Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Ojo (NEI), el fondo R01 EY029751-04 del Instituto Nacional del Ojo (NEI). Nos gustaría agradecer a la Dra. Sylvia B. Smith, ya que este protocolo fue una versión modificada basada en su protocolo de aislamiento celular de Müller.

Todos los experimentos con animales se ajustaron a la declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y se realizaron siguiendo nuestro protocolo animal aprobado por el Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y las políticas de la Universidad de Oakland (número de protocolo 2022-1160)
1. Preparación de medios y soluciones
<ol><li>Prepare la solución oftálmica de células de Müller complementando el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, detalles en la tabla de materiales) con penicilina/estreptomicina en la dilución 1:1000. Por ejemplo, para 10 ml de DMEM, agregue 10 μl de penicilina/estreptomicina. NOTA: Este es un medio simple sin suero preparado. Además, caliente el medio completo en un baño de agua a 37 °C antes de utilizarlo para el trabajo de cultivo celular.</li>
	<li>Prepare medios completos de crecimiento de células primarias de Müller complementando DMEM con un 10% de suero fetal bovino (FBS, inactivado por calor) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Por ejemplo (500 mL de medio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Prepare una solución de tripsina-EDTA al 0,05% con colagenasa IV a una concentración de 200 U/mL (la tripsina-EDTA se utiliza para disolver la cantidad calculada de polvo de colagenasa IV para alcanzar la concentración necesaria).</li>
</ol>2. Enucleación
<ol><li>Sacrificar éticamente al ratón mediante la inhalación de CO2 siguiendo las directrices de la IACUC.<ol><li>Brevemente, coloque el (los) animal (s) en la cámara de CO2 para introducir 100% de CO2 a una tasa de llenado del 30-70% de la cámara vol / min con CO2 para lograr el objetivo de inconsciencia rápida dentro de 2-3 min con un sufrimiento mínimo para los ratones.</li>
		<li>Dado que los ratones están en una edad temprana (~ 10 días), realice la dislocación cervical como método secundario para garantizar una eutanasia adecuada.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%, coloque el mouse en una almohadilla inferior estéril.</li>
	<li>Extraiga los ojos colocando los brazos de las pinzas en la parte posterior del ojo, tirando suavemente del área orbital y enucleando los ojos aplicando presión con pinzas estilo 5/45 en el área orbital para causar proptosis. NOTA: Esterilice las herramientas de disección con etanol al 70% seguido de solución salina tampón de fosfato antes de la disección.</li>
	<li>Asegúrese de que el nervio óptico siga conectado al ojo enucleando el ojo lentamente. Asegúrese de tirar del nervio óptico (identificado visualmente como un cordón blanco) detrás del ojo. NOTA: Este paso no necesita realizarse bajo un microscopio y se puede realizar en un banco esterilizado.</li>
</ol>3. Tratamiento de los ojos enucleados
<ol><li>Cubra un tubo de centrífuga de 15 ml con papel de aluminio y llene el tubo con 10 ml de la solución ocular de células de Müller.</li>
	<li>Coloque los ojos disecados en el tubo de 15 ml que contiene la solución ocular de células de Müller y déjelos reposar toda la noche, o aproximadamente 18 horas, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 18 h, decantar la solución ocular y enjuagar brevemente los ojos con 2-3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) tibia (37 °C).</li>
