Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

线粒体功能障碍与许多疾病有关，尤其是神经退行性和代谢性疾病。因此，如果我们能够了解溶酶体如何调节线粒体，它有助于开发新的治疗策略。在该协议中，我们展示了一种双色 CLEM 方法来可视化线粒体溶酶体接触。

光电联用显微镜是一种结合了光学显微镜和电子显微镜优点的成像技术。在该协议中，我们使用双色探针来可视化线粒体溶酶体接触，从而最大限度地发挥 CLEM 的优势。使用传统的电子显微镜采样方法清楚地区分溶酶体内的线粒体降解是具有挑战性的。

本研究提供了高分辨率的 CLEM 结果，清楚地显示了溶酶体和线粒体的效应结构域。采用双色取法准确区分溶酶体内的线粒体效应子。我们的研究揭示了线粒体与溶酶体相互作用。

我们的研究表明，线粒体在响应不同的外部压力时以不同的方式与溶酶体相互作用。通过研究这些现象的原因和调节因子，我们将深入了解了解细胞内线粒体质量控制。首先，在 35 毫米玻璃网格底培养皿中以 1 倍 10 到 5 的幂密度培养 HeLa 细胞。

第二天，使用转染试剂将细胞与 30% 至 40% 汇合的细胞与质粒共转染。转染后，用二甲基亚砜或 U18666A 和巴弗洛霉素 A1 处理细胞 18 小时。对于共聚焦成像，去除培养基并立即加入 250 微升 30 至 37 摄氏度的温固定液。

立即去除固定剂。用 1.5 毫升新鲜固定剂替换，并在冰上孵育 30 分钟。然后用 1 毫升冰冷的 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。

接下来，加入 1 毫升冷的 20 毫摩尔甘氨酸溶液以淬灭醛。将细胞在冰上孵育 10 分钟后，在冷的 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液中洗涤 3 次，每次 10 分钟。然后向样品皿中加入 500 μL Amplex red 溶液，并在冰上孵育 5 分钟。

然后，去除 Amplex 红色溶液，用 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液冲洗细胞 3 次，每次 10 分钟。使用共聚焦显微镜以 3 x 3 平铺扫描模式对感兴趣细胞周围的区域进行成像。捕获微分干涉、对比和荧光信号，以识别并使用 40 倍物镜记录网格天线上的网格和字母。

使用 40 倍物镜以高放大倍率对目标细胞进行成像，并获取 Z 堆栈图像。使用共聚焦显微镜对 Amplex 红染细胞进行成像后，在 4 摄氏度下加入 1 毫升 1% 还原的四氧化锇，并孵育 1 小时。然后用 4 摄氏度的蒸馏水冲洗样品 3 次，每次 10 分钟。

在分级乙醇系列中脱水，每次在室温下脱水 15 分钟。现在将乙醇与环氧树脂以 3 比 1、1 比 1 和 1 比 3 的体积比混合，每种混合物总共制备 300 微升。将每种环氧树脂混合物倒入培养皿中，在室温下孵育 1 小时。

接下来，用新鲜的环氧树脂填充包埋胶囊，以制备包埋胶囊。将试管或胶囊在感兴趣区域倒置，并将其放入 60 摄氏度的烘箱中 48 小时以聚合。然后将底部玻璃杯和聚合物块浸入液氮中以分离它们。

将标本块放入超薄切片机的样品架中，并将其置于修整块中。使用剃须刀片将树脂修剪成目标对象周围的矩形或梯形。将修剪过的标本块放入样品架中，并调整金刚石刀片。

使用超薄切片机，从扁平包埋的细胞中切割大约 60 至 70 纳米的超薄切片。将序列切片收集在 formvar 涂层的槽网格上，然后在热板上干燥。然后，用造影剂染色切片 2 分钟，柠檬酸铅染色 1 分钟。

然后将网格放入透射电子显微镜 （TEM） 样品架中进行观察。基于来自光学显微镜的微分干涉对比图像，识别感兴趣的目标细胞，并使用放大倍率为 1， 700 倍的平铺重叠图像对整个细胞区域进行成像要使用 ImageJ Fiji 获得 HeLa 细胞的相关光学和电子显微镜图像，启动 ImageJ Fiji 并单击文件，新的，TrakEM2 空白， 并选择 storage folder 以创建新的 TrakEM2 工程。将原始瓦片图像数据拖放到工作区中，以打开瓦片图像数据集。

单击鼠标右键并选择线条、蒙太奇此图层中的所有图像和弹性非线性块对应关系。然后单击 okay （确定） 接受其余参数的默认值。接下来，单击鼠标右键并选择 导出，然后选择 制作平面图像 创建拼接图像。

然后点击 文件 并 另存为 保存图像。要调整荧光图像的大小，请打开照片放大软件。单击文件，打开并选择图像。

输入宽度和高度。匹配电子显微镜图像的大小。选择要在 resize 方法中应用的算法。

单击文件并另存为以保存调整大小后的图像。打开 ImageJ Fiji，然后将调整大小的荧光和拼接的电子显微照片拖放到工作区中。单击插件 big data viewer 和 big warp 开始注册。

然后单击下拉菜单，选择荧光显微照片图像作为移动图像，选择电子显微照片图像作为目标图像。使用缩放、图像旋转和移动等功能，比较荧光和电子显微照片图像。按键盘上的空格键切换到路标模式，然后按鼠标左键标记两个图像中标识的至少三个路标。

标记完所有已识别的地标后，转到 文件， 导出运动图像，然后单击 好.将出现一个新的弹出窗口，其中包含转换后的荧光显微照片图像。单击文件并另存为以保存转换后的荧光显微照片图像。

要叠加 CLEM 图像，请将转换后的荧光显微照片图像和拼接的电子显微照片图像拖放到 ImageJ 工作区中。单击图像、类型和八位颜色。为荧光和电子显微照片图像设置相同的图像类型。

单击图像、颜色和合并通道。合并图像。单击文件并另存为以保存 CLEM 映像。

在巴弗洛霉素 A1 处理的细胞中观察到被困在溶酶体内的线粒体，表明自噬受到抑制和线粒体质量降低，而对照细胞显示线粒体与溶酶体相互作用但未被溶酶体吞噬，在对照细胞中观察到的线粒体破坏表明线粒体包围溶酶体而不是被它们吞噬。U18666A处理的细胞显示线粒体和溶酶体之间的相互作用增加，一些溶酶体被线粒体吞噬。