الهدف العام من هذه المادة، هو توحيد بروتوكول لعزل، وتوصيف، والتمايز من الخلايا الجذعية القلبية، CSCs من القلب ماوس الكبار. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية، في مجال أمراض القلب والأوعية الدموية والعلاج الإقليمي مثل، العلاج بالخلايا الجذعية القلبية وفشل القلب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها فعالة من حيث التكلفة ، مع ارتفاع المعونة في فترة صغيرة من الزمن.
ابدأ هذه التجربة من خلال إعداد جميع المواد والأدوات الضرورية ومخازن العزل في حالة معقمة كما هو موضح في البروتوكول. بعد إزالة الجلد من البطن من الماوس القتل الرحيم، وقطع القفص الصدري داخل غطاء محرك السيارة المعقم لفتح تجويف الصدر. كشف القلب ثم إزالة الدم بالقرب من القلب باستخدام حقنة ملليلتر واحد.
لإزالة أي دم بالقرب من القلب، اغسل المنطقة المحيطة بـ PBS البارد. باستخدام مقص جراحي وملاقط لتشريح القلب، وضعه في طبق بيتري 100 ملليمتر يحتوي على 10 ملليلترات الجليد الباردة PBS. استخدام ملقط ساق منحنية لخفقان القلب، وإزالة الدم المتبقي داخل القلب.
نقل أربعة إلى خمسة قلوب معزولة إلى طبق بيتري 100 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من الجليد الباردة حل الملح المتوازن لحم الخنزير. خفقت القلوب مرة أخرى لغسلها وإزالة أي الدم المتبقي داخل القلب. لضمان الإزالة الكاملة للدم، قم بتغيير حل HBSS بعد كل غسل.
عقد كل قلب مع زوج من ملقط واستخدام شفرة الجراحية لقطع كل قلب إلى قطعتين إلى أربعة ملليمترات في طبق بيتري 100 ملليمتر، تحتوي على خمسة إلى سبعة ملليلتر من HBSS. تغيير حل في كثير من الأحيان لضمان إزالة الدم الكامل. وأخيراً، اِنّكِ القلب في حلّ HBSS.
الطرد المركزي قلوب مفروم وضعت في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في 500 مرة G، في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ومن ثم التخلص من افرا. إضافة خمسة إلى ستة ملليلتر، 0.2٪ كولاجيناز الثاني حل إلى بيليه لهضم الأنسجة. إعادة تعليق بيليه بدقة عن طريق هزاز الأنبوب على شاكر في 75 مرات G، في 37 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة.
كل 20 إلى 30 دقيقة ، صافح الأنبوب بقوة باليد لتعزيز التحلل. قم بتكفير مزيج الأنسجة المتحللة باستخدام خمسة ملليلترات ماصة سيرولوجية ، وطرف ماص ملليلتر واحد لفك كتلة الأنسجة في تعليق الخلية المفردة. لوقف الانزيمية من الأنسجة، إضافة مرتين إلى ثلاثة أضعاف ما هو متاح تجارياً صيانة CSC المتوسطة مثل حجم الأنسجة lysed.
تمرير تعليق الخلية المهضمة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وضعت على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لإزالة أي قطع الأنسجة غير مهضومة. لفصل الخلايا إلى الطارد المركزي للتدرج الكثافة، إضافة 37 درجة مئوية، قبل الدافئة، البولي السكروز والصوديوم محلول دياتريوسات إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ثم بلطف وببطء إضافة حجم متساو من الترشيح على الحل، وتجنب أي خلط من الحلين.
من الأهمية بمكان إضافة سترات على محلول البولي السكروز والصوديوم diatrizoate ببطء دون خلط عن طريق إمالة الأنبوب عند 45 درجة وضد جدار الأنبوب. لا تضيف محلول البولي السكروز والصوديوم دياتراتزات على الترشيح. ضع الأنبوب ببطء شديد في جهاز طرد مركزي دلو سوينغ التأكد من عدم إزعاج الحلول.
أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تعيين في سرعة تسارع وتباطؤ أقل لتجنب خلط الحلين، وللفصل السليم للخلايا الجذعية القلبية. ومن الأهمية بمكان وضع حل التدرج بعناية فائقة دون حدوث اضطراب في أجهزة الطرد المركزي. وضع تسارع وتباطؤ جهاز الطرد المركزي يجب أن يكون في أدنى سرعة، مثل واحد أو صفر.
استخدام ماصة ملليمتر واحد لنقل معطف بافي تحتوي على CSCs جنبا إلى جنب مع حل إضافي من الطبقة العليا إلى أنبوب 15 ملليلتر تعقيم. إضافة حجم متساو من وسيط الصيانة CSC، ومزجها بشكل صحيح لتحييد محلول الصوديوم وdiatrizoate المتبقية. الطرد المركزي هذا التعليق في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
تجاهل المُندفع. كرر غسل CSCs مع حل DMEM غير مكتملة على الأقل مرتين. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية للتخلص من أي محلول ثنائي السكروز والصوديوم.
