Eine Dysfunktion der Mitochondrien wird mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht, insbesondere mit neurodegenerativen und metabolischen Erkrankungen. Wenn wir also verstehen können, wie Mitochondrien durch Lysosomen reguliert werden, hilft dies, neue therapeutische Strategien zu entwickeln. In diesem Protokoll haben wir eine zweifarbige CLEM-Methode zur Visualisierung des mitochondrialen Lysosomenkontakts demonstriert.
Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ist ein bildgebendes Verfahren, das die Vorteile der Lichtmikroskopie und der Elektronenmikroskopie vereint. In diesem Protokoll maximieren wir den Vorteil von CLEM mit zweifarbigen Sonden, um den Kontakt mit mitochondrialen Lysosomen sichtbar zu machen. Es ist schwierig, den Abbau von Mitochondrien innerhalb von Lysosomen mit herkömmlichen elektronenmikroskopischen Probenahmemethoden eindeutig zu unterscheiden.
Diese Studie präsentiert ein hochauflösendes CLEM-Ergebnis, das die Effektordomäne von Lysosomen und Mitochondrien deutlich zeigt. Die Dual-Color-Take-Methode wurde verwendet, um Mitochondrien-Effektoren innerhalb der Lysosomen genau zu unterscheiden. Unsere Forschung hat gezeigt, dass die Mitochondrien mit den Lysosomen interagieren.
Unsere Forschung hat gezeigt, dass Mitochondrien auf unterschiedliche Weise mit Lysosomen interagieren, um auf verschiedene äußere Belastungen zu reagieren. Durch die Untersuchung der Ursachen und Regulatoren dieser Phänomene werden wir Einblicke in das Verständnis der intrazellulären mitochondrialen Qualitätskontrolle gewinnen. Kultivieren Sie zunächst HeLa-Zellen mit einer Dichte von eins mal 10 hoch fünf in 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasgitterboden.
Am nächsten Tag werden die Zellen bei 30 % bis 40 % Konfluenz mit Plasmiden unter Verwendung des Transfektionsreagenzes co-transfiziert. Behandeln Sie die Zellen nach der Transfektion 18 Stunden lang mit Dimethylsulfoxid oder U18666A und Bafilomycin A1. Für die konfokale Bildgebung entfernen Sie das Nährmedium und fügen Sie sofort 250 Mikroliter warme Fixierlösung bei 30 bis 37 Grad Celsius hinzu.
Entfernen Sie sofort das Fixiermittel. Ersetzen Sie es durch 1,5 Milliliter frisches Fixiermittel und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Waschen Sie dann die Zellen dreimal für jeweils 10 Minuten mit einem Milliliter eiskaltem 0,1 molaren Natriumcacodylat-Puffer.
Fügen Sie als nächstes einen Milliliter kalte 20-Millimolar-Glycinlösung hinzu, um den Aldehyd zu löschen. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis inkubiert haben, waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten in kaltem 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Geben Sie dann 500 Mikroliter Amplex rote Lösung in die Probenschale und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis.
Entfernen Sie anschließend die rote Amplex-Lösung und spülen Sie die Zellen dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um den Bereich um die interessierenden Zellen im Drei-mal-Drei-Kachelscan-Modus abzubilden. Erfassen Sie sowohl differentielle Interferenzkontrast- als auch Fluoreszenzsignale, um das Raster und die Buchstaben auf der Gitterschüssel mit einem 40-fach-Objektiv zu identifizieren und aufzuzeichnen.
Bilden Sie die Zielzellen bei hoher Vergrößerung mit einem 40-fachen Objektiv ab und nehmen Sie ein Z-Stapel-Bild auf. Nach der Bildgebung der rot gefärbten Amplex-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop fügen Sie einen Milliliter 1 % reduziertes Osmiumtetroxid bei vier Grad Celsius hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang. Spülen Sie die Probe dann dreimal für jeweils 10 Minuten mit destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius.
