Entnahme vestibulärer Endorgane unter physiologischen Bedingungen während der Labyrinthektomie

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Technik zur Entnahme menschlicher vestibulärer Endorgane unter physiologischen Bedingungen während der Labyrinthektomie und deren Analyse mittels Immunfärbung.

Das lebende menschliche Innenohr ist schwierig zu untersuchen, da es von einem dichten otischen Kapselknochen umhüllt ist, der den Zugang zu biologischem Gewebe einschränkt. Traditionelle histopathologische Methoden des Schläfenknochens beruhen auf langwierigen, teuren Entkalkungsprotokollen, die 9-10 Monate dauern und die Art der Gewebeanalyse, die aufgrund des RNA-Abbaus möglich ist, reduzieren. Es besteht ein dringender Bedarf, Methoden für den Zugang zu frischem menschlichem Innenohrgewebe zu entwickeln, um otologische Erkrankungen wie Morbus Menière auf zellulärer und molekularer Ebene besser zu verstehen. In dieser Arbeit wird eine Technik zur Entnahme von humanen vestibulären Endorganen von einem lebenden Spender unter physiologischen Bedingungen beschrieben. Eine Person mit Morbus Menière und "Drops-Attacken", die auf intratympanale Gentamicin-Injektionen refraktär waren, wurde einer Labyrinthektomie unterzogen. Zunächst wurde eine traditionelle Mastoidektomie durchgeführt, bei der die horizontalen und oberen Bogengänge (SCC) identifiziert wurden. Die Mastoidhöhle wurde mit einer ausgewogenen Salzlösung gefüllt, so dass das Labyrinth unter physiologischeren Bedingungen geöffnet werden konnte, um die zelluläre Integrität zu erhalten. Zur Visualisierung der untergetauchten Mastoidhöhle wurde ein Null-Grad-Endoskop mit einem Spülsystem zur Linsenreinigung verwendet, und ein 2-mm-Diamantfräser wurde verwendet, um die horizontalen und oberen SCCs zu skelettieren und zu öffnen, gefolgt von der Apsis. Die Ampullen und ein Teil der Kanalgänge für die oberen und lateralen SCCs wurden entnommen. Der Utriculus wurde auf ähnliche Weise entnommen. Das entnommene Gewebe wurde sofort in einen eiskalten Puffer gelegt und dann eine Stunde lang in 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Das Gewebe wurde mehrmals in 1x PBS gespült und 48 h bei 4 °C gelagert. Die Gewebeproben wurden einer Immunfärbung mit einer Kombination von Primärantikörpern gegen Tenascin-C (Calyx), Oncomodulin (streoläre Haarzellen), Calretinin (Calyx und Typ II-Haarzellen), synaptischem Vesikelprotein 2 (efferente Fasern und Boutons), β-Tubulin 1 (Calyx und afferente Boutons) unterzogen, gefolgt von einer Inkubation mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern. Die Gewebeproben wurden dann gespült und für die konfokalmikroskopische Untersuchung montiert. Die Bilder zeigten das Vorhandensein von Ampullen- und Makulahaarzellen und neuronalen Strukturen. Dieses Protokoll zeigt, dass es möglich ist, intaktes, hochwertiges menschliches Innenohrgewebe von lebenden Spendern zu gewinnen, und kann ein wichtiges Werkzeug für die Erforschung otologischer Erkrankungen darstellen.

