מילוי צבע DiI ככלי פשוט וזול להדמיית נוירונים חושיים ריסניים ב - C. elegans

מילוי צבע DiI הוא שיטה נפוצה ב- C. elegans כדי לדמיין תת-קבוצה של נוירונים חושיים ריסניים, המאפשרת זיהוי של מוטציות גנטיות המשנות את מבנה או תפקוד הנוירונים התחושתיים.

C. elegans שימש זה מכבר כמודל פשוט ונגיש לחקר המבנה העצבי והתפקודים הרבים של מערכת העצבים. מתוך 302 הנוירונים במערכת העצבים ההרמפרודיטה הבוגרת, 60 מסווגים כנוירונים חושיים ריסניים. נוירונים אלה הם מרכזיים במספר התנהגויות של C. elegans , כולל אך לא רק כימותרפיה, מכניקה ואוסמוסנסינג, הזדווגות זכרים והיווצרות דאואר. מזה כמה עשורים, חברי קהילת C. elegans משתמשים בצבע הליפופילי הפלואורסצנטי האדום DiI כדי לדמיין תת-קבוצה של נוירונים חושיים ריסניים החשופים ישירות לסביבה החיצונית. צבע זה נכנס לקצוות הריסים של הנוירונים ומתפזר בדפוס אחיד יחסית בכל הדנדריטים, גופי התאים והאקסונים. שיטה פשוטה ועוצמתית זו מהווה כלי מצוין לזיהוי מוטציות גנטיות המקנות פגמים מבניים או תפקודיים בנוירונים חושיים ריסניים. כאן, אנו מציגים גרסה יעילה של שיטת הצביעה הזו כדי לדמיין את שמונת זוגות האמפידים ושני זוגות של נוירונים פאסמידיים שנחשפים לסביבה ב-C. elegans. אנו דנים בטיפים לשימוש בשיטה זולה זו להדמיית דפוסי מילוי צבע תאיים בבעלי חיים מורדמים.

Caenorhabditis elegans (C. elegans) קלים למניפולציה, יש להם זמני ייצור מהירים והם זולים לתחזוקה. בשל יתרונות אלה ורבים אחרים, C. elegans שימש כאורגניזם מודל מועדף לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, במיוחד התפתחות ותפקוד מערכת העצבים. גיליון שלם בכתב העת Journal of Neurogenetics הוקדש לאחרונה להשפעות ההיסטוריות של המחקר^בנושא הספציפי הזה. הם מועילים במיוחד לחקר תפקודם של ריסים ראשוניים, המעורבים בחישת תנאים סביבתיים כימיים ופיזיקליים².

להרמפרודיטים בוגרים יש בסך הכל 302 נוירונים, 60 מהם בעלי ריסים ראשוניים בסוף התהליכים הדנדריטיים שלהם³. 60 תאי העצב הריסים הללו מסווגים כנוירונים חושיים ומעורבים בהתנהגויות רבות של C. elegans, כולל אך לא רק כימותרפיה, מכניקה ואוסמוסנסינג, הזדווגות זכרית והיווצרות דאואר ^3,4. ישנן שתי תת-קבוצות של נוירונים חושיים ריסניים החשופים לסביבה החיצונית, הכוללים שישה עשר נוירונים אמפידים (8 זוגות) בראש וארבעה נוירונים פאסמידיים (2 זוגות) בזנב ^3,5.

במשך כמה עשורים, חוקרים בקהילת C. elegans השתמשו בצבעים ליפופיליים, כגון הפלואורסצנט האדום 1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI), כדי לדמיין מספר רקמות שונות בבעלי חיים^חיים 6,7,8,9. כאשר בעלי חיים נחשפים ל-DiI, הצבע מתערבב בקלות ובמהירות לתוך הממברנה של הדנדריטים, האקסונים וגופי התאים של 20 נוירוני האמפיד והפאסמיד החשופים חיצונית בהתפלגות אחידה יחסית. כאשר חיות בר נחשפות ל-DiI, ניתן לדמיין את הצבע בתאי עצב אלה על ידי הדמיה פלואורסצנטית בחלון זמן רחב יחסית. אם יש חריגות מורפולוגיות או תפקודיות בריסים הראשוניים, ייתכן שהצבע לא ימלא כראוי את הנוירונים, ולכן האות עשוי להיראות חלש יותר בחלק מהתאים או בכולם, או להיעדר לחלוטין 6,7,10,11. כל אחת מהתוצאות הללו יכולה להיות אינפורמטיבית של ליקויים מבניים או תפקודיים שעשויים להיות נוכחים בתאי העצב החושיים הריסים של וריאנטים גנטיים.

