סינתזה של חרוזים טעונים בשמן קצח, על בסיס אלגינט, רגישים ל-pH בטכניקת ריסוס חשמלי

מוצגת טכניקה המשתמשת במתח חשמלי גבוה ותחליב ממוקד ועמוס בחומרים פעילים לייצור מיקרו-חרוזים אחידים ומגיבים ל-pH.

שמן קצח (BSO), המופק מזרעי צמח Nigella sativa , זכה לתשומת לב בשל תכונותיו האנטי-סרטניות הפוטנציאליות, במיוחד בהקשר של סרטן המעי הגס. התרכובת הפעילה שלו, תימוקינון, עשויה לעזור לעכב צמיחת תאי סרטן ולגרום לאפופטוזיס בתאי סרטן המעי הגס. נוסף על כך, השפעתו נוגדת הדלקת ונוגדת החמצון של שמן קצח תרבותי עשויה לתרום לסביבת מעיים בריאה יותר, מה שעשוי להפחית את הסיכון לסרטן. לכן, מחקר זה סינתז חרוזי אלגינט רגישים ל-pH כדי להעביר BSO למעי הגס בצורה מבוקרת מבלי לשחרר את התרופה ב-pH 1.2 (קיבה), ובכך לספק דפוס שחרור מוגדר היטב ב-pH 6.8. השימוש בטכנולוגיית אלקטרוספריי משפר את ביצועי התהליך בכך שהוא מקל על ניסוח חרוזים קטנים והומוגניים עם שיעור נפיחות ודיפוזיה גבוה יותר במדיום מערכת העיכול.

החרוזים המנוסחים אופיינו בבדיקת חוזק רירית ex-vivo , גודל חרוז, גורם כדוריות (SF), יעילות אנקפסולציה (EE), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), התנהגות נפיחות במבחנה (SB) ושחרור תרופות במבחנה במדיה חומצית ובופר. כל החרוזים המיוצרים הללו הדגימו גדלים צנועים של 0.58 ± 0.01 מ"מ וצורה כדורית של 0.03 ± 0.00 מ"מ בבדיקה זו. הפורמולה הראתה תכונות צפות ומשחררות מבטיחות במבחנה. עם אחוז מצטבר נמוך מאוד של חרוזים, ה-EE של השמן של 90.13% ±-0.93% היה גבוה, ומחקר השחרור הראה יותר מ-90% ב-pH 6.8 עם אופי צף טוב בקיבה. בנוסף, החרוזים היו מרווחים באופן שווה בכל המעי. גישת הריסוס החשמלי המשמשת בפרוטוקול זה ניתנת לשחזור, ומניבה תוצאות עקביות. לכן, פרוטוקול זה יכול לשמש לייצור בקנה מידה גדול למטרות מסחור.

קצח, ובמיוחד BSO, שימש זה עידנים לריפוי מגוון רחב של מחלות בשל סגולותיו הרפואיות המבוססות. תימוקינון הוא אולי אחד הפיטוכימיקלים החשובים ביותר המצויים ב-BSO¹. בשנים האחרונות, חוקרים חקרו את היתרונות הטיפוליים הפוטנציאליים של תימוקינון in vivo ו-in vitro, והפיקו ראיות אמפיריות התומכות בשימוש ב-BSO. תכונות נוגדות יתר לחץ דם, אנטיבקטריאליות, אנטי-היסטמיניות, אנטי פטרייתיות, משככות כאבים, נוגדות סוכרת, הורדת שומנים ואנטי דלקתיות הודגמו כולן על ידי מחקרים אלה עבור BSO, אשר עשוי לשמש לטיפול בתסמינים כגון אקזמה, לחץ דם גבוה, אסטמה, שיעול, כאבי ראש, שפעת, חום, אנטי סרטן, סחרחורת ופעילות^{גופנית 2,3}.