Das lebende menschliche Innenohr ist aufgrund seiner Lage innerhalb des dichten otischen Kapselknochens des Schläfenbeins schwierig zu untersuchen. Infolgedessen war der Zugang zum menschlichen Gewebe begrenzt, und die Forscher haben sich hauptsächlich auf die postmortale Gewebeentnahme verlassen. Die postmortale Histopathologie des Schläfenknochens (TBH) ist seit über 100 Jahren ein wichtiges Instrument für das Verständnis otologischer Erkrankungen des Menschen ^1,2,3. Das Gewebe für TBH wird durch die postmortale Entnahme des Schläfenknochens, einen langwierigen (9-10 Monate) Entkalkungs- und Gewebevorbereitungsprozess vorbereitet, gefolgt von Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Während TBH ein wesentliches Werkzeug bleiben wird, um neue Informationen über das gesunde und kranke menschliche Innenohr zu gewinnen, schränken lange Obduktionszeiten und lange und harte Gewebeverarbeitungsmethoden ihren Nutzen für bestimmte Zwecke ein, so dass zusätzliche Methoden zur Untersuchung des menschlichen Innenohrgewebes erforderlich sind. Die hochauflösende Magnetresonanztomographie kann die Organe des Innenohrs sichtbar machen, verfügt jedoch nicht über eine ausreichende Auflösung, um Strukturen auf zellulärer oder molekularer Ebene zu betrachten ^4,5. Aufgrund dieser Herausforderungen sind viele Erkrankungen des menschlichen Innenohrs nach wie vor wenig verstanden.

Ein alternativer Ansatz ist die Entnahme von Innenohrgewebe während der Operation. Bei der Labyrinthektomie oder der translabyrinthinen Resektion des Vestibularisschwannoms wird das Innenohrgewebe absichtlich geopfert. Utrikel, die von Patienten während der translabyrinthischen Resektion des vestibulären Schwannoms entnommen wurden, wurden verwendet, um die Morphologie der vestibulären Haarzellen^zu charakterisieren ^6,7,8 und die Regeneration der Haarzellen zu untersuchen ^9,10. In jüngerer Zeit wurden Techniken entwickelt, um Innenohrorgane von Organspendern unter Verwendung eines transkanalischen Ansatzes zu gewinnen, der verwendet werden kann, um den Utriculus und möglicherweise andere vestibuläre Endorgane durch ein verbreitertes ovales Fenster mit minimalem Gewebetrauma zu entfernen^11,12. Mit dieser Technik war es möglich, einzelzelluläre Transkriptomprofile für den menschlichen Utriculus zu charakterisieren¹³. Diese Techniken setzen die Innenohrorgane während der Ernte jedoch unphysiologischen Bedingungen aus. Insbesondere können Innenohrorgane dem Fehlen von perilymphatischer Flüssigkeit und dem Eintauchen in normale Salzbohrerspülungen ausgesetzt sein, die eine wesentlich andere Ionenzusammensetzung als perilymphatische Flüssigkeit aufweisen. Darüber hinaus ist das dehydrierte membranöse Labyrinth selbst bei maximaler Vergrößerung des Operationsmikroskops schwer zu visualisieren, was eine atraumatische chirurgische Dissektion zu einer Herausforderung macht. Mechanische Traumata können das Gewebe weiter schädigen, und unsere anekdotischen Erfahrungen deuten darauf hin, dass chirurgisches Gewebe aufgrund mechanischer Schädigung und zellulärer Degeneration oft von unzureichender Qualität der Immunfärbung ist. Es besteht ein Bedarf an neuen Techniken zur atraumatischen Entnahme von menschlichem Innenohrgewebe für biologische Studien, die schlecht verstandene menschliche Innenohrerkrankungen aufklären können. Hier beschreiben wir eine Unterwassertechnik zur Entnahme menschlicher vestibulärer Endorgane unter physiologischeren Bedingungen während der Labyrinthektomie und deren Analyse mittels Immunfärbung.

Dieses Protokoll wurde mit Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) der Johns Hopkins University School of Medicine (IRB00203441) und gemäß den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem Gewebe und potenziell infektiösem Material entwickelt. Die Gewebeentnahme wurde während der Labyrinthektomie durchgeführt, die Teil der klinischen Standardversorgung bei der widerspenstigen Menière-Krankheit mit Fallattacken ist.