In einer abgestuften Ethanolserie jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur dehydrieren. Mischen Sie nun Ethanol mit Epoxidharz in Volumenverhältnissen von drei zu eins, eins zu eins und eins zu drei und bereiten Sie insgesamt 300 Mikroliter jeder Mischung vor. Gießen Sie jede Epoxidharzmischung in die Schale und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Bereiten Sie als Nächstes die Einbettkapsel vor, indem Sie sie mit frischem Epoxidharz füllen. Drehen Sie das Röhrchen oder die Kapsel im interessierenden Bereich auf den Kopf und stellen Sie es für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius in einen Ofen, um zu polymerisieren. Tauchen Sie dann das untere Glas und den Polymerblock in flüssigen Stickstoff, um sie zu trennen.
Legen Sie den Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotoms und setzen Sie ihn in den Trimmblock ein. Verwende eine Rasierklinge, um das Harz in eine rechteckige oder trapezförmige Form um das Objekt des Interesses zu trimmen. Legen Sie den beschnittenen Probenblock in den Probenhalter und stellen Sie die Diamanttrennscheibe ein.
Schneiden Sie mit einem Ultramikrotom ultradünne Schnitte von etwa 60 bis 70 Nanometern aus den flachen eingebetteten Zellen. Sammeln Sie die Serienprofile auf einem Formvar-beschichteten Schlitzgitter, bevor Sie sie auf einer Heizplatte trocknen. Anschließend färben Sie die Abschnitte zwei Minuten lang mit Kontrastmittel und eine Minute lang mit Bleicitrat.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie die Linie aus, montieren Sie alle Bilder in dieser Ebene und elastische nichtlineare Blockkorrespondenzen. Klicken Sie dann auf OK, um die Standardwerte für die verbleibenden Parameter zu übernehmen. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste und wählen Sie Exportieren, gefolgt von Flachbild erstellen, um ein zusammengefügtes Bild zu erstellen.
Klicken Sie dann auf Datei und Speichern unter, um das Bild zu speichern. Um die Größe des Fluoreszenzbildes zu ändern, öffnen Sie die Fotovergrößerungssoftware. Klicken Sie auf Datei, öffnen Sie es und wählen Sie das Bild aus.
Geben Sie die Breite und Höhe ein. Zur Anpassung an die Größe des elektronenmikroskopischen Bildes. Wählen Sie den Algorithmus aus, der in der resize-Methode angewendet werden soll.
Klicken Sie dann auf das Dropdown-Menü, um das fluoreszenzmikroskopische Bild als bewegtes Bild und das elektronenmikroskopische Bild als Zielbild auszuwählen. Mit Funktionen wie Zoomen, Drehen und Verschieben des Bildes können Sie die Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischen Bilder vergleichen. Drücken Sie die Leertaste auf der Tastatur, um in den Orientierungsmodus zu wechseln, und drücken Sie die linke Maustaste, um mindestens drei Orientierungspunkte zu markieren, die in beiden Bildern identifiziert wurden.
Nachdem Sie alle identifizierten Orientierungspunkte markiert haben, gehen Sie zu Datei, exportieren Sie das bewegte Bild und klicken Sie auf OK. Ein neues Popup-Fenster mit dem transformierten Fluoreszenzmikroskopbild wird angezeigt. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um das transformierte fluoreszenzmikroskopische Bild zu speichern.
Klicken Sie auf Bild, Farbe und Kanäle zusammenführen. Um die Bilder zu kombinieren. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um das CLEM-Bild zu speichern.
Mitochondrien, die in Lysosomen gefangen waren, wurden in mit Bafilomycin A1 behandelten Zellen beobachtet, was auf eine gehemmte Autophagie und eine Verringerung der mitochondrialen Qualität hinweist, während Kontrollzellen Mitochondrien zeigten, die mit Lysosomen interagierten, aber nicht von ihnen verschlungen wurden, zeigte die in Kontrollzellen beobachtete mitochondriale Störung, dass Mitochondrien Lysosomen umgaben, anstatt von ihnen verschlungen zu werden. U18666A-behandelte Zellen zeigten erhöhte Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen, wobei einige Lysosomen von Mitochondrien verschlungen wurden.