	<li>Decantar el PBS y mover los ojos a una placa de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de solución de tripsina. (preparado en el paso 1.3). NOTA: La tripsina se utiliza en todo el ojo enucleado, actuando como un agente disociativo para facilitar la separación celular de las capas de la retina durante la disección. La retina disecada tiene muchas células, incluidas las células EPR, que son pegajosas y tienen más probabilidades de contaminar el cultivo de células de Müller14. El examen microscópico demostró claramente que después de 5 días de aislamiento (durante el primer cambio de medio), las células del EPR se desprendieron de la placa y murieron13. El medio utilizado para el aislamiento del EPR es DMEM/F-12, con una composición diferente al DMEM (utilizado en el aislamiento de células de Müller), que contiene piruvato de sodio y glucosa baja.</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora e incube durante 1,5 a 2 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Después de la incubación, transfiera los ojos a una placa de Petri de 60 mm que contenga aproximadamente 5 ml de medio de crecimiento de células primarias de Müller completas.</li>
</ol>4. Disección
NOTA: Este procedimiento debe llevarse a cabo dentro del ambiente estéril de la campana de cultivo. Por lo tanto, es esencial esterilizar a fondo las superficies de la campana con alcohol al 70%, junto con todas las herramientas y el microscopio de disección. Vale la pena señalar que el video se grabó fuera del capó para una mejor visibilidad y una demostración más clara.
<ol><li>Coloque un pequeño trozo de tejido esterilizado de laboratorio en el plato para ayudar a estabilizar los ojos durante la disección. Coloque los ojos bajo un microscopio de disección para comenzar la disección. NOTA: El uso de tejido de grado de laboratorio facilita las maniobras de los ojos en un plato lleno de líquido (medio completo), lo que garantiza una disección precisa.</li>
	<li>Use tijeras Vannas y pinzas estilo M5S para extirpar el tejido conectivo, los músculos extraoculares y el nervio óptico.<ol><li>Agarre el ojo con pinzas estilo M5S y haga una incisión en la sección de ora serrata con unas tijeras Vannas o una aguja de jeringa. NOTA: Hay una línea circular de color azul claro entre la parte anterior y posterior del ojo llamada ora serrata, que se puede usar como punto de referencia para una dirección precisa durante la disección.</li>
		<li>Sujete la incisión con pinzas estilo M5S y tire o desgarre la córnea de la parte posterior del ojo. Tire en pequeños incrementos para garantizar que la integridad de la retina permanezca intacta. NOTA: Estos pasos consisten en extirpar la parte anterior del ojo (córnea, iris y cristalino) de la parte posterior de la copa del ojo (retinas neurales y pigmentadas).</li>
		<li>Para mantener la integridad de las capas de la retina, tire suavemente y retire el epitelio pigmentado de la retina neural. La retina neural debe estar libre de manchas negras para garantizar la pureza del aislamiento tanto como sea posible, ya que la capa de EPR suele ser pegajosa y adherida a la retina neuronal.</li>
		<li>Corta la retina neural diseccionada en trozos pequeños antes de recogerla en una placa para asegurar una distribución homogénea de las células en la placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque las retinas neurales en un matraz T25 que contenga 4 ml de medio de crecimiento primario completo de células de Müller.</li>
	<li>Por último, coloque el matraz en una incubadora e incube a 37 °C y 5% deCO2.</li>
</ol>5. Cultivo de células gliales primarias de Müller
<ol><li>No mueva el matraz durante 3-5 días para promover el crecimiento celular.</li>
	<li>Cambie el medio después del quinto día y cada dos días a partir de entonces hasta que las células estén confluentes en un 90%.</li>