1. Labyrinthektomie und Gewebeentnahme

1. Holen Sie die Genehmigung des lokalen Institutional Review Board (IRB) ein, überprüfen Sie die institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem und infektiösem Material und holen Sie die Zustimmung zur Gewebespende ein, bevor Sie dieses Protokoll verwenden. Führen Sie eine Gewebeentnahme während der chirurgischen Labyrinthektomie oder des translabyrinthinen Zugangs zum inneren Gehörgang durch, der Teil der klinischen Standardversorgung ist.
2. Bereiten Sie den Patienten vor.
   1. Besprechen Sie vor der Einleitung der Narkose mit dem Anästhesieteam die Vermeidung von lang anhaltenden Lähmungen, damit der Gesichtsnerv überwacht werden kann.
   2. Sobald die Vollnarkose eingeleitet ist, intubieren Sie den Patienten und drehen Sie den Operationstisch um 180°. Platzieren Sie Elektroden zur Überwachung des Gesichtsnervs und stellen Sie sicher, dass eine präoperative Antibiotikaprophylaxe durchgeführt wird.
   3. Injizieren Sie 1% Lidocain mit 1:100.000 Adrenalin in den äußeren Gehörgang und den postaurikulären Bereich. Bereiten Sie das Ohr auf die übliche Weise mit Betadin vor.
3. Verwenden Sie eine #15-Klinge, um einen standardmäßigen (5-6 cm) postaurikulären krummlinigen Schnitt 1 cm hinter der postaurikulären Falte zu erstellen.
4. Heben Sie das postaurikuläre Weichgewebe an.
   1. Identifizieren Sie die Faszie temporalis superior und heben Sie den postaurikulären Hautlappen anterior in Richtung Gehörgang an.
   2. Legen Sie einen standardmäßigen 7-förmigen Periostschnitt an und heben Sie das Periost nach vorne an, bis die Henle-Wirbelsäule und der knöcherne Gehörgang identifiziert sind. Platzieren Sie selbstumschulende Retraktoren.
5. Führen Sie eine Mastoidektomie durch.
   1. Führen Sie eine vollständige Mastoidektomie durch, bei der die Tegmen superior, der Sigmasinus posterior und der äußere Gehörgang anterior ausgedünnt werden.
   2. Identifiziere den horizontalen Bogengang und den kurzen Fortsatz des Inkus.
      HINWEIS: Der Mastoid sollte nicht unterlegt werden, um sicherzustellen, dass er ein Gefäß bleibt, das Flüssigkeit für die Entnahme von Unterwassergewebe aufnehmen kann.
6. Identifizieren Sie die Bogenkanäle (SC).
   1. Unter dem Operationsmikroskop (2-4-fache Vergrößerung) verwenden Sie einen 3 mm groben Diamantgrat, um die perilabyrinthischen Luftzellen lateral des oberen SC, die subarkuaten Luftzellen und die retro-labyrinthischen Luftzellen hinter dem hinteren SC zu entfernen, die sich oberhalb der Crus erstrecken.
7. Tauchen Sie das Labyrinth ein.
   1. Tauchen Sie die Mastoidhöhle in eine ausgewogene Salzlösung (BSS) und visualisieren Sie das Labyrinth mit einem Null-Grad-Endoskop mit einem Bewässerungssystem zur Reinigung der Linsenscheide.
   2. Verwenden Sie das Spülsystem zur Reinigung der Linsenscheide, um die Mastoidhöhle mit BSS zu spülen, das Blut wegzuspülen und eine verbesserte Visualisierung des Labyrinths zu ermöglichen.
8. Blaue Linie' SCs.
   1. Unter Beibehaltung eines ausreichenden BSS-Spiegels in der Mastoidhöhle und unter Verwendung des Endoskops zur Visualisierung verwenden Sie einen 3 mm Diamantfräser, um alle drei Bogengänge "blau zu zeichnen", indem Sie den Knochen der otischen Kapsel vorsichtig wegbohren, bis der Bogengang bei der Betrachtung mit dem Endoskop als bläuliche Linie erscheint.
   2. Spülen Sie intermittierend mit BSS-Lösung, indem Sie das Spülsystem verwenden, um das Blut wegzuspülen und eine angemessene Visualisierung zu erreichen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
9. SC-Ampullen ernten.
   1. Unter BSS tritt man in die Kuppel des lateralen Bogengangs ein und folgt dieser nach vorne, bis seine Ampullen identifiziert sind. Treten Sie in den SC superior ein und folgen Sie diesem medial in Richtung seiner Ampullen, die mit den Ampullen des SC superior entnommen werden können. Schneiden Sie den lateralen SC-Gang scharf ab, um die Entnahme zu erleichtern.
   2. Heben Sie die horizontalen und oberen SC-Ampullen mit einer Rosen-Nadel von der Crista ab und trennen Sie die afferenten Fasern von den Epithelien und dem membranösen Labyrinth. Entfernen Sie dann diese Strukturen.
   3. Durchschneiden Sie die Kuppel des hinteren SC und folgen Sie dieser inferior und anterior zu seinen Ampullen. Ernten Sie auf ähnliche Weise die hinteren SC-Ampullen und legen Sie das gesamte Gewebe in BSS auf Eis.
10. Makula ernten.
    1. Entfernen Sie den Knochen zwischen den horizontalen und hinteren SC-Ampullen, um das Vestibulum freizulegen. Die membranösen Wände des Utriculus wurden durch die Entfernung der Ampullen zerrissen. Solange ein Flüssigkeitsspiegel aufrechterhalten wird, bleiben die Makulae anterior befestigt; Heben Sie es an und entfernen Sie es.
    2. Der Saccule sitzt in der kugelförmigen Aussparung; Heben Sie es scharf an und entfernen Sie es aus der Aussparung. Legen Sie die Gewebeproben in BSS auf Eis.
11. Transportieren Sie Gewebeproben auf Eis vom Operationssaal ins Labor zur Fixierung innerhalb von 1 h nach der Entnahme.