מריחת כיסויים דקים יחסית על טיפות קטנות של נוזלים ופיזורים, או חלקיקים של חומר מוצק, ידועה בשם מיקרו-אנקפסולציה. כשמדובר בשמן, שמן מיקרו-קפסולות הוא בדרך כלל בעל ערך רב מכיוון שצורות מסוימות של שמן, כמו BSO, נחשבות למזונות מזינים ומציעות יתרונות רפואיים⁴. עם זאת, הוספת שמנים ישירות למטריצת המזון עלולה להוביל לנידוף, מה שעלול לגרום במהירות להעלמת פעילויות כתוצאה מחשיפה לחמצן ולאור UV⁵. יתר על כן, חוסר השליטה על קצב שחרור השמנים מביא להשפעה מיידית וחולפת. יצירת ציפוי פולימרי סביב השמן האתרי על ידי מיקרו-אנקפסולציה או מיקרוספריפציה היא שיטה אחת להתגבר על החסרונות הללו⁶.

מיקרו-קפסולות, הידועות גם בשם מיקרוספרות, מגנות על השמנים מפני תנאי סביבה מזיקים⁷. תהליך זה נמצא בשימוש נרחב כדי להגביר את יעילות התרופות, לשמר את תכולת התרופות, לאפשר טבליות בשחרור מושהה, לשפר את מיסוך הטעם, להפחית את אובדן הטעם במהלך חיי המדף של המוצר, להאריך את תחושת הפה ולהפריד מרכיבים לא תואמים במינון יחיד⁸. מיקרו-אנקפסולציה מסייעת גם בשמירה על ספיגה מטבולית, שליטה בקצב שחרור השמן ושמירה על הריכוזים המתאימים כדי להניב את התוצאה המיועדת במיקום מסוים⁹.

אנקפסולציה אלקטרו-הידרודינמית היא שיטה פשוטה וניתנת להתאמה. החומר הפעיל שוכן בליבה הפנימית של מיקרו-קפסולה, המורכבת ממעטפת חיצונית. בהקשר זה, הוא כולל מטריצה חזקה למדי כדי להבטיח שניתן יהיה להפיץ את הרכיב הפעיל בצורה יעילה יותר במקום גרעין מוגדר בבירור. לפני הספריציקלציה, יש לשלב את החומר הפעיל ותמיסת הפולימר כדי לייצר את המיקרוספירות⁹. מצד שני, מכיוון ששמן הוא נדיף, מיקרו-אנקפסולציה שלו יכולה להיות קשה ביותר ודורשת בקרת טמפרטורה קפדנית.

ישנן שיטות שונות לעטיפת שמנים. לדוגמה, שמנים מסוימים צריכים להיות עטופים בטמפרטורות נמוכות כדי למנוע פירוק או נידוף של הרכיבים הביו-אקטיביים שלהם. כדי ליצור מבנים בגודל מיקרו וננו, אטומיזציה אלקטרוהידרודינמית (EHDA) נחקרה בהרחבה על ידי חוקרים¹⁰. במובן זה, תנאי העיבוד, הכוללים קצב זרימה, מתח מופעל וגודל זרבובית, כמו גם תכונות מרחק האיסוף של התמיסה הפולימרית, הם שני הגורמים העיקריים שיש לקחת בחשבון כדי לייצר את גודל החלקיקים או המורפולוגיה הרצויים^11,12.

במחקר זה, נעשה שימוש באלגינטים - סוג של פוליסכרידים טבעיים המתאימים לבליעה דרך הפה - כדי לעטוף את ה-BSO. אצות חומות מכילות אלגינט, פולימר אניוני המופיע באופן טבעי. הוא מורכב משני מבנים מונומריים: α-L-guluronic (G) וחומצה 1-4βD-mannuronic (M)¹³. הפולימר שלו אינו רעיל¹⁴, בעל רמה גבוהה של תאימות ביולוגית, הוא זול ומתכלה ביעילות¹⁵. לכן, הוא משמש לעתים קרובות במגזרי הביוטכנולוגיה וההנדסה.

