Este protocolo es significativo porque las células lin-negativas y las células SK aisladas de los mismos ratones donantes no tuvieron diferencias aparentes en la generación de LMA inducida por MLL-AF9. Además, la inyección IP de células leucémicas puede desarrollar con éxito un modelo de ratón de AML. En comparación con los métodos de trasplante convencionales, esta técnica es más conveniente y menos costosa.
Para comenzar, esterilice el ratón hembra CD45.1 C57BL / 6J de 8 a 10 semanas de edad con 70% de etanol. Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica estéril en una tabla de espuma de poliestireno y fije las patas a través de las almohadillas de las patas del ratón. Corte la piel por encima de la cavidad abdominal en la línea media y amplíe el espacio subcutáneo hacia las patas traseras con tijeras estériles afiladas.
Extienda la incisión desde la línea media abdominal hasta los tobillos y amplíe el espacio subcutáneo debajo de las patas traseras con las hojas de tijeras afiladas. Corte el tendón de Aquiles con tijeras afiladas. Sostenga el tendón con fórceps con dientes y corte el otro extremo unido al fémur para extraer el músculo gastrocnemio.
Corte el tendón del cuádriceps unido a la rodilla con tijeras afiladas. Sostenga el tendón y corte la cabeza muscular unida al fémur para extirpar el músculo gastrocnemio. Corte los otros músculos que rodean el fémur en el extremo unido a la tibia.
A continuación, corte el tobillo con tijeras afiladas, asegurándose de que la tibia permanezca intacta. Sostenga el extremo distal del fémur y corte la articulación de la cadera con tijeras de punta afilada, asegurando que la cabeza femoral permanezca intacta. Transfiera las tibias y los fémures a un tampón de flujo en un tubo de 15 mililitros.
Separe la tibia y el fémur rompiendo la rodilla con la mano. Retire la rótula, el cartílago y los cóndilos femorales para exponer la meseta tibial y el fémur distal. Retire los músculos con una gasa estéril y remoje los huesos en un tampón de flujo.
Corte el cuello femoral y enjuague las células de la médula ósea con tampón de flujo desde ambos extremos del fémur con una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 23. A continuación, corte el maléolo tibial y enjuague las células de la médula ósea con amortiguador de flujo desde ambos extremos de la tibia. Dispersar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo usando una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18.
Centrifugar la suspensión unicelular a cuatro grados centígrados y 400 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cinco mililitros de glóbulos rojos, o RBC, tampón de lisis para lisar los glóbulos rojos durante tres minutos. Agregue cinco mililitros de tampón de flujo para detener la lisis.
Luego centrifugar la suspensión celular y resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón de flujo. Coloque un filtro de células de 70 micras en un tubo de 50 mililitros y pase la suspensión a través del filtro para recoger las células. Ajuste la concentración de la celda con tampón de flujo a una vez de 10 a ocho por mililitro en tubos de polipropileno de fondo redondo.
Seleccione células de linaje negativo utilizando un kit de aislamiento de células hematopoyéticas de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez hecho esto, centrifugar las células madre hematopoyéticas clasificadas y las células negativas de linaje no clasificadas y resuspender en tres mililitros de 2X de citoquinas, medios IMDM y tres mililitros de sobrenadante viral en un plato recubierto retrorreductor. Incubar el plato en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 6 o 24 horas.
Después de la transducción, cosechar las células por centrifugación. Si es necesario, use tripsina para recolectar las células adheridas al fondo del plato. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en PBS precalentado.
Inyecte células en el ratón receptor primario retroorbital o intraperitonealmente con una media aguja de calibre 27. Monitoree el mouse diariamente. Después de un mes, recolectar sangre semanalmente por sangrado retroorbitario para controlar la leucocitosis mediante la evaluación del hemograma completo en un HEMAVET.
Propólta el ojo con el pulgar y el índice, luego penetre el plexo sinusal venoso con un tubo capilar de hematocrito estéril a través del canto interno. Recoja de 20 a 25 microlitros de sangre en un tubo de recolección de sangre EDTA y cierre los párpados para detener el sangrado. Aplique una gota de solución oftálmica de sulfato de gentamicina en el ojo.
