Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Ojo (R01 EY12998) para FH Andrade.

1. Preparación de tampones <ol><li> Encienda 5804R centrífuga y se puso a 4 ° C. A su vez en baño de agua Isotemp 3006D y se puso a 37 º C. </li><li> Prepare las siguientes soluciones antes de que el aislamiento del músculo: <ul><li> PBS: Disolver tampón fosfato salino (PBS) tabletas en agua destilada (5 comprimidos / litro). Mezclar bien. </li><li> PBS más 10 mM EDTA: Para preparar una solución de 100 ml, añadir 2 ml de 500 mM EDTA y 98 ml de PBS. </li><li> Buffer 8X mitocondrias: 10,28 g de sacarosa, para una concentración final de 0,6 M, 400 mg de ácidos grasos libres de albúmina sérica bovina (BSA) para una concentración final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para una concentración final de 160 mM, pH a 7.4 y QS de 50 ml con agua destilada. </li><li> Buffer de aislamiento 1 (IB1): Añadir 200 l de 500 mM EDTA para una concentración final de 10 mM, 0,392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mM, 1,25 ml de buffer 8X mitocondrias pH, a 7.4 y QS a 10 ml con agua destilada. </li><li> Buffer aislamiento 2 (IB2): Añadir 60 l de EGTA 500 mM para una concentración final de 3 mm, 0.392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mM, 1,25 ml de buffer 8X mitocondrias pH, a 7.4 y QS a 10 ml con agua destilada. </li><li> Buffer experimental (EB): añadir 100 ml de 500 mM de MgCl 2 para una concentración final de 5 mM, 0,392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mm, 25 l de 2,5 mM KH 2 PO 4 para una concentración final de 6,25 M, 2 l de 100 mM EGTA, para una concentración final de 20 mM, 1,25 ml de solución tampón mitocondrial, el pH a 7.4 y QS de 10 ml con agua destilada. </li></ul></li></ol> 2. Aislamiento de los músculos <ol><li> En un cubo de hielo, poner tres vasos de 10 ml, Potter-Elvehjem molinos tejidos y todo lo necesario de otros instrumentos / suministros en el hielo. Todo debe estar helado durante todo el experimento. </li><li> Lugar IB1 y IB2 en un cubo de hielo y EB en el baño de agua caliente cuando haya terminado. </li><li> En los tres vasos de 10 ml, las soluciones se debe agregar: <ul><li> Matraz de 1: 10 ml de PBS </li><li> Vaso 2: 10 ml de PBS / EDTA </li><li> Vaso de 3: 3 ml de IB1 </li></ul></li><li> Matar a una rata humana, aprobado por el local de Atención de Animales institucional y el empleo. </li><li> Aislar rápidamente 250-500 mg de músculo esquelético, enjuague en el vaso 1, entonces la transferencia de vaso 2. </li></ol> 3. Homogeneización / aislamiento mitocondrial <ol><li> Transferencia de músculo para vaso 3 y finamente picada el músculo con la tijera. </li><li> Transferir la solución a la homogeneizador Potter-Elvehjem. Homogeneizar el músculo con un mortero de motor (un taladro puede hacer el trabajo) 10 veces manteniendo el tubo en hielo en todo momento. </li><li> Transferencia de homogeneizado de pre-enfriado tubos de microcentrífuga de 2 ml y centrifugar a 700 g durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado. Deseche pellet. </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 10.500 g durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y SN1 etiqueta (número sobrenadante 1) y el tipo de músculo. </li><li> Vuelva a suspender el pellet en 500 l de IB2. </li><li> Centrifugar a 10.500 g durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y SN2 etiqueta (número sobrenadante 2) y el tipo de músculo. </li><li> Suspender el precipitado final mitocondrial en 100 l de IB2. </li><li> Volver a girar la suspensión definitiva mitocondrial en minifuge durante unos segundos. Si hay una bolita, la transferencia de sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y desechar el sedimento. </li><li> Determinar la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford 8. </li></ol> 4. La calibración de electrodos NOTA: La calibración del electrodo durante el aislamiento completo mitocondrial. <ol><li> Añadir 100 ml de agua destilada al matraz de 250 ml. Agitar vigorosamente durante 20 minutos para equilibrar el agua con gas atmosférico. </li><li> Añadir unas gotas de 50% de KCl con el electrodo Oxygraph. </li><li> Coloque un pedazo pequeño de papel azul Rizla rodando en la parte superior del electrodo. </li><li> Coloque un pedazo de membrana PTFE en la parte superior del papel