</ol>6. Pasaje de células gliales primarias de Müller
<ol><li>Aspire el medio de cultivo celular de Müller, seguido de 2 mL de lavado en PBS, y aspire fuera el PBS. Agregue 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (1x), o lo suficiente para cubrir la placa.</li>
	<li>Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Asegúrese de que las células se separen de la placa bajo el microscopio. A continuación, recoja la suspensión celular y añada 4 ml de medios de crecimiento de células primarias de Müller precalentados (37 °C) (preparados en el paso 1.2) al tubo de recogida.</li>
	<li>Centrífuga durante 7 min a 300 x g. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de crecimiento de células primarias de Müller completo. Debido a que el número de células puede variar según la cantidad de ojos disecados, por lo tanto, es mejor contar las células antes de la siembra y la incubación. La densidad de siembra recomendada es de 3,0 x 106 celdas en un matraz T75. NOTA: Las celdas se pueden pasar hasta 4-5 veces. Sin embargo, los resultados más consistentes del experimento se encuentran después de 1-2 pasajes.</li>
</ol>7. Inmunofluorescencia
NOTA: Utilice el protocolo de inmunofluorescencia para teñir y validar la especificidad de las células de Müller. A continuación, se ofrece una breve descripción del protocolo de inmunofluorescencia. Este paso se realiza después del primer paso12.
<ol><li>Siembre las células en un portaobjetos de cámara de cultivo celular (30.000 células por pocillo para un portaobjetos de cámara de 8 pocillos).</li>
	<li>Cultivar las células aisladas durante 24-48 h en un medio de cultivo celular Müller completo (preparado en el paso 1.2) a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire el medio y lave el portaobjetos de la cámara con 250-300 μL de 1x PBS en cada pocillo cuando las celdas tengan un 80-90% de confluente.</li>
	<li>Fije el portaobjetos durante 10 a 15 minutos en 250-300 μL de paraformaldehído al 4% en cada pocillo, seguido de un lavado con PBS/TX-100 (5 min cada uno/3x).</li>
	<li>Añadir tampón de bloqueo durante 1 h a 37 °C (ver tabla de materiales).</li>
	<li>Aspire la solución de bloqueo, luego agregue los anticuerpos primarios específicos para las células de Müller para confirmar la pureza de las células aisladas usando glutamina sintetasa y vimentina 5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando una concentración de anticuerpos de 1:100-1:200 en tampón de bloqueo en un volumen de 150-200 μL/portaobjetos). Lave el portaobjetos con lavados PBS/TX-100 (5 y 10 min cada uno). NOTA: Se eligieron estos anticuerpos porque son características distintivas para identificar las células de Müller y garantizar el éxito y la pureza del cultivo de células de Müller.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo secundario (con una concentración de anticuerpos que oscila entre 1:1000 en tampón de bloqueo en un portaobjetos de 150-200 μL) e incubar durante 1 h a 37 °C. A continuación, lavar con PBS/Triton X-100, tres veces (5-10 min cada una).</li>
	<li>Aplique una gota de medio de montaje DAPI para etiquetar los núcleos antes de cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos. Evite las burbujas de aire al colocar el cubreobjetos.</li>
	<li>Use un microscopio fluorescente para revisar el portaobjetos y capturar imágenes (ver Tabla de Materiales). NOTA: Las celdas se ubican con DAPI a ex/em 359/461 con un aumento de 10x para ubicar las celdas; Un aumento mayor puede capturar células. Otras longitudes de onda dependerían del color elegido. Color verde (GFP)- ex/em 488/510. Color rojo (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar que sean relevantes para el contenido de este artículo.

