Le dysfonctionnement des mitochondries est associé à de nombreuses maladies, en particulier les troubles neurodégénératifs et métaboliques. Par conséquent, si nous pouvons comprendre comment les mitochondries sont régulées par les lysosomes, cela aide à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode CLEM bicolore pour visualiser le contact des lysosomes mitochondriaux.
La microscopie corrélative à la lumière et électronique est une technique d’imagerie qui combine les avantages de la microscopie optique et de la microscopie électronique. Dans ce protocole, nous maximisons l’avantage de CLEM en utilisant des sondes bicolores pour visualiser le contact des lysosomes mitochondriaux. Il est difficile de distinguer clairement la dégradation des mitochondries dans les lysosomes à l’aide des méthodes traditionnelles d’échantillonnage par microscopie électronique.
Cette étude présente un résultat CLEM à haute résolution qui a clairement montré le domaine effecteur des lysosomes et des mitochondries. La méthode de prise bicolore a été utilisée pour distinguer avec précision les effecteurs mitochondries dans les lysosomes. Nos recherches ont révélé que les mitochondries interagissent avec les lysosomes.
Nos recherches ont révélé que les mitochondries interagissaient avec les lysosomes de différentes manières en réponse à différents stress externes. En étudiant les causes et les régulateurs de ces phénomènes, nous permettrons de mieux comprendre le contrôle de la qualité des mitochondries intracellulaires. Pour commencer, cultivez des cellules HeLa à une densité de un fois 10 à la puissance cinq dans des boîtes de culture en verre de 35 millimètres à fond de grille.
Le lendemain, co-transfectez les cellules à 30 % à 40 % de confluence avec les plasmides à l’aide du réactif de transfection. Après la transfection, traitez les cellules avec du diméthylsulfoxyde ou du U18666A et de la bafilomycine A1 pendant 18 heures. Pour l’imagerie confocale, retirez le milieu de culture et ajoutez immédiatement 250 microlitres de solution fixatrice chaude à 30 à 37 degrés Celsius.
Retirez immédiatement le fixateur. Remplacez-le par 1,5 millilitre de fixateur frais et incubez-le sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les cellules trois fois pendant 10 minutes chacune avec un millilitre de tampon de cacodylate de sodium 0,1 molaire glacé.
Ensuite, ajoutez un millilitre de solution froide de glycine de 20 millimolaires pour tremper l’aldéhyde. Après avoir incubé les cellules sur de la glace pendant 10 minutes, lavez-les trois fois pendant 10 minutes chacune dans un tampon de cacodylate de sodium froid de 0,1 molaire. Ajoutez ensuite 500 microlitres de solution rouge Amplex dans le plat d’échantillon et incubez pendant cinq minutes sur de la glace.
Ensuite, retirez la solution rouge d’Amplex et rincez les cellules trois fois pendant 10 minutes chacune avec un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire. Utilisez un microscope confocal pour imager la zone autour des cellules d’intérêt en mode de balayage de tuiles trois par trois. Capturez à la fois les signaux interférentiels différentiels et les signaux fluorescents pour identifier et enregistrer la grille et les lettres sur la parabole à l’aide d’un objectif 40x.
Imagez les cellules cibles à fort grossissement à l’aide d’un objectif 40x et acquérez une image Z-stack. Après avoir numérisé les cellules colorées en rouge Amplex à l’aide d’un microscope confocal, ajoutez un millilitre de tétroxyde d’osmium réduit à 1 % à quatre degrés Celsius et incubez pendant une heure. Rincez ensuite l’échantillon trois fois pendant 10 minutes chacune avec de l’eau distillée à quatre degrés Celsius.
Déshydrater dans une série d’éthanol gradué pendant 15 minutes, à chaque fois à température ambiante. Mélangez maintenant de l’éthanol avec de la résine époxy dans des rapports de volume de trois à un, un à un et un à trois, en préparant un total de 300 microlitres de chaque mélange. Versez chaque mélange de résine époxy dans le plat et incubez à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, préparez la capsule d’enrobage en la remplissant de résine époxy fraîche. Retournez le tube ou la capsule dans la région d’intérêt et placez-le dans un four à 60 degrés Celsius pendant 48 heures pour polymériser. Plongez ensuite le verre inférieur et le bloc polymère dans de l’azote liquide pour les séparer.
