El músculo esquelético sirve como un importante reservorio de nitrato que, después de su conversión en nitrito, sirve como fuente de NO durante el ejercicio. Aquí presentamos la metodología para medir estos iones en el músculo y otros tejidos. Para comenzar, prepare la solución de preservación o parada de nitrato combinando ferricianuro de potasio de 890 milimolares y n-metilmaleimida de 118 milimolares en agua destilada, asegurándose de que no queden cristales en solución, luego agregue un surfactante no iónico en una proporción de 1 a 9 y mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
Diluya la solución de parada en una proporción de 1 a 9 con agua destilada y agregue la solución de parada diluida al tubo de homogeneización. A continuación, descongele el tejido muscular de rata aislado y congelado anterior en hielo. Una vez que el tejido se haya descongelado, retire la grasa restante y el tejido conectivo del músculo esquelético.
Corte pedazos del músculo esquelético y séquelos en una gasa para que se sequen. Pese la cantidad adecuada de tejido muscular esquelético, luego coloque el tejido de prepeso en los tubos de homogeneización que contienen la solución de parada. Para la homogeneización en un homogeneizador rotativo, coloque el tubo tipo M que contiene el músculo esquelético previamente pesado y la solución de parada premedida en la máquina.
Homogeneice cada muestra dos veces, y después de cada homogeneización, coloque el tubo en hielo inmediatamente durante 5 minutos para que se enfríe. Después de la homogeneización, centrifugar el tubo brevemente. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo y agregue el volumen apropiado de metanol antes de vomitear durante 15 segundos.
Homogeneizar la muestra de nuevo e incubarla en hielo durante 30 minutos, luego centrifugar la muestra, aspirar el sobrenadante y proceder a medir los niveles de nitrito y nitrato. Para la homogeneización de cuentas, coloque el tejido muscular esquelético en un tubo que contenga cuentas y homogeneice dos veces durante 45 segundos a la velocidad más alta disponible en el instrumento. Después de cada homogeneización, coloque inmediatamente el tubo sobre hielo durante 5 minutos para que se enfríe, luego centrifugue el tubo, vuelva a colocar el tubo sobre hielo y agregue el volumen apropiado de metanol antes de vomitear durante 15 segundos.
Homogeneice la muestra una vez más durante 45 segundos y luego incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugar la muestra, aspirar el sobrenadante y proceder a medir los niveles de nitrito y nitrato. Para la homogeneización basada en pulverizador, prepare tubos que contengan la solución de parada diluida, luego pese y registre el peso de los tubos.
Después de enfriar la herramienta pulverizadora en hielo seco durante 30 minutos, usando pinzas enfriadas en nitrógeno líquido, transfiera la muestra de tejido previamente pesada al pulverizador, luego agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para asegurarse de que el tejido esté a temperatura de nitrógeno líquido. Después de que el 95% del nitrógeno líquido se haya vaporizado, coloque la herramienta de trituración sobre el tejido y presione firmemente para sentir el aplastamiento de la muestra, luego usando un mazo, golpee la herramienta de trituración de 3 a 5 veces. Cuando toda la muestra haya sido pulverizada, utilizando una cuchara líquida enfriada con nitrógeno y pinzas, transfiera directamente el tejido triturado al tubo previamente pesado que contiene la solución de parada diluida.
A continuación, haga un vórtice en el tubo durante 15 segundos, luego abra el tubo para verificar si hay tejido atascado en la tapa. Si lo hay, trate de desalojarlo, luego vuelva a vorágerse. Centrifugar brevemente la muestra durante 2 a 3 segundos.
Pese el tubo de nuevo y calcule el peso del tejido deduciendo el peso original del tubo de este nuevo peso. Coloque el tubo sobre hielo. Agregue un volumen apropiado de metanol al tubo y vórtice el tubo a fondo durante 15 segundos antes de incubarlo en hielo durante 30 minutos, luego centrifugar la muestra, aspirar el sobrenadante y proceder a medir los niveles de nitrito y nitrato.
Los niveles de nitrato y los homogeneizados del músculo esquelético de rata preparados con un homogeneizador rotatorio, homogeneizador de perlas y pulverizador fueron similares. Curiosamente, para los niveles de nitrito, la muestra homogeneizada preparada por un pulverizador mostró el valor más alto, que fue estadísticamente diferente de los otros dos valores de muestra. Una comparación de los niveles de nitrito y nitrato en homogeneizados de glúteos preparados a partir de 20, 50 y 200 miligramos de tejido utilizando un homogeneizador de perlas mostró que ni los niveles de nitrato ni de nitrito eran significativamente diferentes entre los tamaños de muestra muscular.
La comparación de los niveles de nitrato en diferentes tejidos del músculo esquelético de las patas de roedores reveló que el músculo glúteo tenía niveles de nitrato aproximadamente dos veces más altos que los otros tres tejidos musculares. Sin embargo, estas diferencias no alcanzaron significación estadística. Similar a los niveles de nitrato, la concentración de nitrato en el músculo glúteo también fue mayor que en los otros tres tejidos musculares y fue significativamente mayor que en la muestra de gastrocnemio.
Nuestro método es relativamente simple y adecuado para muestras pequeñas, preservando el nitrato y el nitrito durante la preparación de la muestra.
