L’objectif global de cet article, est de normaliser le protocole pour l’isolement, la caractérisation et la différenciation des cellules souches cardiaques, CSCs du coeur adulte de souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés, dans le domaine des maladies cardiovasculaires et de la thérapie régionale comme la thérapie par cellules souches cardiaques et l’insuffisance cardiaque. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rentable, avec une aide élevée en petite période de temps.
Commencez cette expérience en préparant tous les matériaux, instruments et tampons d’isolement nécessaires dans un état stérilisé tel que décrit dans le protocole. Après avoir enlevé la peau de l’abdomen d’une souris euthanasiée, couper la cage thoracique à l’intérieur de la hotte stérile pour ouvrir la cavité thoracique. Exposez le cœur, puis retirez le sang près du cœur à l’aide d’une seringue d’un millilitre.
Pour enlever tout sang près du cœur, lavez les environs avec du PBS glacé. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces à épiler pour disséquer le cœur, placez-le dans une boîte petri de 100 millimètres contenant 10 millilitres de PBS glacé. Utilisez des forceps de tige incurvés pour palpiter le cœur, et enlever le sang résiduel à l’intérieur du cœur.
Transférer quatre à cinq cœurs isolés dans une boîte de Pétri de 100 millilitres contenant 10 millilitres de solution de sel équilibré de Ham glacé. Palpez à nouveau les cœurs pour les laver et enlever tout sang résiduel à l’intérieur du cœur. Pour assurer l’ablation complète du sang, modifiez la solution HBSS après chaque lavage.
Tenez chaque cœur avec une paire de forceps et utilisez une lame chirurgicale pour couper chaque cœur en morceaux de deux à quatre millimètres dans une boîte petri de 100 millimètres, contenant de cinq à sept millilitres de HBSS. Modifiez fréquemment la solution pour assurer une prise de sang complète. Enfin, hacher les cœurs dans la solution HBSS.
Centrifugeuse les cœurs hachés placés dans un tube conique de 50 millilitres à 500 fois G, à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant. Ajouter cinq à six millilitres, 0,2%Collagène II solution à la pastille pour digérer le tissu. Suspendez soigneusement la pastille en berçant le tube sur un shaker à 75 fois G, à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes.
Toutes les 20 à 30 minutes, secouez vigoureusement le tube à la main pour améliorer la lyse. Triturer le mélange de tissus lysés à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et d’une pointe de pipette d’un millilitre pour dissocier le morceau de tissu dans la suspension à cellule unique. Pour arrêter la lyse enzymatique du tissu, ajoutez deux à trois fois plus de support d’entretien csc disponible dans le commerce que le volume du tissu lysé.
Passez la suspension cellulaire digérée à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres placée sur un tube conique de 50 millilitres pour enlever les morceaux de tissu non digérés. Pour séparer les cellules de la centrifugation du gradient de densité, ajoutez 37 degrés Celsius, une solution de diatrizoate de polysucrose et de sodium préchauffée à un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite doucement et lentement un volume égal de filtrate sur la solution, en évitant tout mélange des deux solutions.
Il est essentiel d’ajouter du filtrate sur la solution de diatrizoate de polysucrose et de sodium lentement sans se mélanger en inclinant le tube à 45 degrés et contre la paroi du tube. N’ajoutez pas de solution de diatrizoate de polysucrose et de sodium sur filtrate. Placez le tube très lentement dans une centrifugeuse swing bucket en vous assurant de ne pas perturber les solutions.
Centrifugeuse à 500 fois G pendant 20 minutes à température ambiante réglée à une vitesse d’accélération et de décélération plus faible pour éviter de mélanger les deux solutions, et pour une séparation adéquate des cellules souches cardiaques. Il est essentiel de mettre la solution de gradient très soigneusement sans perturbation dans la centrifugeuse. Mettez l’accélération et la décélération de la centrifugeuse doit être à la vitesse la plus basse, comme un ou zéro.
Utilisez une pipette d’un millimètre pour transférer la couche chamois contenant les CSC avec une solution supplémentaire de la couche supérieure à un tube stérilisé de 15 millilitres. Ajoutez un volume égal de milieu d’entretien csc et mélangez-le correctement pour neutraliser la solution résiduelle de polysucrose et de diatrizoate de sodium. Centrifuger cette suspension à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Jeter le surnatant. Répétez le lavage des CSC avec une solution DMEM incomplète au moins deux fois. Centrifugeuse à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour se débarrasser de toute solution résiduelle de polysucrose et de diatrizoate de sodium.