بعد إزالة فائقة، resuspend بيليه تحتوي على CSCs المنقى في متوسط صيانة CSC ملليلتر واحد، ومن ثم عد الخلايا. بذور CSCs في لوحة ثقافة ستة جيدا المغلفة مع حل الجيلاتين 0.02٪ تحتوي على 0.5٪ فيبرومينكتين، وإضافة ملليلتر اثنين من متوسط الصيانة الكاملة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تصل ثقافة CSC إلى التقاء، قم بنقل الخلايا إلى لوحة جديدة مغلفة بالجيلاتين والليفي كما هو موضح في بروتوكول النص. ثقافة هذا نقل [ب 0] [كس] في كاملة [سيّ] صيانة وسط في 37 درجات مئويّة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون حاضنة حتّى التقاء. كرر نقل الخلية إلى لوحة جديدة لجعل P1 CSCs التي يمكن استخدامها لإجراء مزيد من التجارب.
للحفاظ على ثقافة CSC في مرحلته الأولى، بذور الخلايا أبعد كما هو موضح في بروتوكول النص. لتوصيف الخلايا المستزرعة، ضع CSC تحتوي على لوحة على الهدف من المجهر الفلورسنت. استخدام التكبير عشر مرات لتركيز الخلايا.
لمراقبة الخلايا، استخدم فتحة التباين الطورية، وقم بزيادة التكبير إلى 20 مرة عن طريق تغيير العدسة الموضوعية، ثم قم بـصورة CSCs. بعد إجراء المثبطة للمناعة، ضع لوحة الثقافة تحت مجهر الفلوريسانس. تركيز الخلايا في التكبير مختلفة، ومراقبة الخلايا تحت النقيض من المرحلة ومرشحات الإثارة المختلفة، وحفظ الصور.
لتمايز الخلية، تنمو CSCs في لوحة ستة جيدا مع ملليلتر اثنين من 37 درجة مئوية، قبل الدافئة CSC صيانة المتوسطة. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 95٪ التقاء، استبدال وسط الصيانة مع ملليلتر اثنين، 37 درجة مئوية، قبل تدفئة cardiomyocytes التمايز المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية، في CO2 5٪ لمدة تصل إلى أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.
تغيير التمايز المتوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. أثناء التغيير المتوسط، لاحظ مورفولوجيا الخلية تحت المجهر لضمان ظروف الثقافة الجيدة. بعد 12 يوما، صورة الخلايا لعلامات التمايز بعد بروتوكول مناعة القياسية.
تظهر مراكز الدراسات الصحية المُزَرَمة يومين إلى ثلاثة أيام مورفولوجيا على شكل مغزل عندما تُلاحظ تحت مجهر على النقيض من المرحلة. بعد سبعة أيام من الثقافة ، فإنها تظهر تغييرا في مورفولوجيا تصبح ممدود. بعد المناعة لعلامات متعددة القدرات، تظهر CSCs تعبيرات OCT4 و SOX2 و Nanog.
وعلاوة على ذلك، تنتشر مراكز تنسيقية الاستدامة في الوسط الثقافي، وتعبر عن مؤشر الانتشار Ki67. لتوصيف أصل القلب من CSCs، تم فحص التعبير عن علامات القلب، وأظهرت الخلايا أن تكون إيجابية لعلامات القلب سكا-1، NKX2.5، وGATA4. بعد زراعة في cardiomyocyte التمايز المتوسطة لمدة 12 يوما، وCSCS متباينة تظهر التعبير عن علامات cardiomyocyte ACTININ، وTROPONIN-I.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن لا تسمح خلط حل التدرج ولتر. ومن المهم أيضا تعيين التسارع والتباطؤ في أدنى سرعة. من يلوثها، فمن المستحسن تنفيذ جميع عملية عزل الخلايا داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الفصل المغناطيسي القائم على الخرز أو تدفق طرق فرز الخلايا الخلوية القائمة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل، ما مدى وضوح السكان المتجانسين للخلايا الجذعية القلبية؟ نصف قطر الكراك في الخلايا الجذعية القلبية هي علامات كبيرة، وهناك اختلافات حول خلايا القلب. بعد أن تطور، وهذه التقنية تمهد الطريق للباحثين في مجال أمراض القلب والأوعية الدموية الذين غالبا ما تكون عالية العائد من الخلايا الجذعية القلبية من قلب الماوس التي يمكن أن تكون مهمة للعلاج التجديدي في قصور القلب الإقفي.
لا ننسى أن العمل مع شفرة جراحية، التبييض وDMSO يمكن أن تكون خطرة، والاحتياطات مثل استخدام معدات حماية الأفراد، معدات الوقاية الشخصية، ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
