Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

En este trabajo describimos una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

El oído interno humano vivo es difícil de estudiar porque está encerrado dentro de una densa cápsula ósea ótica que limita el acceso al tejido biológico. Los métodos tradicionales de histopatología del hueso temporal se basan en protocolos de descalcificación largos y costosos que duran entre 9 y 10 meses y reducen los tipos de análisis de tejidos posibles debido a la degradación del ARN. Existe una necesidad crítica de desarrollar métodos para acceder a tejido fresco del oído interno humano para comprender mejor las enfermedades otológicas, como la enfermedad de Ménière, a nivel celular y molecular. En este artículo se describe una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos de un donante vivo en condiciones fisiológicas. Un individuo con enfermedad de Ménière y "ataques de gotas" refractarios a la inyección intratimpánica de gentamicina se sometió a laberintectomía. Primero se realizó una mastoidectomía tradicional y se identificaron los canales semicirculares (CCE) horizontal y superior. La cavidad mastoidea se llenó con una solución salina equilibrada para que el laberinto pudiera abrirse en condiciones más fisiológicas para preservar la integridad celular. Se utilizó un endoscopio de cero grados con un sistema de irrigación de la vaina que limpia la lente para visualizar la cavidad mastoidea sumergida, y se utilizó una fresa de diamante de 2 mm para esqueletizar y abrir los CCE horizontales y superiores, seguidos del vestíbulo. Se recolectaron las ampollas y porción de los conductos del canal para los CCE superior y lateral. El utrículo fue cosechado de manera similar. El tejido recolectado se colocó inmediatamente en un tampón helado y luego se fijó durante una hora en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El tejido se enjuagó varias veces en 1x PBS y se almacenó durante 48 h a 4 °C. Las muestras de tejido se sometieron a inmunotinción con una combinación de anticuerpos primarios contra tenascina-C (Calyx), oncomodulina (células ciliadas streolares), calretinina (Calyx y células ciliadas tipo II), proteína 2 de la vesícula sináptica (fibras eferentes y botones), β-tubulina 1 (cáliz y botones aferentes), seguida de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, las muestras de tejido se enjuagaron y se montaron para su examen de microscopía confocal. Las imágenes revelaron la presencia de células ciliadas ampulares y maculares y estructuras neuronales. Este protocolo demuestra que es posible recolectar tejido del oído interno humano intacto y de alta calidad de donantes vivos y puede proporcionar una herramienta importante para el estudio de enfermedades otológicas.

El oído interno humano vivo es difícil de estudiar debido a su ubicación dentro de la densa cápsula ósea ótica del hueso temporal. En consecuencia, el acceso al tejido interno humano ha sido limitado, y los investigadores se han basado principalmente en la recolección de tejido post-mortem. La histopatología del hueso temporal (HQT) post-mortem ha sido una herramienta fundamental para la comprensión de la enfermedad otológica humana durante más de 100 años ^1,2,3. El tejido para la TBH se prepara mediante la recolección post-mortem del hueso temporal, un proceso prolongado (9-10 meses) de descalcificación y preparación del tejido, seguido de tinción con hematoxilina y eosina. Si bien la TBH seguirá siendo una herramienta esencial para revelar nueva información sobre el oído interno humano sano y enfermo, los largos tiempos de autopsia y los métodos de procesamiento de tejidos largos y duros limitan su utilidad para ciertos propósitos, lo que requiere métodos complementarios para estudiar el tejido del oído interno humano. La resonancia magnética de alta resolución puede visualizar los órganos del oído interno, pero carece de la resolución suficiente para ver las estructuras a nivel celular o molecular ^4,5. Debido a estos desafíos, muchas enfermedades del oído interno humano siguen siendo poco conocidas.