de fumar. </li><li> Aplicar el anillo interior, utilizando el aplicador de anillo y coloque el anillo exterior en la ranura de los electrodos. </li><li> Conectar los electrodos y montar el resto del equipo: más grande base de anillo de plástico, cámara de las mitocondrias, y mangueras de agua. </li><li> A su vez en cajas de Oxygraph y comenzar software Oxygraph. </li><li> Agregue el agua a la cámara de equilibrio mitocondrial. </li><li> Añadir una barra de agitación y gire a una velocidad de 60. </li><li> Comenzar un nuevo experimento. </li><li> Haga clic en calibrar y calibración de fase líquida para el Cuadro 1. Los cambios de temperatura a 37 ° C y haga clic en &quot;Aceptar&quot; dos veces. </li><li> Cuando &quot;Override&quot; cambia a &quot;OK&quot; haga clic en él y abrir el tanque de gas nitrógeno. </li><li> Coloque la punta conectadosal tanque de nitrógeno en la cámara y establecer el oxígeno cero. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; cuando se cambia de &quot;anulación&quot;. </li><li> Aspirar el agua y añadir 500 l de tampón EB a las cámaras de las mitocondrias. </li><li> Junta de la cámara con el émbolo. </li><li> Si utiliza varias cajas, repita los pasos 11-15 para la calibración de la caja 2. </li></ol> 5. La respiración mitocondrial <ol><li> Iniciar un nuevo experimento, se deja correr durante 1 minuto para estabilizar la señal. </li><li> Añada el volumen necesario de la suspensión mitocondrial (paso 3.11) por 150 g en cada cámara, evento marca, y se deja correr durante 1 minuto. </li><li> Añadir 10 l de agua tibia 250 mM/125 mM de glutamato / malato para una concentración final de 5 mM mM/2.5. Mark y deje correr durante 1 minuto. Esta se define como la etapa 2. </li><li> Añadir 7,5 l de 10 mM de ADP, para una concentración final de 150 M, la marca, y dejar funcionar durante 30 segundos. Esta se define como Estado 3. </li><li> Añadir otro 7,5 l de 10 mM de ADP, la marca, y deje correr durante 1,5 minutos. </li><li> Añadir 0,5 l de oligomicina frío de 10 mm para una concentración final de 1 M, marca, y dejar funcionar durante 3 minutos. Esta se define como Estado 4. </li><li> Añadir 1 l de frío mM FCCP 0.1 para una concentración final de 0,2 M, marca, y dejar funcionar durante 3 minutos. Esta se define como Estado 5. </li><li> Cuando haya terminado, al final experimento y guardar. </li><li> Adquirir las tasas de respiración utilizando el software Oxygraph. </li><li> Introduzca factor de normalización: si la adición de 150 mg de proteína mitocondrial, el factor de normalización será 0,15. </li><li> Calcular las tasas de respiración normalizado para los estados de respiración diferente. </li><li> Calcular la relación de control respiratorio (RCR), dividiendo por el Estado 3 Estado 4. </li></ol> 6. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Muestra un representante de seguimiento del consumo de oxígeno por las mitocondrias del músculo esquelético. Después de la señal del electrodo se haya estabilizado, la muestra de las mitocondrias se añade a la cámara de Oxygraph. Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato y malato. Además de ADP aumenta el consumo de oxígeno, la definición de estado de tres respiración. ATP sintasa está bloqueada por la adición de oligomicina para obtener el estado 4 de respiración. Por último, FCCP se añade a desacoplar la respiración mitocondrial (estado 5). La Tabla 1 muestra las tasas de consumo de oxígeno representante de los estados 2, 3, 4 y 5. La relación del control respiratorio (RCR) se calcula para cada experimento. RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable. <table border="1"><tbody><tr><td> Estados </td><td> Tarifas normalizado </td></tr><tr><td> El estado 2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td> Estado 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> El estado 4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td> Estado 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las tasas de respiración mitocondrial. Representativeoxygen las tasas de consumo de las mitocondrias del músculo esquelético. Los valores se normalizan a la cantidad de mitocondrias añadido a la cámara. La relación del control respiratorio (RCR) se determina dividiendo el estado 3 en el estado 4. Un RCR ≥ 4 representa una preparación de mitocondrias viable.