אלגינטים הם החומר הנבחר לאנקפסולציה על ידי ג'לציה יונית מכיוון שהם עשויים ליצור מבנה צולב בין קבוצות G של שרשראות אלגינט שונות על ידי יצירת קשרים יוניים עם קטיונים דו-ערכיים כמו יונים Sr²⁺, Ca²⁺ או Zn²⁺. ניתן לאפיין את תהליך הג'לציה כראוי על ידי מודל קופסת הביצים, המגביל את הקטיון הדו-ערכי לשתי קבוצות קרבוקסיל על מולקולות האלגינט זו לצד זו. הוצע כי מאפייני ההידרוג'ל של חרוזי נתרן אלגינט עשויים לווסת את שחרור המקרומולקולות והמולקולות הקטנות. חרוזי הנתרן אלגינט עשויים להיצמד לרירית המעי למשך זמן ממושך בשל איכויות הדבק הריריות שלהם. יתר על כן, אלגינט מציע מגן שעשוי להגן על שמנים מפני אלמנטים חיצוניים כגון מדיה חומצית¹⁶ ומעביר שמנים לתעלות האספקה של מערכת העיכול¹⁷. מאז הוא שימש במחקר כדי לסייע במתן תרופות ספציפיות לאתר לרקמות ריריות^18,19.

הגישה האלקטרו-הידרודינמית שימשה במחקר זה כדי לחקור את הכדאיות של תחליב שמנים מסחריים ליצירת כמוסות²⁰. כאן, הגישה האלקטרו-הידרודינמית שימשה ליצירה וניתוח מיקרוספירות טעונות אלגינט-BSO²⁰. מחקר זה העריך מספר גורמים אחרים, כולל תכונות ה-SF, ex-vivo, הדבק הרירי, EE%, המראה הפיזי, התפלגות הגודל ופוטנציאל הזטה; ספקטרוסקופיה מוחלשת של השתקפות כוללת-אינפרא אדום טרנספורמציה פורייה (ATR-FTIR) שימשה לבדיקת תאימות כימית²⁰.

1. הכנת תחליב אלגינט-BSO

1. יש לפזר 10% w/v BSO בתמיסת נתרן אלגינט 1% w/v המכילה 1, 3 ו-5% w/v לציטין בכוס של 50 מ"ל.
2. השג ננו-אמולסיה באמצעות הומוגנייזר קולי. הגדר את רמת ההספק ל-20%. הפעל את ההומוגנייזר למשך 55 שניות על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה כדי להשלים את התהליך.

2. אפיון תחליב אלגינט-BSO

1. לנתח את פוטנציאל הזטה והתפלגות גודל החלקיקים
   1. קח 0.1 מ"ל מהתחליב הטרי שהוכן בכוס זכוכית של 25 מ"ל ודלל אותו ב -9.9 מ"ל מים מזוקקים.
   2. קח 2.5 מ"ל מהתמיסה המדוללת הזו לקובט קוורץ של 3 מ"ל והנח את הקובט בתא מדידה.
   3. פתח את המכסה והנח את הקובט בתוך המכשיר, וודא שהקובטה מכוונת נכון ביחס לנתיב אלומת האור. לחץ על סמל המדידה .
   4. הוצא את הקובטה. אחזר את הדגימה או השלך אותה כראוי.
   5. שמור את הנתונים כקובץ pdf בתיקייה אישית לשימוש נוסף.
2. קביעת יציבות אמולסיה (ES)
   1. קח 5 מ"ל תחליב טרי שהוכן בצינורות צנטריפוגה של 10 מ"ל. צנטריפוגה את האמולסיות (n = 3) למשך 5 דקות ב-894 × גרם.
   2. באמצעות משוואה (1), קבע את ה-ES על סמך מיקום ממשק הפרדת הפאזה.
      (1)
      כאשר Vemul הוא נפח האמולסיה שנותרה לאחר צנטריפוגה ו-Vinitial הוא נפח האמולסיה הראשונית.
3. הכנת חרוזים
   1. חרוזי אלגינט BSO
      1. הכן חרוזי אלגינט BSO בטכניקת אלקטרוספריי הנקראת EHDA. השתמש בתחליב BSO לפי נפח (w/v) המורכב מ-10% BSO, 1% נתרן אלגינט ו-3% תמיסת לציטין).
      2. בעזרת משאבת מזרק לוויסות קצב הזרימה, טען את האמולסיה למזרק פלסטיק של 10 מ"ל ודחף אותו דרך מחט של 22 גרם. חבר את קצה המחט לאלקטרודה החיובית של ספק כוח במתח גבוה.
      3. כאספן, השתמש בכוס מקורקעת עם 50 מ"ל של 1% w/w סידן כלורי (אמבט ג'ל) בתוכה. החלף את קצב זרימת הטפטוף בין 1 מ"ל/דקה ל-3 מ"ל/דקה במתחים של 3, 5 ו-7 קילו וולט תוך שמירה על מרחק של 10 ס"מ מעל פני השטח של תמיסת הסידן הכלורי.
      4. כדי לאשר ג'לציה מלאה, השאירו את החרוזים באמבט הג'ל למשך 30 דקות תוך כדי ערבובם. השתמש במסנן נירוסטה כדי להסיר את החרוזים מאמבט הג'ל ולשטוף את החרוזים שנאספו במים מזוקקים טהורים במיוחד.
      5. הניחו לחרוזים להתייבש במשך 16 שעות בטמפרטורת החדר על ספסל מעבדה. השתמש במשוואה (2) כדי לחשב את אחוז התפוקה של חרוזים.
         (2)
   2. חרוזי אלגינט ללא BSO
      1. הכן תמיסה של 1% w/v של נתרן אלגינט. הוסף לציטין בריכוזים של 1%, 3% ו-5% משקל/נפח לתמיסה. מערבבים היטב את התמיסה עד שהלציטין נמס לחלוטין.
      2. השתמש בפתרון משלב 2.3.2.1 כדי להכין חרוזי אלגינט נטולי BSO כמתואר בשלבים 2.3.1.2-2.3.1.5. חשב את התשואה באמצעות משוואה (2).