Un enfoque alternativo es recolectar tejido del oído interno durante la cirugía. Durante la laberintectomía o la resección del schwannoma vestibular translaberíntico, los tejidos del oído interno se sacrifican intencionalmente. Los utrículos extraídos de pacientes durante la resección del schwannoma vestibular translaberíntico se han utilizado para caracterizar la morfología de las células ciliadas vestibulares ^6,7,8 y estudiar la regeneración de las células ciliadas ^9,10. Más recientemente, se han desarrollado técnicas para extraer órganos del oído interno de donantes de órganos utilizando un enfoque transcanal que se puede utilizar para extirpar el utrículo y potencialmente otros órganos terminales vestibulares a través de una ventana oval ensanchada con un traumatismo tisular mínimo^11,12. Utilizando esta técnica, ha sido posible caracterizar perfiles transcriptómicos unicelulares para el utrículo humano¹³. Sin embargo, estas técnicas exponen los órganos del oído interno a condiciones no fisiológicas durante la cosecha. Específicamente, los órganos del oído interno pueden estar expuestos a la ausencia de líquido perilinfático y a la inmersión en la irrigación normal con solución salina, que tiene una composición iónica sustancialmente diferente a la del líquido perilinfático. Además, el laberinto membranoso deshidratado es difícil de visualizar, incluso con el aumento máximo del microscopio quirúrgico, lo que dificulta la disección quirúrgica atraumática. El traumatismo mecánico puede dañar aún más el tejido, y nuestra experiencia anecdótica sugiere que el tejido quirúrgico a menudo tiene una inmunotinción de calidad insuficiente debido al daño mecánico y la degeneración celular. Existe la necesidad de nuevas técnicas para recolectar extraumáticamente tejido del oído interno humano para estudios biológicos que puedan dilucidar enfermedades del oído interno humano poco conocidas. En este trabajo describimos una técnica subacuática para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones más fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

Este protocolo se desarrolló con la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins (IRB00203441) y según las políticas institucionales para el uso de tejido humano y material potencialmente infeccioso. La recolección de tejido se realizó durante la laberintectomía, que forma parte de la atención clínica estándar para la enfermedad de Ménière recalcitrante con ataques de gota.