<ol>
	<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease.">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, S96-S102 (2004).</li><li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease.">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia.">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li><li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria:+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function.">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

Se presenta un protocolo para aislar viable mitocondrias de los músculos esqueléticos. Si el rendimiento es un problema, el protocolo puede ser modificado mediante la incubación de los músculos aislados en 5 ml de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% durante 30 minutos en hielo. Para asegurar la digestión completa del músculo con tripsina, el músculo tiene que ser totalmente picada. Después de la incubación de 30 minutos, la solución PBS/10mM EDTA/0.01% de tripsina debe ser reemplazado por completo con 3 ml de tampón...

<table><tbody><tr><td>95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; mix</td><td>Local Gas Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-diphosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Blue Rizla Paper</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressed nitrogen</td><td>Local Gas Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Free fatty acid bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Male Sprague Dawley Rats</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500g</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen electrode disc</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01 Software</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homogenizers</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125mm &amp;#215; 25mm) membrane</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>SKIL 3320 drill press</td><td>Hardware store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondrial isolation from skeletal muscle

Las mitocondrias son orgánulos que controlan la vida y la muerte de la célula. Participan en las principales reacciones metabólicas, síntesis de la mayor parte de la ATP, y regular una serie de cascadas de señalización 2,3. Los investigadores del pasado y actuales tienen mitocondrias aisladas de tejidos de ratas y ratones, como el hígado, cerebro y corazón 4,5. En los últimos años, muchos investigadores se han centrado en estudiar la función mitocondrial de los músculos esqueléticos. Aquí se describe un método que hemos utilizado con éxito para el aislamiento de las mitocondrias de los músculos del esqueleto 6. Nuestro procedimiento requiere que todos los tampones y reactivos son frescas y la necesidad de 250-500 mg de músculo esquelético. Hemos estudiado las mitocondrias aisladas de gastrocnemio de ratas y ratones y el diafragma y los músculos extraoculares rata. Concentración de proteína mitocondrial se mide con el ensayo de Bradford. Es importante que las muestras se mantendrán mitocondrial helado durante la preparación y que los estudios funcionales se realizará en un plazo relativamente corto (aproximadamente 1 hora). Respiración mitocondrial se mide utilizando la polarografía con un electrodo tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. La calibración del electrodo de oxígeno es un paso clave en este protocolo y debe realizarse diariamente. Mitocondrias aisladas (150 mg) se añadió a 0,5 ml de solución tampón experimental (EB). Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato (5 mm) y malato (2,5 mM). Entonces, la adenosina difosfato (ADP) (150 M) se añade al estado de inicio 3. Oligomicina (1 M), un bloqueador de la sintasa de ATP-asa, se utiliza para estimar el estado 4. Por último, el cianuro carbonilo p-[trifluorometoxi]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 M) se añade a measurestate 5, o no enganchados respiración 6. La relación del control respiratorio (RCR), la relación entre el estado 3 al estado 4, se calcula después de cada experimento. Un RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable. En resumen, se presenta un método para el aislamiento de las mitocondrias viable de los músculos esqueléticos que pueden ser utilizados en estudios bioquímicos (por ejemplo, la actividad enzimática, inmunodetección, proteómica) y funcionales (respiración mitocondrial).

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Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). El procedimiento de aislamiento mitocondrial requiere aproximadamente 2 horas. La respiración mitocondrial se puede completar en aproximadamente 1 hora.

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

28.8K vistas.  University of Kentucky. Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano Et al. (2007). El procedimiento de aislamiento mitocondrial requiere aproximadamente 2 horas. La respiración mitocondrial se puede completar en aproximadamente 1 hora.

Video: Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Investigación

Bioquímica

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medicina

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biología

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fraccionamiento mitocondrial en muestras de tejido pequeño para análisis supercomplejo

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

Autor destacado: Desvelando la dinámica del sistema de fosforilación oxidativa y las funciones mitocondriales en la salud y la enfermedad

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

<meta charset="utf8"></head><body>Aislamiento mitocondrial de roedores para estudios bioenergéticos de alta calidad

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Descubriendo el papel del fosfato de calcio mitocondrial en la insuficiencia cardíaca y la bioenergética

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Resumen

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Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares

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Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores

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