DiI 染料填充作为一种简单且廉价的工具，用于可视化秀丽隐杆线虫中的纤毛感觉神经元

DiI 染料填充是 秀丽隐杆 线虫中常用的一种方法，用于可视化纤毛感觉神经元的子集，从而可以识别改变感觉神经元结构或功能的基因突变。

秀丽隐杆线 虫长期以来一直被用作研究神经元结构和神经系统许多功能的简单易行模型。在成年雌雄同体神经系统内的 302 个神经元中，有 60 个被归类为纤毛感觉神经元。这些神经元是许多 秀丽隐 杆线虫行为的核心，包括但不限于化疗、机械和渗透感应、雄配和 dauer 形成。几十年来， 秀丽隐杆 线虫群落的成员一直使用红色荧光亲脂染料 DiI 来可视化直接暴露于外部环境的纤毛感觉神经元子集。这种染料进入神经元的纤毛末端，并以相对均匀的模式分布在整个树突、细胞体和轴突中。这种简单而强大的方法是识别在纤毛感觉神经元中赋予结构或功能缺陷的遗传突变体的绝佳首过工具。在这里，我们提出了这种染色方法的简化版本，以可视化秀 丽隐杆线虫环境中暴露的八对两栖神经元和两对质粒神经元。我们讨论了使用这种廉价方法对麻醉动物的细胞染料填充模式进行成像的技巧。

秀丽隐 杆线虫 （C. elegans） 易于作，生成时间短，维护成本低。由于这些和许多其他优点， 秀丽隐杆 线虫已成为研究许多生物过程的首选模式生物，尤其是神经系统的发育和功能。最近，《神经遗传学杂志》（Journal of Neurogenetics）有一整期专门讨论研究对这一特定主题的历史影响¹。它们特别有利于研究初级纤毛的功能，初级纤毛参与感知化学和物理环境条件²。

成年雌雄同体秀丽隐杆线虫共有 302 个神经元，其中 60 个在其树突突末端具有初级纤毛³。这 60 个纤毛神经元被归类为感觉神经元，参与许多秀丽隐杆线虫的行为，包括但不限于化疗、机械和渗透感应、雄配和 dauer 形成 ^3,4。暴露于外部环境的纤毛感觉神经元有两个亚群，包括头部的 16 个两栖神经元（8 对）和尾部的 4 个质粒神经元（2 对）^3,5。

几十年来，秀丽隐杆线虫群落的研究人员一直使用亲脂性染料，例如红色荧光 1,1'-二十八烷基-3,3,3'3'-四甲基吲哚羰菁高氯酸盐 （DiI），来观察活体动物体内的许多不同组织 6,7,8,9。当动物暴露于 DiI 时，染料很容易快速地嵌入到外部暴露的 20 个两足和质粒神经元的树突、轴突和细胞体的膜中，分布相对均匀。当野生型动物暴露于 DiI 时，可以在相对较宽的时间窗口内通过荧光成像在这些神经元中可视化染料。如果初级纤毛有任何形态或功能异常，染料可能无法正确填充神经元，因此，信号在部分或全部细胞中可能较弱，或者可能完全不存在 ^6,7,10,11。这些结果中的任何一个都可以说明遗传变异的纤毛感觉神经元中可能存在的结构或功能缺陷。

本手稿旨在证明在秀丽隐杆线虫中轻松使用染料填充来可视化纤毛感觉神经元的结构（图 1）。我们将这项技术应用于野生型和突变型动物，以证明不同的遗传背景如何显示各种染料填充结果，这通常与其纤毛感觉神经元的结构或功能完整性有关。我们在各种不同动物年龄的染料填充后 30 分钟、24 小时和 48 小时显示染色，以帮助确定实时成像的最佳时间进程。我们还提供了染色和成像过程中可能出现的困难示例，以及避免这些问题点的提示。通过使用这种方法，任何规模机构的研究人员都可以开始在秀丽隐杆线虫纤毛感觉神经元生物学的基础上进行构建。染料填充简单且具有成本效益，足以纳入本科生的实验室活动，让他们有机会以最少的技术专业知识使用秀丽隐杆线虫和荧光显微镜。此外，人类和秀丽隐杆线虫之间涉及原代纤毛生物学的基因，更广泛地说，感觉神经元功能也存在显着的保守性 ¹²。对秀丽隐杆线虫纤毛基因功能和遗传相互作用的持续研究最终可以更深入地了解人类纤毛病的复杂性¹³。