1. Laberintectomía y extracción de tejidos

1. Obtener la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB, por sus siglas en inglés) local, revisar las políticas institucionales para el uso de material humano e infeccioso y obtener el consentimiento para la donación de tejidos antes de utilizar este protocolo. Realizar la recolección de tejido durante la laberintectomía quirúrgica o el abordaje translaberíntico del conducto auditivo interno, que forma parte de la atención clínica estándar.
2. Preparar al paciente.
   1. Antes de la inducción de la anestesia, hable con el equipo de anestesia sobre cómo evitar la parálisis de acción prolongada para que se pueda monitorear el nervio facial.
   2. Una vez inducida la anestesia general, intubar al paciente y girar la mesa de operaciones 180°. Colocar electrodos de monitorización del nervio facial y asegurarse de que se administra profilaxis antibiótica preoperatoria.
   3. Inyecte lidocaína al 1% con epinefrina 1:100.000 en el conducto auditivo externo y en el área postauricular. Prepare el oído de la manera estándar usando betadine.
3. Use una cuchilla #15 para crear una incisión curvilínea postauricular estándar (5-6 cm) 1 cm después del pliegue postauricular.
4. Levanta el tejido blando postauricular.
   1. Identifique la fascia temporal superiormente y eleve el colgajo de piel postauricular anteriormente hacia el canal auditivo.
   2. Cree una incisión perióstica estándar en forma de 7 y eleve el periostio anteriormente hasta que se identifiquen la columna vertebral de Henle y el canal auditivo óseo. Coloque retractores de auto-reentrenamiento.
5. Realizar una mastoidectomía.
   1. Realizar una mastoidectomía completa, identificando el tegmen superior, el seno sigmoideo posteriormente y adelgazando el conducto auditivo externo anteriormente.
   2. Identificar el canal semicircular horizontal y la apófisis corta del yunque.
      NOTA: La mastoides no debe estar platicada para asegurar que siga siendo un recipiente capaz de contener líquido para la recolección de tejido bajo el agua.
6. Identificar los canales semicirculares (SC).
   1. Bajo el microscopio quirúrgico (aumento de 2-4x), use una fresa de diamante grueso de 3 mm para eliminar las células de aire perilabirinas laterales al SC superior, las celdas de aire subarqueadas y las celdas de aire retrolaberínticas detrás del SC posterior, que se extienden superiormente hasta el crus común.
7. Sumerge el laberinto.
   1. Sumerja la cavidad mastoidea en una solución salina equilibrada (BSS) y visualice el laberinto utilizando un endoscopio de cero grados con un sistema de irrigación de la vaina que limpia la lente.
   2. Utilice el sistema de irrigación de la vaina de limpieza de lentes para irrigar la cavidad mastoidea con BSS, eliminando la sangre y permitiendo una mejor visualización del laberinto.
8. SC de la línea azul.
   1. Mientras mantiene un nivel adecuado de BSS en la cavidad mastoidea y utiliza el endoscopio para la visualización, utilice una fresa de diamante de 3 mm para "delinear con azul" los tres canales semicirculares perforando cuidadosamente el hueso de la cápsula ótica hasta que el canal semicircular aparezca como una línea azulada cuando se observa con el endoscopio.
   2. Riegue de forma intermitente con una solución de BSS utilizando el sistema de irrigación para lavar la sangre y lograr una visualización adecuada, como se ilustra en la Figura 1.
9. Cosecha de ampollas SC.
   1. Bajo el BSS, ingrese a la cúpula del canal semicircular lateral y siga este anteriormente hasta que se identifiquen sus ampollas. Ingrese al SC superior y siga éste medialmente hacia sus ampollas, que pueden ser recolectadas con las ampollas del SC superior. Corte bruscamente el conducto SC lateral para facilitar la extracción.
   2. Elevar las ampollas SC horizontales y superiores de la crista con una aguja de Rosen y separar las fibras aferentes del epitelio y el laberinto membranoso. A continuación, retire estas estructuras.
   3. Transsectar la cúpula del SC posterior y seguirla inferior y anterior hasta sus ampollas. Del mismo modo, recoja las ampollas SC posteriores y coloque todo el tejido en BSS en hielo.
10. Cosecha la mácula.
    1. Extirpar el hueso entre las ampollas SC horizontales y posteriores para exponer el vestíbulo. Las paredes membranosas del utrículo se habrán desgarrado con la extracción de las ampollas. Mientras se mantenga un nivel de líquido, las máculas permanecerán unidas anteriormente; elévalo y quítalo.
    2. El sáculo se encuentra dentro del hueco esférico; Elévelo bruscamente y retírelo del hueco. Del mismo modo, coloque las muestras de tejido en BSS sobre hielo.
11. Transporte las muestras de tejido en hielo desde el quirófano hasta el laboratorio para su fijación en 1 h después de la recolección.