2. Immunhistochemie und Bildgebung

1. Fixieren Sie die Probe.
   1. Legen Sie die Gewebeprobe in 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) bei Raumtemperatur (RT) mit leichtem Schaukeln oder Orbitalschütteln (100 U/min) für 1 h.
      HINWEIS: 4%ige PFA-Lösung (für insgesamt 5 mL): 625 mL 32%ige PFA-Stammlösung + 500 mL 10xPBS + 3875 mL ddH₂O.
2. Gewebeproben in 1x PBS-Lösung überführen und 3x 15 min (ggf. länger) bei RT mit leichtem Schaukeln oder Orbitalschütteln spülen.
3. Überschüssiges Bindegewebe unter dem Präpariermikroskop in 1x PBS bei RT entfernen.
4. Entkalken Sie die Probe.
   1. Übertragen Sie Gewebeproben in 5 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 1x PBS-Lösung, um die sensorischen Epithelien von feinen Knochentrümmern und Otokonien zu befreien. Führen Sie die Inkubation für 15-30 Minuten bei RT mit leichtem Schaukeln oder orbitalem Schütteln durch.
5. Auch hier werden Gewebeproben in 1x PBS-Lösung überführt und 3x 15 min (ggf. länger) bei RT mit leichtem Schaukeln oder Orbitalschütteln gespült.
6. Tragen Sie 125-200 mL 2x Blocking-Puffer (2x BB) auf jede Probe auf und inkubieren Sie sie 1,5-5 h lang bei RT oder über Nacht (ON) bei 4 °C. Lassen Sie die Inkubation unter ständigem Orbitalschütteln laufen.
   HINWEIS: 2x Blockierungspuffer (2x BB): 1 g Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in bis zu 5 ml 1x PBS, ergänzt mit 0,5% Triton X-100. Das BSA dient als Blocker für unspezifische Antigen-Bindungsstellen.
7. Färben mit Primärantikörpern.
   1. 120-150 ml einer Kombination von Primärantikörpern, gelöst in 1x BB, auf die gewünschte Verdünnung auftragen. Auftragen Sie Kaninchen-Anti-Tenascin-C-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 (2,5 μg/ml), Ziegen-Anti-Oncomodulin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 (2,5 μg/ml), Maus-Anti-Calretinin in einer Verdünnung von 1:300 (2,2 μg/ml) und DAPI in einer Verdünnung von 1:1000 (1 μg/ml). Dann wird die Probe (abgedeckt) für die ON-Inkubation bei 4 °C (Kühlschrank oder Kühlraum) unter leichtem Orbitalschütteln überführt.
      HINWEIS: 1x BB: Mischen Sie die gleiche Lautstärke von 2x BB und 1x PBS, ergänzt mit 0,5% Triton X-100.
8. Spülen Sie die Gewebeproben in 1x PBS-Lösung, 3x 15 min (oder länger, falls länger), bei RT unter leichtem Schaukeln.
9. Färben mit Sekundärantikörper.
   1. 120-150 ml einer Kombination von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern aufbringen, gelöst in 1x BB in einer Verdünnung von 1:2000 (1 μg/ml). Tragen Sie einen konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper mit 488 nm, einen 568 nm Anti-Maus-Sekundärantikörper und einen 647 nm Anti-Ziegen-Sekundärantikörper auf.
   2. Inkubieren Sie dann die Probe (abgedeckt) bei RT unter leichtem Orbitalschütteln für 1,5-2 h (oder ON bei 4 °C).