Cuando los glóbulos blancos alcancen cuatro veces 10 a cuatro células por microlitro, aísle las células de la médula ósea enjuagando los fémures y las tibias con tampón de flujo, seguido de lisis de glóbulos rojos como se describió anteriormente. Luego, para cosechar los esplenocitos, coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica estéril en una tabla de espuma de poliestireno y fije las patas a través de las almohadillas de las patas del ratón. Esterilizar el ratón con etanol al 70%.
Corte la piel y el músculo en la línea media para exponer la cavidad abdominal con tijeras estériles de punta afilada. Aísle el bazo y colóquelo en un tampón de flujo en un tubo de 15 mililitros. Engranar el bazo a través de un colador de 70 micras en un plato de seis centímetros con tres mililitros de tampón de flujo.
Transfiera las células del plato a un tubo de 15 mililitros, luego centrifugue la suspensión de una sola celda, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de lisis RBC durante tres minutos. Agregue cinco mililitros de tampón de flujo para detener la lisis y centrifugar la suspensión celular. Resuspenda el pellet en cinco mililitros de tampón de flujo, mezcle y pase a través de un filtro de células de 70 micras para recoger las células en un tubo de 50 mililitros.
Identificar las células primarias de leucemia mieloide aguda, o LMA, tiñendo los esplenocitos y las células de la médula ósea con el anticuerpo anti-ratón CD45.1 conjugado FITC y detectando en un citómetro de flujo. Las células se bloquean primero en FSC-A FSC-H y FSC-A SSC-A para adquirir singletes. La población CD45.1 positiva se cierra en la gráfica FL1 comparándola con células no teñidas.
Para el trasplante secundario, resuspender las células esplénicas de LMA CD45.1 de receptores retroorbitarios primarios en PBS e inyectarlas retroorbitalmente en ratones machos CD45.2. La presencia de leucocitosis aberrante y el aumento de la infiltración de células leucémicas en la médula ósea y el bazo apoyan la viabilidad de utilizar células negativas para el linaje de la médula ósea para generar LMA primaria. No se observaron diferencias significativas en los receptores primarios traducidos con LSK o células negativas para linaje.
Las células de LMA se diseminan en la cavidad abdominal de los receptores primarios mediante leucemia de linaje mixto o células de linaje negativo transducidas MLL-AF9. Estos resultados también confirmaron el establecimiento de LMA primaria mediante inyección intraperitoneal de células negativas de linaje de médula ósea transducidas MLL-AF9 en forma de leucocitosis y la presencia de células de LMA en la médula ósea y el bazo de ratones receptores. Sin embargo, el trasplante primario mediante inyección intraperitoneal tardó más en desarrollar LMA que mediante inyección retroorbitaria a pesar del mismo número de células del donante.
Los receptores secundarios mostraron leucocitosis y hepatoesplenomegalia significativa en menos de un mes después del trasplante. Las células de AML también se detectaron en la sangre periférica, la médula ósea y el bazo, así como en la cavidad peritoneal. La inyección intraperitoneal de ocho veces 10 a las cinco células de LMA logró un injerto comparable a la inyección retroorbitaria de ocho veces 10 a las cinco LMA.
Los ratones receptores terciarios exhibieron agudamente signos de LMA que incluyen leucocitosis y hepatoesplenomegalia, la presencia de células leucémicas en la sangre, la médula ósea y el bazo, la observación histológica del fémur y el bazo demostraron aún más la infiltración de células leucémicas. En comparación con los trasplantes secundarios y terciarios, el trasplante terciario progresó mucho más rápido que el trasplante secundario. Para el modelo actual, no es necesario ordenar las celdas LSK.
Las células lin-negativas se pueden transducir con el virus de la AML durante 6 horas o 24 horas. No afectará la eficiencia del establecimiento del modelo.
