DiI-Farbstofffüllung als einfaches und kostengünstiges Werkzeug zur Visualisierung von Flimmerneuronen in C. elegans

Die DiI-Farbstofffüllung ist eine Methode, die häufig bei C. elegans verwendet wird, um eine Untergruppe der flimmernden sensorischen Neuronen sichtbar zu machen, was die Identifizierung genetischer Mutationen ermöglicht, die die Struktur oder Funktion der sensorischen Neuronen verändern.

C. elegans wird seit langem als einfaches und zugängliches Modell verwendet, um die neuronale Struktur und die vielen Funktionen des Nervensystems zu untersuchen. Von den 302 Neuronen im adulten hermaphroditischen Nervensystem werden 60 als ciliatisierte sensorische Neuronen klassifiziert. Diese Neuronen sind von zentraler Bedeutung für eine Reihe von Verhaltensweisen von C. elegans , einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chemo-, Mechano- und Osmosensing, männliche Paarung und Dauerbildung. Seit mehreren Jahrzehnten verwenden Mitglieder der C. elegans-Gemeinschaft den rot fluoreszierenden lipophilen Farbstoff DiI, um eine Untergruppe der flimmernden sensorischen Neuronen sichtbar zu machen, die direkt der äußeren Umgebung ausgesetzt sind. Dieser Farbstoff dringt in die Flimmerenden der Neuronen ein und verteilt sich in einem relativ gleichmäßigen Muster über die Dendriten, Zellkörper und Axone. Diese einfache und leistungsstarke Methode ist ein hervorragendes Werkzeug für den ersten Durchgang, um genetische Mutanten zu identifizieren, die strukturelle oder funktionelle Defekte in flimmernden sensorischen Neuronen verursachen. Hier präsentieren wir eine abgespeckte Version dieser Färbemethode, um die acht Paare von amphidischen und zwei Paare von phasmidischen Neuronen zu visualisieren, die in C. elegans umweltexponiert sind. Wir besprechen Tipps für die Verwendung dieser kostengünstigen Methode zur Abbildung zellulärer Farbstofffüllungsmuster bei anästhesierten Tieren.

Caenorhabditis elegans (C. elegans) sind leicht zu manipulieren, haben schnelle Generationszeiten und sind kostengünstig in der Wartung. Aufgrund dieser und vieler anderer Vorteile dienten C. elegans als bevorzugter Modellorganismus für die Untersuchung vieler biologischer Prozesse, insbesondere der Entwicklung und Funktion des Nervensystems. Eine ganze Ausgabe im Journal of Neurogenetics widmete sich kürzlich den historischen Auswirkungen der Forschung zu diesem speziellen Thema¹. Sie sind besonders nützlich für die Untersuchung der Funktion von primären Zilien, die an der Erfassung chemischer und physikalischer Umweltbedingungen beteiligt sind².

Adulte Hermaphroditen C. elegans haben insgesamt 302 Neuronen, von denen 60 primäre Zilien am Ende ihrer dendritischen Fortsätze besitzen³. Diese 60 Flimmerneuronen werden als sensorische Neuronen klassifiziert und sind an vielen Verhaltensweisen von C. elegans beteiligt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chemo-, Mechano- und Osmosensing, männliche Paarung und Dauerbildung ^3,4. Es gibt zwei Untergruppen von ciliatisierten sensorischen Neuronen, die der äußeren Umgebung ausgesetzt sind, darunter sechzehn ampidische Neuronen (8 Paare) im Kopf und vier phasmidische Neuronen (2 Paare) im Schwanz ^3,5.

Seit mehreren Jahrzehnten verwenden Forscher in der C. elegans-Gemeinschaft lipophile Farbstoffe wie das rot fluoreszierende 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI), um eine Reihe verschiedener Gewebe in lebenden Tieren zu visualisieren ^6,7,8,9. Wenn Tiere DiI ausgesetzt sind, interkaliert der Farbstoff leicht und schnell in die Membran der Dendriten, Axone und Zellkörper der 20 extern exponierten Amphiden- und Phasmiden-Neuronen in einer relativ gleichmäßigen Verteilung. Wenn Wildtyp-Tiere DiI ausgesetzt sind, kann der Farbstoff in diesen Neuronen durch Fluoreszenzbildgebung während eines relativ breiten Zeitfensters sichtbar gemacht werden. Wenn es morphologische oder funktionelle Anomalien in den primären Zilien gibt, kann es sein, dass der Farbstoff die Neuronen nicht richtig füllt, und daher kann ein Signal in einigen oder allen Zellen schwächer erscheinen oder vollständig fehlen 6,7,10,11. Jedes dieser Ergebnisse kann Aufschluss über strukturelle oder funktionelle Defizite geben, die in den flimmernden sensorischen Neuronen genetischer Varianten vorhanden sein können.

Dieses Manuskript zielt darauf ab, die Leichtigkeit zu demonstrieren, mit der die Farbstofffüllung bei C. elegans verwendet werden kann, um die Struktur von ciliatisierten sensorischen Neuronen sichtbar zu machen (Abbildung 1). Wir haben diese Technik bei Wildtyp- und mutierten Tieren angewendet, um zu zeigen, wie unterschiedliche genetische Hintergründe eine Vielzahl von Farbstofffüllungsergebnissen aufweisen können, die oft mit der strukturellen oder funktionellen Integrität ihrer zilienartigen sensorischen Neuronen zusammenhängen. Wir zeigen die Färbung nach 30 Minuten, 24 Stunden und 48 Stunden nach dem Färben in einer Vielzahl unterschiedlicher Tieralter, um den optimalen Zeitverlauf für die Live-Bildgebung zu bestimmen. Wir geben auch Beispiele für Schwierigkeiten, die bei der Färbung und Bildgebung auftreten können, und Tipps, um diese Problempunkte zu vermeiden. Durch den Einsatz dieser Methode können Forscher an Institutionen jeder Größe beginnen, auf den Grundlagen der Biologie der flimmernden sensorischen Neuronen in C. elegans aufzubauen. Das Füllen von Farbstoffen ist einfach und kostengünstig genug, um in Laboraktivitäten mit Studenten integriert zu werden, um ihnen die Möglichkeit zu geben, mit minimalem technischen Vorwissen mit C. elegans und Fluoreszenzmikroskopie zu arbeiten. Darüber hinaus gibt es eine signifikante Konservierung von Genen, die an der primären Zilienbiologie und im weiteren Sinne an der sensorischen Neuronenfunktion zwischen Menschen und C. elegans beteiligt sind ¹². Die fortgesetzte Erforschung der ziliären Genfunktionen und genetischen Interaktionen in C. elegans könnte letztlich zu einem besseren Einblick in die Komplexität menschlicher Ziliopathien führen¹³.

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereite die Bleichlösung vor. Kombinieren Sie 2 mL Bleichmittel, 500 μl 10 M NaOH und 7,5 mL dH₂O in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die Bleichlösung bleibt bis zu 1 Woche stabil, wenn sie bei Raumtemperatur (RT) gelagert wird.
2. Bereiten Sie den M9-Puffer vor. 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ und 5 g NaCl in 1 l sterilem Wasser mischen und zum Sterilisieren im Autoklaven vermengen. Nach dem vollständigen Abkühlen auf RT 1 ml steriles 1 M MgSO₄ hinzufügen.
3. Bereiten Sie die DiI-Stammlösung vor. Fügen Sie 10 mg DiI zu 5 ml Dimethylformamid (DMF) hinzu, um eine Endkonzentration von 2 mg/ml DiI in DMF zu erreichen. DiI ist lichtempfindlich, also decken Sie die Lösungen immer mit Alufolie ab. DiI in DMF kann viele Jahre bei -20 °C gelagert werden und muss zwischen den Anwendungen nicht aufgetaut werden.
   ACHTUNG: DMF ist sowohl brennbar als auch gesundheitsschädlich, wenn es mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Arbeiten Sie mit dieser Lösung unter einer chemischen Haube, fern von offenem Feuer und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA).

2. Isolierung synchronisierter Populationen durch Bleichmittelpräparation

HINWEIS: Sammeln Sie alle Geräte und Lösungen, die für alle Schritte des Prozesses erforderlich sind, bevor Sie beginnen. Bleichpräparate sind sehr zeitkritisch, so dass die notwendigen Materialien vor Beginn des Prozesses den Erfolg des Protokolls gewährleisten.

1. Nicht verhungerte, trächtige adulte Tiere mit 1 ml M9-Puffer von den Platten waschen. Lassen Sie die Tiere an einer Kante des Tellers sammeln, indem Sie den Teller leicht kippen.
   HINWEIS: Versuchen Sie in der Regel, ~50-100 nicht verhungerte, trächtige erwachsene Tiere zu sammeln, um einen zuverlässigen Ertrag an Eiern zu erzielen. Die Bleichmittelaufbereitung kann jedoch bei nahezu beliebig vielen trächtigen adulten Tieren durchgeführt werden. Die Anzahl der zur Entnahme verfügbaren trächtigen adulten Tiere kann je nach genetischem Hintergrund der Tiere stark variieren. Eine größere Anzahl von gefangenen Tieren ergibt in der Regel eine größere Anzahl von Eiern.
2. Sammeln Sie die Tiere mit einer Pasteur-Glaspipette und überführen Sie sie mit dem M9-Puffer in ein markiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Die Tiere bei 350 g 30 s zentrifugieren. Diese Geschwindigkeit ist langsam genug, um die lebenden Tiere am Boden der Röhre einzusammeln, ohne Schaden anzurichten.
4. Dekantieren Sie den größten Teil des überschüssigen M9-Puffers, wobei die gesammelten Würmer am Boden des Röhrchens ungestört bleiben.
5. Fügen Sie 1 ml der vorbereiteten Bleichlösung hinzu und lassen Sie die Tiere in der Lösung schwimmen, bis sie zu zerfallen beginnen, wobei Sie das Röhrchen regelmäßig umdrehen, um den Gewebeabbau zu fördern. Betrachten Sie den Gewebeabbau und die Freisetzung von Eizellen, indem Sie das Röhrchen regelmäßig unter einem Präpariermikroskop überprüfen. Dieser Vorgang dauert in der Regel zwischen 5 und 10 Minuten.
6. Sobald das Röhrchen die meisten freigesetzten Eier enthält und nur noch wenige sichtbare tierische Gewebe übrig sind, zentrifugieren Sie mit maximaler Geschwindigkeit für eine Standard-Tischmikrozentrifuge (typischerweise zwischen 15.000 und 21.000 g) für 30 s, um die Eier am Boden zu sammeln.
7. Dekantieren Sie so viel wie möglich von der Bleichlösung mit einer Glaspipette und achten Sie darauf, die pelletierten Eier nicht zu stören. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer hinzu, um den Abbau der Eier durch die restliche Bleichlösung zu stoppen.
   HINWEIS: Die Schritte 2.6 und 2.7 sollten schnell ausgeführt werden. Verzögerungen bei der Zentrifugation, der Entfernung der Bleichlösung und dem Waschen mit M9-Puffer können aufgrund des Abbaus zu geringen Eiausbeuten führen.
8. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 21.000 g für 30 s. Dekantieren Sie den Überstand, ohne die pelletierten Eier zu stören.
9. Waschen Sie noch zweimal mit 1 ml M9-Puffer und füllen Sie die Flüssigkeit zwischen jedem Waschgang um, ohne die pelletierten Eier zu stören.
10. Nach der letzten Wäsche den größten Teil des M9-Puffers dekantieren und dann die Eier in der restlichen Flüssigkeit resuspendieren, indem Sie die Tube schnippen oder kräftig schütteln.
11. Übertragen Sie mit einer sterilen Glaspipette einen Tropfen der Lösung, die die Eier enthält, auf die Oberfläche einer frischen NGM-Platte mit E. coli. Versuchen Sie, den Tropfen neben die E. coli zu legen und etwa 100 Eier pro Teller hinzuzufügen. Diese Eizellen sind im Alter annähernd synchronisiert.
    HINWEIS: In Fällen, in denen die Eiausbeute hoch genug ist, dass es schwierig ist, 100 Eier pro Tropfen zu erhalten, kann dem Röhrchen mit den Eiern zusätzlicher M9-Puffer zugesetzt werden, um deren Konzentration zu verdünnen.

3. Verfahren der Farbfüllung

1. Markieren Sie so viele 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, wie für die Anzahl der zu färbenden Stämme erforderlich sind. Erstellen Sie Folienabdeckungen für jede Tube, um lichtempfindliche DiI-Lösung nach dem Hinzufügen zu schützen.
2. Tiere eines gewünschten Entwicklungsstadiums werden von den alterssynchronisierten NGM-Platten mit etwa 1 ml M9-Puffer gewaschen. Stellen Sie sicher, dass jede Platte etwa 100 Tiere enthält, die aus den 100 Eiern geschlüpft sind, die während der Bleichmittelsynchronisation auf die Platte gelegt wurden. Sammeln Sie die Tiere in den ordnungsgemäß gekennzeichneten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die Farbfüllung funktioniert gut in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien. Diese Studie zeigt die Farbstofffüllung bei Tieren vom Larvenstadium 3 (L3) bis zu Erwachsenen (48 h nach L3).
3. Die Tiere werden 30 s lang bei 350 g zentrifugiert, um sie am Boden des Röhrchens zu sammeln.
4. Dekantieren Sie den M9-Puffer, ohne die am Boden des Röhrchens gesammelten Tiere zu stören.
5. Waschen Sie noch zweimal mit 1 ml M9-Puffer und füllen Sie die Flüssigkeit zwischen jedem Waschgang um, ohne die gesammelten Tiere zu stören. In der letzten Waschrunde dekantieren, so dass 200 μl M9-Puffer im Röhrchen verbleiben.
6. Decken Sie alle Röhrchen zum Schutz vor Lichteinwirkung mit Aluminiumfolie ab und geben Sie 1 μl DiI in DMF direkt in den M9-Puffer in jedem Röhrchen.
   HINWEIS: Wenn Sie die Mengen an M9-Puffer und DiI ändern, stellen Sie sicher, dass ein DiI-Verhältnis von 1:200 im M9-Puffer beibehalten wird.
7. Schütteln oder schütteln Sie alle Röhren bei RT für 2 h.
8. Zentrifugenröhrchen bei 350 g für 30 s, um die Tiere am Boden der Röhrchen zu sammeln.
9. Dekantieren Sie die Flüssigkeit, die das DiI enthält, aus den Mikrozentrifugenröhrchen. Dreimal mit M9-Puffer waschen und zwischen jedem Waschgang die Flüssigkeit dekantieren.
10. Nach dem Dekantieren aus der letzten Wäsche die Tiere in einem kleinen (~50 μl) Volumen M9-Puffer auf frische NGM-Platten mit E. coli übertragen.
11. Lassen Sie die Tiere sich nach dem Färben auf frischen NGM-Platten mindestens 30 Minuten lang erholen. Decken Sie die Platten bis zur Beobachtung mit Alufolie ab, um den DiI-Fleck zu erhalten. Beobachten Sie die Tiere bis zu 24 Stunden nach der Farbfüllung ohne signifikanten Verlust des Fluoreszenzsignals. Bei oder nach 48 h kann das Signal zu verblassen beginnen (siehe Abbildung 2).