1. 溶液的制备

1. 准备漂白剂溶液。将 2 mL 漂白剂、500 μL 10 M NaOH 和 7.5 mL dH₂O 混合在 15 mL 离心管中。
   注：漂白剂溶液在室温 （RT） 下储存时可保持稳定长达 1 周。
2. 准备 M9 缓冲液。将 3 g KH₂PO₄、6 g Na₂HPO₄ 和 5 g NaCl 混合在 1 L 无菌水中，高压灭菌。完全冷却至 RT 后，加入 1 mL 无菌 1 M MgSO₄。
3. 准备 DiI 储备溶液。将 10 mg DiI 添加到 5 mL 二甲基甲酰胺 （DMF） 中，使 DMF 中的终浓度为 2 mg/mL DiI。DiI 对光敏感，因此请始终用铝箔覆盖溶液。DMF 中的 DiI 可以在 -20 °C 下储存多年，并且在两次使用之间不需要解冻。
   注意：DMF 与皮肤接触或吸入时既易燃又有害。在化学罩下使用此解决方案，远离明火，并穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。

2. 通过漂白剂制备分离同步种群

注意：在开始之前，收集该过程所有步骤所需的所有设备和解决方案。漂白剂制备对时间非常敏感，因此在开始该过程之前准备好必要的材料可确保方案成功。

1. 使用 1 mL M9 缓冲液将未饥饿的妊娠成年动物从平板上清洗。通过稍微倾斜板，让动物在板的一侧收集。
   注意：通常，目标是收集 ~50-100 只未饥饿的怀孕成年动物，以获得可靠的鸡蛋产量。然而，漂白剂制备几乎可以对任何数量的怀孕成年动物进行。可供采集的怀孕成年动物的数量可能会因动物的遗传背景而有很大差异。收集的动物数量越多，通常产生的鸡蛋就越多。
2. 使用玻璃巴斯德移液器，收集 M9 缓冲液中的动物并将其转移到标记的 1.5 mL 微量离心管中。
3. 将动物以 350 g 离心 30 秒。这个速度足够慢，可以将活体动物收集在管底而不会造成任何伤害。
4. 倒出大部分过量的 M9 缓冲液，使收集的蠕虫在试管底部不受干扰。
5. 加入 1 mL 准备好的漂白剂溶液，让动物漂浮在溶液中，直到它们开始崩解，定期倒置试管以促进组织分解。通过在解剖显微镜下定期检查试管来观察组织分解和卵的释放。此过程通常需要 5 分钟到 10 分钟。
6. 一旦试管中含有大部分释放的鸡蛋，只剩下少数可见的动物组织，以最大速度离心标准台式微量离心机（通常在 15,000-21,000 g之间）离心 30 秒，以收集底部的鸡蛋。
7. 使用玻璃移液管倒出尽可能多的漂白剂溶液，同时注意不要打扰沉淀的鸡蛋。加入 1 mL M9 缓冲液以阻止鸡蛋被剩余的漂白剂溶液降解。
   注意：步骤 2.6 和 2.7 应快速执行。离心、去除漂白剂溶液和用 M9 缓冲液洗涤的延迟会因降解而导致产蛋率低。
8. 再次以 21,000 g 离心管 30 秒。倒出上清液，不要打扰颗粒状鸡蛋。
9. 用 1 mL M9 缓冲液再洗涤两次，在每次洗涤之间倾析液体，不要干扰沉淀的鸡蛋。
10. 最后一次洗涤后，倒出大部分 M9 缓冲液，然后通过轻弹试管或剧烈摇晃将鸡蛋重悬于剩余的液体中。
11. 使用无菌玻璃移液器，将一滴含有鸡蛋的溶液转移到装有 大肠杆菌的新鲜 NGM 板的表面。目标是将滴剂放在 大肠杆菌 旁边，每盘加入大约 100 个鸡蛋。这些鸡蛋的年龄大致同步。
    注：如果鸡蛋产量足够高，以至于难以每滴获得 100 个鸡蛋，则可以在含有鸡蛋的试管中加入额外的 M9 缓冲液以稀释其浓度。