כתב היד הזה נועד להדגים את הקלות שבה מילוי צבע יכול לשמש ב-C. elegans כדי להמחיש את המבנה של תאי עצב חושיים ריסניים (איור 1). יישמנו את הטכניקה הזו בחיות פראיות ומוטנטיות כדי להדגים כיצד רקעים גנטיים שונים יכולים להראות מגוון תוצאות של מילוי צבע, שלעתים קרובות קשורות לשלמות המבנית או התפקודית של תאי העצב החושיים הריסים שלהם. אנו מראים צביעה לאחר 30 דקות, 24 שעות ו-48 שעות לאחר מילוי הצבע במגוון גילאים שונים של בעלי חיים כדי לסייע בקביעת מהלך הזמן האופטימלי להדמיה חיה. אנו מספקים גם דוגמאות לקשיים שיכולים להתעורר במהלך צביעה והדמיה וטיפים למניעת נקודות בעייתיות אלה. באמצעות שימוש בשיטה זו, חוקרים במוסדות בכל גודל יכולים להתחיל לבנות על הבסיס של ביולוגיה של נוירונים חושיים ריסניים ב - C. elegans. מילוי צבע הוא פשוט וחסכוני מספיק כדי להיות משולב בפעילויות מעבדה עם סטודנטים לתואר ראשון כדי לאפשר להם את ההזדמנות לעבוד עם C. elegans ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מומחיות טכנית קודמת מינימלית. בנוסף, יש שימור משמעותי של גנים המעורבים בביולוגיה ראשונית של ריסים, ובאופן רחב יותר, תפקוד נוירונים חושיים בין בני אדם ל-C. elegans¹². המשך מחקר על תפקודי גנים ריסניים ואינטראקציות גנטיות ב- C. elegans יכול בסופו של דבר לספק תובנה רבה יותר לגבי המורכבות של ריסים אנושיים¹³.

1. הכנת פתרונות

1. הכן את תמיסת האקונומיקה. שלב 2 מ"ל אקונומיקה, 500 מיקרוליטר של 10 מ' NaOH ו-7.5 מ"ל של dH₂O בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   הערה: תמיסת אקונומיקה נשארת יציבה עד שבוע כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכן את מאגר M9. שלבו 3 גרם של KH₂PO₄, 6 גרם של Na₂HPO₄ ו-5 גרם NaCl ב-1 ליטר של מים סטריליים וחיטוי לעיקור. לאחר שהתקרר לחלוטין ל-RT, הוסף 1 מ"ל סטרילי של 1 M MgSO₄.
3. הכן את תמיסת מלאי DiI. הוסף 10 מ"ג DiI ל-5 מ"ל של דימתילפורממיד (DMF) לריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל DiI ב-DMF. DiI רגיש לאור, לכן יש לכסות תמיד את התמיסות בנייר אלומיניום. ניתן לאחסן DiI ב-DMF ב-20 מעלות צלזיוס למשך שנים רבות ואינו דורש הפשרה בין שימושים.
   זהירות: DMF הוא גם דליק וגם מזיק במגע עם העור או בשאיפה. עבדו עם תמיסה זו מתחת למכסה מנוע כימי, הרחק מלהבות פתוחות, ולבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE).

2. בידוד אוכלוסיות מסונכרנות על ידי הכנת אקונומיקה

הערה: אסוף את כל הציוד והפתרונות הדרושים לכל שלבי התהליך לפני ההתחלה. תכשירי אקונומיקה רגישים מאוד לזמן, כך שהחומרים הדרושים לפני תחילת התהליך מבטיחים את הצלחת הפרוטוקול.

1. שטפו בעלי חיים בוגרים ללא רעב מהצלחות באמצעות 1 מ"ל של מאגר M9. אפשר לבעלי החיים להתאסף בקצה אחד של הצלחת על ידי הטיה קלה של הצלחת.
   הערה: בדרך כלל, שאפו לאסוף ~50-100 בעלי חיים בוגרים לא מורעבים לקבלת יבול אמין של ביצים. עם זאת, ניתן לבצע הכנת אקונומיקה כמעט על כל מספר של בעלי חיים בוגרים. מספר בעלי החיים הבוגרים הזמינים לאיסוף יכול להשתנות מאוד בהתאם לרקע הגנטי של בעלי החיים. מספר גדול יותר של בעלי חיים שנאספו מניב בדרך כלל מספר גדול יותר של ביצים.
2. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, אספו והעבירו את בעלי החיים במאגר M9 לצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן בנפח 1.5 מ"ל.
3. צנטריפוגה של בעלי החיים ב -350 גרם למשך 30 שניות. מהירות זו איטית מספיק כדי לאסוף את החיות בתחתית הצינור מבלי לגרום נזק.
4. רוקנים את רוב מאגר ה-M9 העודף, ומשאירים את התולעים שנאספו בתחתית הצינור ללא הפרעה.
5. הוסיפו 1 מ"ל מתמיסת האקונומיקה המוכנה ואפשרו לבעלי החיים לצוף בתמיסה עד שהם מתחילים להתפרק, והפכו את הצינור באופן קבוע כדי לעודד פירוק רקמות. צפו בפירוק הרקמות ושחרור הביציות על ידי בדיקה תקופתית של הצינור תחת מיקרוסקופ מנתח. תהליך זה אורך בדרך כלל בין 5 דקות ל-10 דקות.
6. ברגע שהצינור מכיל בעיקר ביצים משוחררות שנותרו רק כמה רקמות של בעלי חיים גלויים, צנטריפוגה במהירות מקסימלית למיקרו-צנטריפוגה סטנדרטית על השולחן (בדרך כלל בין 15,000-21,000 גרם) למשך 30 שניות כדי לאסוף את הביצים בתחתית.
7. שפכו כמה שיותר מתמיסת האקונומיקה באמצעות פיפטה מזכוכית תוך הקפדה לא להפריע לביצים הגלולות. הוסף 1 מ"ל של מאגר M9 כדי לעצור את פירוק הביצים על ידי תמיסת האקונומיקה שנותרה.
   הערה: שלבים 2.6 ו-2.7 צריכים להתבצע במהירות. עיכובים בצנטריפוגה, הסרת תמיסת אקונומיקה ושטיפה עם מאגר M9 עלולים לגרום לתפוקת ביצים נמוכה עקב השפלה.
8. צנטריפוגה את הצינור שוב ב -21,000 גרם למשך 30 שניות. שפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לביצים הגלולות.
9. שטפו פעמיים נוספות עם 1 מ"ל של מאגר M9, וניקו נוזלים בין כל שטיפה מבלי להפריע לביצים הגלולות.
10. לאחר הכביסה האחרונה, יש לשפוך את רוב מאגר ה-M9, ואז להשהות מחדש את הביצים בנוזל שנותר על ידי הלקשת הצינור או ניעור נמרץ.
11. בעזרת פיפטת זכוכית סטרילית, העבירו טיפה מהתמיסה המכילה את הביצים אל פני צלחת NGM טרייה עם E. coli. שאפו למקם את הטיפה ליד האי קולי ולהוסיף כ -100 ביצים לצלחת. ביציות אלה מסונכרנות בערך בגיל.
    הערה: במקרים בהם תפוקת הביצים גבוהה מספיק כדי שקשה להשיג 100 ביצים לטיפה, ניתן להוסיף מאגר M9 נוסף לצינור המכיל ביצים כדי לדלל את ריכוזן

3. הליך מילוי צבע

1. סמן כמה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל לפי הצורך עבור מספר הזנים הממולאים בצבע. צור כיסויי נייר כסף לכל צינור כדי להגן על תמיסת DiI רגישה לאור, לאחר הוספתו.
2. שטפו בעלי חיים בשלב התפתחותי רצוי מלוחות ה-NGM המסונכרנים עם הגיל באמצעות כ-1 מ"ל של מאגר M9. ודא שכל צלחת מכילה כ-100 בעלי חיים שבקעו מ-100 הביצים המונחות על הצלחת במהלך סנכרון האקונומיקה. אסוף את בעלי החיים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המסומנים כהלכה.
   הערה: מילוי צבע עובד היטב במגוון רחב של שלבי התפתחות. מחקר זה מדגים מילוי צבע בבעלי חיים החל משלב הזחל 3 (L3) ועד לבוגרים (48 שעות לאחר L3).
3. בעלי חיים צנטריפוגה במשקל 350 גרם למשך 30 שניות כדי לאסוף אותם בתחתית הצינור.
4. שפכו את מאגר ה-M9 מבלי להפריע לבעלי החיים שנאספו בתחתית הצינור.
5. שטפו פעמיים נוספות עם 1 מ"ל של מאגר M9, וניקו נוזלים בין כל שטיפה מבלי להפריע לבעלי החיים שנאספו. בסבב הכביסה האחרון, שפכו כדי להשאיר 200 מיקרוליטר של מאגר M9 בצינור.
6. כסו את כל הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני חשיפה לאור והוסיפו 1 מיקרוליטר של DiI ב-DMF ישירות למאגר M9 בכל צינור.
   הערה: אם משנים את הכמויות של מאגר M9 ו-DiI, הקפד לשמור על יחס של 1:200 של DiI במאגר M9.
7. נדנד או נער את כל הצינורות ב-RT למשך שעתיים.
8. צינורות צנטריפוגה במשקל 350 גרם למשך 30 שניות לאיסוף בעלי חיים בתחתית הצינורות.
9. שפכו את הנוזל המכיל את ה-DiI מצינורות המיקרו-צנטריפוגה. יש לשטוף עם מאגר M9 שלוש פעמים, תוך הסרת נוזלים בין כל שטיפה.
10. לאחר הסילוק מהשטיפה הסופית, העבירו בעלי חיים בנפח קטן (~50 מיקרוליטר) של מאגר M9 לצלחות NGM טריות עם E. coli.
11. אפשר לבעלי חיים להתאושש לאחר צביעה על צלחות NGM טריות למשך 30 דקות לפחות. מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום עד לתצפית כדי לשמר את כתם ה- DiI. התבונן בבעלי חיים עד 24 שעות לאחר מילוי הצבע ללא אובדן משמעותי באות הפלואורסצנט. בשעה 48 שעות או אחריה, האות יכול להתחיל לדעוך (ראה איור 2).

4. הדמיית מילוי צבע

1. הכינו אגרוז של 2% בתמיסת מים סטרילית. ממיסים את האגרוז לחלוטין באמצעות מיקרוגל.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר באגרוז (2%) בתמיסת מים מספר פעמים עד שאיבוד מים חוזר מגדיל את ריכוז האגרוז עד לנקודה שבה התמיסה הופכת צמיגה מדי.
2. השג שקופיות זכוכית וכיסויים בגודל 22 מ"מ על 22 מ"מ להכנת רפידות אגרוז. בעזרת פיפטת זכוכית, הניחו טיפה קטנה של האגרוז המותך 2% במים על מגלשת זכוכית אחת והניחו במהירות החלקת כיסוי על גבי טיפת האגרוז. לאחר שכרית האגרוז מתמצקת במלואה, הסר את הכיסוי והשאיר את כרית האגרוז על מגלשת הזכוכית.
   הערה: הימנע מהיווצרות בועות ברפידות אגרוז, מכיוון שהן עלולות לחסום את ההדמיה של בעלי חיים.
3. הוסף 5-10 מיקרוליטר של חומר הרדמה (10 מ"מ לבמיסול) על פני כרית האגרוז. העבירו 5-20 בעלי חיים לחומר ההרדמה, ולאחר מכן הניחו את החלקת הכיסוי בחזרה על גבי כרית האגרוז.
4. התבונן בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, מורכב ו/או קונפוקלי, בהתאם לציוד הזמין ולצורכי הסינון וההדמיה. ל-DiI יש שיא עירור ב-550 ננומטר ושיא פליטה ב-564 ננומטר; לפיכך, צפה בו באמצעות קוביית סינון תואמת טטרמתילרודמין/ציאנין 3/חלבון פלואורסצנטי צהוב (TRITC/Cy3/YFP).
   הערה: הגדרות מיקרוסקופ מתאימות, כגון זמן חשיפה, רווח ועוצמת לייזר, הדרושות להשגת תמונות ברורות של מילוי צבע יכולות להשתנות בין סוגים שונים של מיקרוסקופים וצריכות להיקבע באופן עצמאי על ידי המשתמשים לצרכים הייחודיים שלהם.

תולעי N2 בוגרות שצולמו 24 שעות לאחר מילוי הצבע מדגימות אות פלואורסצנטי ברור שמתפשט באופן שווה יחסית בכל תאי העצב האמפידים (איור 1A,A') ותאי העצב הפאסמידיים (איור 1D,D'). בבעלי חיים אלה ניתן להבחין בקלות בין הה...

מילוי צבע מוצלח מסתמך על שיקול דעת מדוקדק של השלב ההתפתחותי והרקע הגנטי של בעלי החיים, כמו גם הזמן שחלף עד להדמיה. חלק מהמוטציות הגנטיות משבשות את המבנה ו/או התפקוד של תאי העצב החושיים החשופים חיצונית, וכתוצאה מכך בעלי חיים אינם מסוגלים לצבוע כראוי. לכן, מילוי צבע של מוטצי...

למחברים אין מה לחשוף.

ברצוננו להודות לננסי שאו וקמרון בריסבין (אוניברסיטת דרום אורגון). העבודה נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת דרום אורגון עבור M. LaBonty. חלק מהזנים של C. elegans סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של ה-NIH (P40 OD010440).