3. אפיון חרוזים

1. קביעת גודל וצורה
   1. כדי לברר את גודל וצורת החרוזים, השתמש במנתח תמונות. צלם תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית של החרוזים הרטובים והיבשים.
   2. לאחר מכן, מדוד את קוטר החרוזים באמצעות מוט קנה המידה המותקן מראש של המכשיר. באמצעות ערכי הקוטר, חשב את ה-SF מערכי הקוטר המתקבלים באמצעות משוואה (3):
      SF = (3)
      כאשר Dmax מייצג את הקוטר הגדול ביותר שעובר במרכז החרוז (במ"מ), בעוד Dper מתייחס לקוטר הניצב ל-Dmax ועובר דרך מרכז החרוז (במ"מ).
      הערה: SF של אפס מציין חרוז כדורי אידיאלי, כאשר ערכי SF הולכים וגדלים מסמלים סטייה גדולה יותר מצורה כדורית. יתר על כן, חרוזים נחשבים כדוריים אם ה-SF שלהם הוא 0.05 ומטה.

4. קביעת EE%

1. לפרק את החרוזים במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להחזיר אותם לאמולסיה. מדוד את הספיגה של האמולסיה המתקבלת ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
2. השתמש בערך הספיגה כדי לייצג את עכירות האמולסיה. צור עקומה סטנדרטית באמצעות כמות ידועה של BSO באמולסיה.
3. חשב את ה-EE% באמצעות משוואה (4):
   (4)

5. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)

הערה: השתמש ב-SEM כדי להתבונן במיקרו-מבנה ובמורפולוגיה של פני השטח של חרוזי האלגינט של BSO.

1. כדי לבדוק את החלק הפנימי של החרוזים המיובשים, חותכים כמה מהם. זהו את החרוזים החתוכים על גבי דפי אלומיניום והדביקו אותם באמצעות סרטי דבק פחמן.
2. מצפים את החרוזים במודול מקרטע פחמן במאייד ואקום באווירת ארגון. מרחו עובי של 100 Å ו-50 Å לציפוי הפחמן.
3. רכוש תמונות של החרוזים המצופים בוואקום גבוה עם מאיץ מתח בין 10 קילו וולט ל -15 קילו וולט.