4. Bildgebende Farbfüllung

1. Bereiten Sie eine 2%ige Agarose in einer sterilen Wasserlösung vor. Lösen Sie die Agarose in der Mikrowelle vollständig auf.
   HINWEIS: Agarose (2%) in wässriger Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden, bis wiederholter Wasserverlust die Agarosekonzentration bis zu einem Punkt erhöht, an dem die Lösung zu viskos wird.
2. Besorgen Sie sich Objektträger aus Glas und Deckgläser im Format 22 mm x 22 mm, um Agarose-Pads vorzubereiten. Geben Sie mit einer Glaspipette einen kleinen Tropfen der geschmolzenen 2%igen Agarose in Wasser auf einen Objektträger und legen Sie schnell ein Deckglas auf den Agarosetropfen. Sobald das Agarose-Pad vollständig erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas und lassen Sie das Agarose-Pad auf dem Objektträger.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in Agarose-Pads, da diese die Bildgebung von Tieren behindern können.
3. Geben Sie 5-10 μl Anästhetikum (10 mM Levamisol) auf die Oberfläche des Agarose-Pads. Übertragen Sie 5-20 Tiere in die Betäubungsmittel und legen Sie dann den Deckschirm wieder auf das Agarose-Pad.
4. Beobachten Sie Tiere mit einem Stereo-, Verbund- und/oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop, abhängig von der verfügbaren Ausrüstung und den Anforderungen an das Screening und die Bildgebung. DiI hat einen Anregungspeak bei 550 nm und einen Emissionspeak bei 564 nm; Betrachten Sie es daher mit einem Tetramethylrhodamin/Cyanin-Farbstoff 3/gelb fluoreszierendes Protein (TRITC/Cy3/YFP)-kompatiblen Filterwürfel.
   HINWEIS: Geeignete Mikroskopeinstellungen, wie z. B. Belichtungszeit, Verstärkung und Laserleistung, die erforderlich sind, um klare Bilder der Farbstofffüllung zu erhalten, können zwischen verschiedenen Mikroskoptypen variieren und sollten vom Benutzer unabhängig für seine individuellen Bedürfnisse festgelegt werden.

Adulte N2-Würmer, die 24 Stunden nach der Farbstofffüllung abgebildet wurden, zeigen ein klares Fluoreszenzsignal, das relativ gleichmäßig über die amphidischen Neuronen (Abbildung 1A,A') und die Phasmid-Neuronen (Abbildung 1D,D') verteilt ist. Bei diesen Tieren lassen sich die dendritischen Fortsätze und Zellkörper der amphidischen Neuronen gut untersche...

xEine erfolgreiche Farbstofffüllung beruht auf einer sorgfältigen Berücksichtigung des Entwicklungsstadiums und des genetischen Hintergrunds der Tiere sowie der verstrichenen Zeit bis zur Bildgebung. Einige genetische Mutationen stören die Struktur und/oder Funktion der extern exponierten sensorischen Flimmerneuronen, was dazu führt, dass Tiere nicht in der Lage sind, die Füllung richtig zu färben. Daher kann die Farbstofffüllung von neuen C. elegans-Mutanten als einfach...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir bedanken uns bei Nancy Shough und Cameron Brisbine (Southern Oregon University). Die Arbeit wurde durch Startkapital der Southern Oregon University für M. LaBonty unterstützt. Einige C. elegans-Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.