10. Spülen Sie die Gewebeproben in 1x PBS-Lösung, 3x 15 min (oder länger, falls länger), bei RT unter leichtem Schaukeln.
11. Mikrodissektion und Montage durchführen.
    1. Entfernen Sie unter dem Präpariermikroskop überschüssiges Gewebe und Membranen aus der Umgebung der sensorischen vestibulären Epithelien. Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um die Oberfläche eines histologischen Objektträgers aus Glas zu reinigen, trocknen Sie es an der Luft und tragen Sie einen 55-ml-Tropfen des entsprechenden Einbettmediums auf.
    2. Übertragen Sie die sensorischen Gewebeproben auf das Einbettmedium. Richten Sie die Proben mit einer feinen Pinzette vorsichtig mit der Haarbündelseite nach oben im Eindeckmedium aus.
    3. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas der entsprechenden Größe auf das Eindeckmedium mit den Proben und versuchen Sie, die Luftblasen zu begrenzen. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas die für die konfokale Mikroskopie erforderliche Dickenklasse #1,5 aufweist.
    4. Platzieren Sie die Schienen an einem dunklen Ort (z. B. in einer Bankschublade), damit das Montagemedium aushärten kann. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf dem Objektträger und lassen Sie es an einer dunklen Stelle trocknen, bevor Sie es mit dem Konfokalmikroskop untersuchen. Anschließend lagern Sie die versiegelten Objektträger im Dunkeln (Objektträgerbox des Objektträgerordners) bei 4° bis zur Bildgebung.
12. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit 40-100-facher Vergrößerung mit 488 nm und 657 nm Kanälen, um die Probe abzubilden.

Mit dieser Technik wurden der humane Utriculus sowie die Ampullen des lateralen und oberen Kanals intakt und mit minimalem Trauma entnommen (Abbildung 2). Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, können die Ampullen mit einem erheblichen Teil des Membranleiters entnommen werden. Die Immunfluoreszenzmarkierung mit Anti-Tenascin-C (extrazelluläres Matrixprotein) und Anti-Oncomodulin (kleines Calcium-bindendes Protein der Parvalbumin-Pro...

In dieser Arbeit wird eine neue Technik zur Unterwasserentnahme von vestibulären Endorganen bei BSS mit Hilfe von Endoskopen und deren Analyse mittels Immunfluoreszenzbildgebung beschrieben. Hier zeigen wir die Gewinnung von intakten vestibulären Endorganen mit intakten vestibulären Haarzellen und ausreichender Gewebequalität für eine erfolgreiche Immunmarkierung. Die Haarzelldichte in unserer Probe war ähnlich wie in anderen Studien von lebenden Organspendern¹³

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir danken Mohamed Lehar für seine Unterstützung bei diesem Projekt. Diese Arbeit wurde vom National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (U24DC020850) unterstützt.