6. קבע אינטראקציה בין תרופות באמצעות ATR-FTIR

1. הגדר את מספרי גלי המכשיר בין 4,000 ס"^{מ-1 ל-400} ס"^מ-1 תוך שימוש באוויר הסביבה כרקע ורזולוציה של 1 ס"^מ-1. ראה קובץ משלים 1.
2. רשום ספקטרום של BSO, נתרן אלגינט, לציטין, סידן כלורי, חרוזים ללא BSO, חרוזי אלגינט-BSO ותערובת פיזית של חומרים פעילים וחומרי עזר (נתרן אלגינט, לציטין, סידן כלורי ו-BSO) בנפרד.
   1. הנח את הדגימה (5-10 מ"ג) על אזור הדגימה. התאם 20 סריקות, רזולוציה 4, כוח מד 80, זרוע לחץ עם קצה שטוח. ודא שההפרש הקבוע האוטומטי נשאר מוגדר לאפשרות ריק כך שהספקטרום יאוחסן אוטומטית בתיקייה הרצויה.
   2. כדי להתחיל במדידת הדגימה, לחץ על הלחצן [דוגמה]. לאחר בחירת [מדגם], מכיוון שאין תקופת המתנה, הקפד להכין את הדגימה ולהפחית את מהדק הלחץ. נתח את כל הדגימות בנפרד. נתח בנפרד את כל הספקטרום המוקלט באמצעות תוכנת ספקטרוסקופיה.

7. קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית (DSC)

הערה: המאפיינים התרמיים והתאימות של החרוזים הטעונים ב-BSO נחקרו באמצעות DSC (קובץ משלים 1).

1. חרוזי חותם במשקל ~3.20 מ"ג במחבת אלומיניום רגילה. מחממים את הדגימות בקצב של 10 מעלות צלזיוס לדקה תוך ניתוח בטווח טמפרטורות של 50-350 מעלות צלזיוס תחת זרם חנקן הזורם בקצב של 20 ליטר לדקה.

8. מאפייני נפיחות של חרוזים

1. הכינו 100 מ"ג חרוזי אלגינט-BSO מיובשים.
2. הכן נוזל מעיים מדומה (SIF) ונוזל קיבה מדומה (SGF) בכלי ערבוב נקי ויבש בגודל מתאים -6 ליטר, 10 ליטר או 25 ליטר. הוסף מים מטוהרים לכ-33% מהנפח הנדרש -2 ליטר, 3 ליטר או 8 ליטר, והעביר את תכולת בקבוק התרכיז לכלי. שטפו את הבקבוק במים מטוהרים והוסיפו את השטיפות והמים המטוהרים לכלי הערבוב כדי להשיג את הנפח הנדרש; מערבבים היטב. מדוד את ה-pH והמשך אם במסגרת המפרט; התאם את ה- pH במידת הצורך.
3. טבלו את החרוזים ב-50 מ"ל של מדיה המכילה נוזל מעיים מדומה (SIF) ונוזל קיבה מדומה (SGF). שמור על התנאים למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס.
   1. הסר את החרוזים המנופחים וסנן אותם דרך רשת מתכת במרווחים מוגדרים מראש של 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ו-120 דקות או יותר. השתמש במגבת נייר כדי להסיר נוזלים מיותרים מהחרוזים הנפוחים.
   2. מדוד את משקל החרוזים המנוגבים באמצעות איזון אנליטי אלקטרוני. קבע את אחוז מדד הנפיחות (%SI) באמצעות משוואה (5):
      (5)

הכנת מיקרו-חרוזי אלגינט טעוני BSO
איור 1 מייצג את המערך הניסויי להכנת מיקרו-חרוזי אלגינט טעוני BSO. לכמות הלציטין שנוצלה הייתה השפעה ניכרת על יציבות תחליב ה-BSO. תחליבים שיוצרו עם כל שלושת ריכוזי הלציטין היו יציבים יחסית. שיטת הצנטריפוגה (894 × גרם<...

באמצעות תהליך EHDA נוצרו מיקרו-חרוזי אלגינט טעוני BSO כנשא רגיש ל-pH. רשת החרוזים הראתה נפיחות תלוית pH והתנהגות שחרור תרופות עקב הנוכחות השופעת של קבוצות חומצה קרבוקסילית. קשר המימן הבין-מולקולרי החזק בין שרשראות הפולימר התגלה כסיבה מאחורי הירידה באופי הנפיחות של חרוזים טעו...

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

מחקר זה נתמך על ידי חוקרים תומכים בפרויקט מספר (PNURSP2024R30) של אוניברסיטת הנסיכה נורה בינת עבד אל-רחמן, ריאד, ערב הסעודית. מחקר זה מומן על ידי מספר פרויקט תומכי חוקרים (RSPD2024R811), אוניברסיטת המלך סעוד, ריאד, ערב הסעודית.