Après avoir enlevé le supernatant, resuspendez la pastille contenant des CSC purifiés dans un milieu d’entretien csc millilitre, puis comptez les cellules. Ensemencer les CSC dans une plaque de culture de six puits recouverte d’une solution gélatineuse à 0,02 % contenant 0,5 % de fibronectine, et ajouter deux millilitres de milieu d’entretien complet. Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius en 5% de CO2.
Lorsque la culture csc atteint la confluence, transférer les cellules à une nouvelle gélatine et fibronectine plaque enduite comme décrit dans le protocole texte. Culture ces CSC transférés P0 dans le milieu complet d’entretien csc à 37 degrés Celsius dans un incubateur de CO2 de 5% jusqu’à confluent. Répétez le transfert cellulaire dans une nouvelle plaque pour fabriquer des CSC P1 qui peuvent être utilisés pour d’autres expériences.
Pour maintenir la culture du SCC à son stade initial, ensemencer davantage les cellules telles que décrites dans le protocole textuel. Pour caractériser les cellules de culture, placez le CSC contenant de la plaque sur l’objectif d’un microscope fluorescent. Utilisez dix fois le grossissement pour concentrer les cellules.
Pour observer les cellules, utilisez l’ouverture de contraste de phase, et augmentez le grossissement à 20 fois en changeant l’objectif, puis l’image des CSC. Après avoir effectué l’immunostaining, placez la plaque de culture sous le microscope de fluorescence. Concentrez les cellules à différents grossissements, et observez les cellules sous le contraste de phase et différents filtres d’excitation, et enregistrez les images.
Pour la différenciation cellulaire, faire pousser les CSC dans une plaque de six puits avec deux millilitres de 37 degrés Celsius, milieu d’entretien préchauffé csc. Lorsque les cellules atteignent 80 à 95% confluent, remplacer le milieu d’entretien par deux millilitres, 37 degrés Celsius, cardiomyocytes préchauffés milieu de différenciation. Incuber à 37 degrés Celsius, dans un 5%CO2 pour un jusqu’à deux à trois semaines.
Modifiez le support de différenciation tous les deux à trois jours. Pendant le changement moyen, observez la morphologie cellulaire au microscope pour assurer les bonnes conditions de culture. Après 12 jours, imagez les cellules pour des marqueurs de différenciation suivant un protocole immunostaining standard.
Deux à trois jours de CSC cultivés montrent une morphologie en forme de fuseau lorsqu’ils sont observés au microscope à contraste de phase. Après sept jours de culture, ils montrent un changement de morphologie qui s’allonge. Après immunostaining pour des marqueurs de pluripotency, les CSCs montrent des expressions d’OCT4, SOX2, et Nanog.
En outre, les CSC prolifèrent dans le milieu culturel, et expriment le marqueur de prolifération Ki67. Pour caractériser l’origine cardiaque des CSC, l’expression des marqueurs cardiaques a été examinée, et les cellules se sont montrées positives pour les marqueurs cardiaques Sca-1, NKX2.5, et GATA4. Après culturisation dans le milieu de différenciation de cardiomyocyte pendant 12 jours, les CSCs différenciés montrent l’expression des marqueurs de cardiomyocyte ACTININ, et TROPONIN-I.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas permettre le mélange de la solution de gradient et le filtrate. Il est également important de régler l’accélération et la décélération à la vitesse la plus basse. Celui qui les contamine, il est recommandé d’effectuer tout processus d’isolement cellulaire à l’intérieur d’une armoire de biosécurité.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme la séparation à base de perles magnétiques ou les méthodes de tri des cellules cytométiques à flux peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions telles que, dans quelle mesure la population homogène de cellules souches cardiaques est-elle claire? Le rayon de fissure dans une cellule souche cardiaque est de grands marqueurs, et il y a des différences vers des cardiomyocytes. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies cardiovasculaires qui produisent souvent à haut rendement des cellules souches cardiaques du cœur de souris, ce qui pourrait être important pour la thérapie régénérative en insuffisance cardiaque ischémique.
N’oubliez pas que le travail avec la lame chirurgicale, l’eau de Javel et le DMSO peut être dangereux, et des précautions telles que l’utilisation d’équipements de protection du personnel, PPE, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