Placez le bloc d’échantillon dans le porte-échantillon de l’ultra-microtome et placez-le dans le bloc de coupe. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la résine en une forme rectangulaire ou trapézoïdale autour de l’objet d’intérêt. Placez le bloc d’échantillon taillé dans le porte-échantillon et ajustez la lame diamantée.
À l’aide d’un ultra-microtome, découpez des sections ultra-minces d’environ 60 à 70 nanomètres des cellules plates intégrées. Rassemblez les sections de série sur une grille de fentes revêtue de formvar avant de les sécher sur une plaque chauffante. Ensuite, colorez les sections avec un colorant de contraste pendant deux minutes et du citrate de plomb pendant une minute.
Placez ensuite la grille dans le porte-échantillon de microscope électronique à transmission, ou MET, pour l’observation. Sur la base de l’image à contraste interférentiel différentiel du microscope optique, identifiez la cellule cible d’intérêt et imagez toute la surface cellulaire à l’aide d’images superposées en mosaïque à un grossissement de 1 700 fois Pour obtenir les images corrélatives de microscopie optique et électronique des cellules HeLa à l’aide d’ImageJ Fiji, démarrez ImageJ Fiji et cliquez sur fichier, nouveau, TrakEM2 blank, et sélectionnez le dossier de stockage pour créer un nouveau projet TrakEM2. Faites glisser et déposez les données brutes de l’image de vignette dans l’espace de travail pour ouvrir le jeu de données d’image de vignette.
Cliquez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez la ligne, montez toutes les images de ce calque et les correspondances de blocs non linéaires élastiques. Cliquez ensuite sur OK pour accepter les valeurs par défaut des paramètres restants. Ensuite, cliquez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez Exporter, puis Créer une image plate pour créer une image assemblée.
Cliquez ensuite sur fichier et enregistrez sous pour enregistrer l’image. Pour redimensionner l’image de fluorescence, ouvrez le logiciel d’agrandissement des photos. Cliquez sur fichier, ouvrez et sélectionnez l’image.
Entrez la largeur et la hauteur. Pour correspondre à la taille de l’image du microscope électronique. Sélectionnez l’algorithme à appliquer dans la méthode de redimensionnement.
Cliquez sur fichier et enregistrez sous pour enregistrer l’image redimensionnée. Ouvrez ImageJ Fiji et glissez-déposez la fluorescence redimensionnée et la micrographie électronique assemblée dans l’espace de travail. Cliquez sur les plugins big data viewer et big warp pour démarrer l’enregistrement.
Cliquez ensuite sur le menu déroulant pour sélectionner l’image de la micrographie à fluorescence comme image animée et l’image de la micrographie électronique comme image cible. À l’aide de fonctions telles que le zoom, la rotation de l’image et le déplacement, comparez les images de fluorescence et de micrographie électronique. Appuyez sur la barre d’espace du clavier pour passer en mode point de repère et appuyez sur le bouton gauche de la souris pour marquer au moins trois points de repère identifiés dans les deux images.
Après avoir marqué tous les points de repère identifiés, allez dans fichier, exportez l’image animée et cliquez sur OK. Une nouvelle fenêtre contextuelle avec l’image de la micrographie à fluorescence transformée apparaîtra. Cliquez sur le fichier et enregistrez-le sous pour enregistrer l’image de la micrographie à fluorescence transformée.
Pour superposer les images CLEM, faites glisser et déposez l’image de micrographie à fluorescence transformée et l’image de micrographie électronique assemblée dans l’espace de travail ImageJ. Cliquez sur l’image, le type et la couleur huit bits. Définir le même type d’image pour les images de fluorescence et de micrographie électronique.
Cliquez sur l’image, la couleur et fusionnez les canaux. Pour combiner les images. Cliquez sur fichier et enregistrez sous pour enregistrer l’image CLEM.
Des mitochondries piégées dans les lysosomes ont été observées dans des cellules traitées à la bafilomycine A1, indiquant une autophagie inhibée et une réduction de la qualité mitochondriale, tandis que les cellules témoins ont montré que les mitochondries interagissaient avec les lysosomes mais n’étaient pas englouties par eux. U18666A cellules traitées ont montré des interactions accrues entre les mitochondries et les lysosomes, certains lysosomes étant engloutis par les mitochondries.