El aislamiento del epitelio pigmentado primario de la retina (EPR) de ratones fue documentado previamente por nuestro laboratorio. Este manuscrito describe un protocolo de demostración detallado para el aislamiento primario de células de Müller. Este procedimiento implica la enucleación, el tratamiento, la disección, la recolección, la siembra, el cultivo y la caracterización de células de Müller aisladas de ojos de ratón. Se basa en un protocolo exitoso que se encontró en publicaciones anteriores y en nuestro...

Las células de Müller (MC) son las principales y más abundantes células gliales que se encuentran en el tejido de la retina. Son los actores clave en el suministro de integridad estructural y funciones metabólicas dentro de la retina1. La estructura estratégica de los MC se extiende por todo el grosor de la retina, proporcionando así soporte a la retina. Además de sus propiedades de andamio, tienen funciones metabólicas para las neuronas de la retina, suministrándoles sustratos energéticos, como la glucosa y el lactato. Estas funciones son cruciales para mantener una función neuronal saludable. Se ha descrito que el deterioro de las MC contribuye a diversas enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética y el glaucoma 2,3. Las MC pueden ser fuentes celulares endógenas para la terapia regenerativa en la retina1. También comprenden una porción significativa de la retina, y una fuerte evidencia sugiere que en varias especies, estas células pueden ser estimuladas para reemplazar lasneuronas faltantes. Colaboran de manera beneficiosa con las neuronas, y los extremos de las células de Müller que se ramifican cónicamente desenvainan densamente los vasos sanguíneos y conectan los componentes neuronales de la retina. Con el fin de mantener el desarrollo neuronal y la plasticidad neuronal, las células de Müller actúan como un sustrato blando para las neuronas, protegiéndolas de los traumatismosmecánicos. Además, en circunstancias patológicas, las células de Müller pueden diferenciarse en progenitores neurales o células madre que replican o regeneran los fotorreceptores y neuronas perdidos 2,3,4. Las células de Müller conservan las características de las células madre de la retina, incluyendo diferentes niveles de potencial de autorrenovación y diferenciación 5,6. La célula glial de Müller tiene un linaje retiniano significativo que produce factores neurotróficos, absorbe y recicla neurotransmisores, amortigua espacialmente los iones y mantiene la barrera hematorretiniana para mantener la retina en homeostasis 7,8,9. Esto pone de manifiesto el potencial de las células de Müller como una herramienta prometedora en las terapias basadas en células para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina. Las células de Müller son la glía principal distribuida por toda la retina, conectándose tanto con las neuronas como con los vasos sanguíneos. Desempeñan un papel protector crucial, proporcionando un soporte estructural y metabólico esencial para mantener la viabilidad y la estabilidad de las células de la retina. Desafortunadamente, se encuentran muy pocos protocolos en la literatura para el aislamiento primario de células de Müller de la retina10,11.
Presentamos un enfoque mejorado para aislar y cultivar de forma fiable células primarias de Müller de ratón. Este protocolo se utilizó en nuestro grupo para aislar células de Müller de ratones salvajes C57BL/6 y ratones transgénicos12,13. Para este protocolo se utilizan ratones de entre 5 y 11 días de edad, sin preferencia de sexo. Las celdas han sido pasadas hasta 4 veces; sin embargo, en P4 dejan de adherirse al matraz y se hace difícil cultivar un cultivo saludable. El cultivo a menudo está contaminado con células epiteliales pigmentadas de la retina (EPR), por lo que las células deben pasar al menos una vez antes de realizar cualquier experimento adicional en la línea celular. El paso permite un mayor aislamiento de los contaminantes. Por lo tanto, el protocolo presentado ofrece una forma rápida y eficaz de aislar células de Müller de ratón, que luego pueden utilizarse como una plataforma fiable para investigar dianas terapéuticas y evaluar posibles tratamientos para las enfermedades de la retina14.

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media to grow M&amp;uuml;ller cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>For complete Muller cell culture media</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>For complete M&amp;uuml;ller cell culture media</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23&quot; X 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

La principal célula de soporte de la retina es la célula glial de Müller de la retina. Cubren toda la superficie de la retina y están muy cerca tanto de los vasos sanguíneos de la retina como de las neuronas de la retina. Debido a su crecimiento, las células de Müller realizan varias tareas cruciales en una retina sana, incluida la absorción y el reciclaje de neurotransmisores, compuestos de ácido retinoico e iones (como el potasio K+). Además de regular el flujo sanguíneo y mantener la barrera hematorretiniana, también regulan el metabolismo y el suministro de nutrientes a la retina. En este manuscrito se presenta un procedimiento establecido para aislar células primarias de ratón Müller. Para comprender mejor los procesos moleculares subyacentes implicados en los diversos modelos de ratón de trastornos oculares, el aislamiento celular de Müller es un enfoque excelente. Este manuscrito describe un procedimiento detallado para el aislamiento de células de Müller de ratones. Desde la enucleación hasta la siembra, todo el proceso dura unas pocas horas. Durante 5-7 días después de la siembra, no se debe cambiar el medio para permitir que las células aisladas crezcan sin obstáculos. La caracterización celular mediante morfología y distintos marcadores inmunofluorescentes es la siguiente en el proceso. Los pasos máximos para las celdas son de 3 a 4 veces.

Validación de la especificidad, pureza y función de barrera de células Müller aisladas Para confirmar la viabilidad, la morfología y las cualidades distintivas de las células de Müller aisladas, las células se examinaron bajo un microscopio óptico. Se registraron las imágenes P0 y P1 (Figura 1A). Para comprobar la contaminación de las células de Müller aisladas con células EPR y confirmar su pureza, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) utiliz...

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.2K vistas.  Oakland University. Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Video: Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Investigación

Bioingeniería

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biología

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Biología del Desarrollo

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neurociencias

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Caracterización y dinámica morfológica del EPR murino primario cultivado

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor destacado: Aislamiento eficiente de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina de ratones adultos para la investigación de la retinopatía

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Resumen

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Capítulos en este video

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto