודולין של עזים בדילול של 1:200 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל), אנטי-קלרטינין של עכבר בדילול של 1:300 (2.2 מיקרוגרם/מ"ל), ו-DAPI בדילול של 1:1000 (1 מיקרוגרם/מ"ל). לאחר מכן, העבירו את הדגימה (מכוסה) ל-4 מעלות צלזיוס (מקרר או חדר קירור) תחת ניעור מסלולי עדין לדגירה ON.
      הערה: 1x BB: מערבבים נפח שווה של 2x BB ו-1x PBS בתוספת 0.5% Triton X-100.
8. שטפו דגימות רקמה בתמיסת PBS 1x, 3x 15 דקות (או יותר במידת הצורך), ב-RT עם נדנוד עדין.
9. צביעה באמצעות נוגדן משני.
   1. יש למרוח 120-150 מ"ל של שילוב של נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המומסים ב-1x BB בדילול של 1:2000 (1 מיקרוגרם/מ"ל). החל נוגדן משני מצומד נגד ארנב 488 ננומטר, נוגדן משני נגד עכבר 568 ננומטר ונוגדנים משניים נגד עזים 647 ננומטר.
   2. לאחר מכן, דגרו את הדגימה (מכוסה) ב-RT תחת טלטול אורביטלי עדין למשך 1.5-2 שעות (או ON ב-4 מעלות צלזיוס).
10. שטפו דגימות רקמה בתמיסת PBS 1x, 3x 15 דקות (או יותר במידת הצורך), ב-RT עם נדנוד עדין.
11. בצע מיקרו-דיסקציה והרכבה.
    1. תחת המיקרוסקופ המנתח, הסר רקמות וממברנות עודפות סביב האפיתל הווסטיבולרי החושי. השתמש ב-70% אתנול כדי לנקות את פני השטח של מגלשת היסטולוגיה מזכוכית, לייבש באוויר ולמרוח טיפה של 55 מ"ל של מדיום ההרכבה המתאים.
    2. העבר את דגימות הרקמה החושית למדיום ההרכבה. השתמש במלקחיים עדינים כדי לכוון בעדינות את הדגימות כשצד צרור השיער כלפי מעלה במדיום ההרכבה.
    3. הניחו בעדינות כיסוי בגודל המתאים על אמצעי ההרכבה המכיל את הדגימות, בניסיון להגביל את בועות האוויר. ודא שזכוכית הכיסוי היא בדרגת עובי #1.5 הנדרשת למיקרוסקופיה קונפוקלית.
    4. הנח את השקופיות באזור חשוך (למשל, מגירת ספסל) כדי לאפשר למדיום ההרכבה להתייצב. אטמו את זכוכית הכיסוי לשקופית בעזרת לק שקוף ותנו לה להתייבש באזור חשוך לפני בחינתה במיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר מכן, אחסן את השקופיות האטומות בחושך (קופסת ההחלקה של תיקיית השקופיות) ב-4 מעלות עד להדמיה.
12. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של 40x-100x עם ערוצים של 488 ננומטר ו-657 ננומטר כדי לצלם את הדגימה.

באמצעות טכניקה זו, הרחם האנושי ואמפולות התעלה הצדדיות והעליונות נאספו בשלמותם עם טראומה מינימלית (איור 2). כפי שניתן לראות באיור 2, ניתן לקצור את האמפולות עם חלק ניכר מהצינור הקרומי. תיוג אימונו-פלואורסצנטי עם אנטי-טנאסין-C (חלבון מטריצה חו?...

מאמר זה מתאר טכניקה חדשה לקצירה תת-מימית של איברי קצה שיווי משקל ב-BSS באמצעות אנדוסקופים וניתוחם באמצעות הדמיה אימונו-פלואורסצנטית. כאן, אנו מדגימים קציר של איברי קצה שיווי משקל שלמים עם תאי שיער שיווי משקל שלמים ואיכות רקמה מספקת לתיוג חיסוני מוצלח. צפיפות תאי השיער בדג?...

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים למוחמד להאר על עזרתו בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (U24DC020850).