2. Inmunohistoquímica e imagen

1. Arregle la muestra.
   1. Coloque la muestra de tejido en paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) a temperatura ambiente (RT) con balanceo suave o agitación orbital (100 rpm) durante 1 h.
      NOTA: Solución de PFA al 4% (para 5 mL en total): 625 mL de solución madre de PFA al 32% + 500 mL de 10xPBS + 3875 mL de ddH₂O.
2. Transfiera las muestras de tejido a 1x solución de PBS y enjuague 3x 15 min (o más si es necesario) a RT con balanceo suave o agitación orbital.
3. Elimine el exceso de tejido conectivo bajo el microscopio de disección en 1x PBS en RT.
4. Descalcificar la muestra.
   1. Transfiera muestras de tejido a ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 5% en 1x solución de PBS para eliminar el epitelio sensorial de restos óseos finos y otoconia. Ejecute la incubación durante 15-30 minutos en RT, con balanceo suave o agitación orbital.
5. Nuevamente, transfiera las muestras de tejido a 1x solución de PBS y enjuague 3x 15 min (o más si es necesario) en RT con un balanceo suave o agitación orbital.
6. Aplique 125-200 mL de tampón de bloqueo 2x (2x BB) a cada muestra e incube durante 1,5-5 h a RT o durante la noche (ON) a 4 °C. Ejecute la incubación bajo una agitación orbital constante.
   NOTA: 2x Tampón de bloqueo (2x BB): 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) disuelta en hasta 5 mL de 1x PBS suplementado con Triton X-100 al 0,5%. El BSA sirve como agente bloqueante para sitios de unión de antígenos no específicos.
7. Tinción con anticuerpos primarios.
   1. Aplicar 120-150 mL de una combinación de anticuerpos primarios disueltos en 1x BB hasta la dilución deseada. Aplique anticuerpos anti-tenascina-C de conejo con una dilución de 1:200 (2,5 μg/mL), anticuerpos antioncomodulina de cabra con una dilución de 1:200 (2,5 μg/mL), anti-calretinina de ratón con una dilución de 1:300 (2,2 μg/mL) y DAPI con una dilución de 1:1000 (1 μg/mL). A continuación, transfiera la muestra (tapada) a 4 °C (nevera o cámara frigorífica) bajo un suave agitado orbital para la incubación ON.
      NOTA: 1x BB: Mezcle el volumen igual de 2x BB y 1x PBS complementado con 0.5% Triton X-100.
8. Enjuague las muestras de tejido en 1x solución de PBS, 3x 15 min (o más si es necesario), a RT con un balanceo suave.
9. Tinción con anticuerpo secundario.
   1. Aplicar 120-150 mL de una combinación de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos disueltos en 1x BB con una dilución de 1:2000 (1 μg/mL). Aplique un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado de 488 nm, un anticuerpo secundario anti-ratón de 568 nm y un anticuerpo secundario anti-cabra de 647 nm.
   2. A continuación, incubar la muestra (cubierta) en RT bajo una suave agitación orbital durante 1,5-2 h (o ON a 4 °C).
10. Enjuague las muestras de tejido en 1x solución de PBS, 3x 15 min (o más si es necesario), a RT con un balanceo suave.
11. Realizar la microdisección y el montaje.
    1. Bajo el microscopio de disección, extirpe el exceso de tejido y membranas alrededor del epitelio vestibular sensorial. Use etanol al 70% para limpiar la superficie de un portaobjetos de histología de vidrio, seque al aire y aplique una gota de 55 ml del medio de montaje adecuado.
    2. Transfiera las muestras de tejido sensorial al medio de montaje. Utilice pinzas finas para orientar suavemente las muestras con el mechón de pelo hacia arriba en el medio de montaje.
    3. Coloque suavemente un cubreobjetos del tamaño adecuado sobre el medio de montaje que contiene las muestras, tratando de limitar las burbujas de aire. Asegúrese de que el vidrio de cobertura tenga el grado de espesor # 1.5 requerido para la microscopía confocal.
    4. Coloque las guías en un área oscura (por ejemplo, un cajón de banco) para dejar que se asiente el medio de montaje. Selle el cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas transparente y déjelo secar en un área oscura antes de examinarlo con el microscopio confocal. Después, guarde las diapositivas selladas en la oscuridad (caja de diapositivas de la carpeta de diapositivas) a 4° hasta la obtención de imágenes.
12. Utilice un microscopio confocal con un aumento de 40x-100x con canales de 488 nm y 657 nm para obtener imágenes de la muestra.

Con esta técnica, el utrículo humano y las ampollas del canal lateral y superior se extrajeron intactos con un traumatismo mínimo (Figura 2). Como se puede observar en la Figura 2, las ampollas se pueden recolectar con una porción sustancial del conducto membranoso. El marcaje inmunofluorescente con anti-tenascina-C (proteína de la matriz extracelular) y anti-oncomodulina (pequeña proteína de unión al calcio de la famili...

En este artículo se describe una nueva técnica para la extracción submarina de órganos terminales vestibulares en BSS utilizando endoscopios y su análisis mediante imágenes inmunofluorescentes. Aquí, demostramos la recolección de órganos terminales vestibulares intactos con células ciliadas vestibulares intactas y suficiente calidad de tejido para un inmunomarcaje exitoso. La densidad de células ciliadas en nuestro espécimen fue similar a la obtenida en otros estudios con don...

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a Mohamed Lehar por su ayuda en este proyecto. Este trabajo contó con el apoyo del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (U24DC020850).