3. 染料填充程序

1. 根据需要标记尽可能多的 1.5 mL 微量离心管，以填充染料的菌株数量。添加后，为每个试管创建铝箔盖以保护光敏性 DiI 溶液。
2. 使用大约 1 mL 的 M9 缓冲液从年龄同步的 NGM 平板上洗涤所需发育阶段的动物。确保每个板包含大约 100 只动物，这些动物是在漂白同步期间从放置在板上的 100 个鸡蛋中孵化出来的。将动物收集到正确标记的 1.5 mL 微量离心管中。
   注意：染料填充在各种发育阶段都效果很好。本研究证明了从幼虫阶段 3 （L3） 到成虫（L3 后 48 小时）的动物的染料填充。
3. 将动物以 350 g 离心 30 秒，以将它们收集在管底部。
4. 倒出 M9 缓冲液，而不会打扰收集在试管底部的动物。
5. 用 1 mL M9 缓冲液再洗涤两次，在每次洗涤之间倾析液体，而不会干扰收集的动物。在最后一轮洗涤中，倒出以在试管中留下 200 μL 的 M9 缓冲液。
6. 用铝箔覆盖所有试管以防止光照，并将 1 μL DMF 中的 DiI 直接添加到每个试管的 M9 缓冲液中。
   注意：如果更改 M9 缓冲液和 DiI 的量，请确保在 M9 缓冲液中保持 DiI 的 1：200 比例。
7. 在 RT 下摇动或摇动所有试管 2 小时。
8. 以 350 g 离心管 30 秒，以收集管底部的动物。
9. 从微量离心管中倒出含有 DiI 的液体。用 M9 缓冲液洗涤 3 次，每次洗涤之间倾析液体。
10. 从最后一次洗涤中倾析后，将小体积 （~50 μL） M9 缓冲液中的动物转移到含有 大肠杆菌的新鲜 NGM 板中。
11. 在新鲜的 NGM 板上染色至少 30 分钟后，让动物恢复。用铝箔覆盖板直到观察以保留 DiI 染色。染料填充后长达 24 小时观察动物，荧光信号无明显损失。在 48 小时或之后，信号可以开始减弱（参见 图 2）。

4. 染料填充成像

1. 在无菌水溶液中制备 2% 琼脂糖。使用微波炉完全溶解琼脂糖。
   注：水溶液中的琼脂糖 （2%） 可以多次重复使用，直到反复失水使琼脂糖浓度增加至溶液变得太粘稠的程度。
2. 获得载玻片和 22 mm x 22 mm 盖玻片以制备琼脂糖垫。使用玻璃移液管，将一小滴熔融的 2% 琼脂糖水溶液放在一个载玻片上，然后迅速将盖玻片放在琼脂糖滴的顶部。琼脂糖垫完全凝固后，取下盖玻片，将琼脂糖垫留在载玻片上。
   注：避免在琼脂糖垫中形成气泡，因为它们会阻碍动物的成像。
3. 将 5-10 μL 麻醉剂（10 mM 左旋咪唑）添加到琼脂糖垫的表面。将 5-20 只动物转移到麻醉剂中，然后将盖玻片放回琼脂糖垫的顶部。
4. 使用立体、复合和/或共聚焦荧光显微镜观察动物，具体取决于可用的设备以及筛查和成像需求。DiI 在 550 nm 处有一个激发峰，在 564 nm 处有一个发射峰;因此，使用四甲基罗丹明/花青染料 3/黄色荧光蛋白 （TRITC/Cy3/YFP） 兼容的滤光片立方体进行观察。
   注：获得清晰的染料填充图像所需的适当显微镜设置（例如曝光时间、增益和激光功率）可能因不同类型的显微镜而异，应由用户根据其独特需求独立确定。

染料填充后 24 小时成像的成虫 N2 蠕虫显示清晰的荧光信号相对均匀地分布在两栖神经元（图 1A，A'）和质粒神经元（图 1D，D'）。在这些动物中，可以很容易地区分两栖神经元的树突突起和细胞体。树突状投影中没有染料团块，充满染料的神经元的任何部分的荧光信号也没有?...

x成功的染料填充依赖于仔细考虑动物的发育阶段和遗传背景，以及成像前经过的时间。一些基因突变会破坏外部暴露的纤毛感觉神经元的结构和/或功能，导致动物无法正确填充染料。因此，新型 秀丽隐杆线 虫突变体的染料填充可用作感觉神经元结构或功能缺陷的简单首次识别器。然而，该技术的一个局限性是它不能用于确定感觉神经元中存在什么类型的缺陷。?...

作者没有什么可披露的。

我们要感谢 Nancy Shough 和 Cameron Brisbine（南俄勒冈大学）。M. LaBonty 的工作得到了南俄勒冈大学的启动资金的支持。一些 秀丽隐杆 线虫菌株由秀丽隐杆线虫遗传学中心 （CGC） 提供，该中心由 NIH 研究基础设施计划办公室 （P40 OD010440） 资助。