El objetivo de este protocolo es simplificar el experimento knock-in mediado por CRISPR / Cas9 en líneas de macrófagos y células T, con la ayuda de reporteros fluorescentes y afectar la clasificación celular. ROSA26 Locus es conocido como un sitio de puerto seguro genómico para la inserción de transgenes. Es habitual expresar proteína de interés con o sin ataque en el mundo del ratón de 26 locus, o en el registro orto ortopédico humano.
Parte 1: Diseño y construcción de plásmidos de sgRNAs dirigidos a Rosa26 Locus. Primero, diseñe sgRNAs del locus Rosa26 del ratón, utilizando secuencias de la informática del genoma del ratón, y Ensemble Genome Browser, luego descargue la secuencia genómica del gen Rosa26 del ratón. Vaya a la herramienta web en línea, CRISPOR, pegue 100 pares de bases de la secuencia de entrada del Rosa26 Locus.
Luego seleccione un genoma, por ejemplo, Mus musculus-mouse reference genome 2011. A continuación, seleccione el tipo de PAM. Utilice el motivo NGG"PAM de 20 pb, reconocido por spCas9.
Haga clic en Enviar. Elija una guía con un puntaje de alta especificidad, un puntaje de rendimiento alto y un menor número de objetivos. Deben evitarse las guías indicadas como ineficientes.
En particular, se prefiere seleccionar dos guías con secuencias superpuestas, lo que puede aumentar la eficiencia de knock-in como se informó. Para la secuencia de cena caliente, sintetizar un avance ilegal y un reverso ilegal, que recocido fosforado y listo para clonación a factor. Preparar la disminución linealizada por Vactor a la que podría expresar es que tengo que reportero por BBS una digestión, como obtener el Neal, los legales al vector linealizado para generar el constructo final, que expresa simultáneamente el ARN guía y el cas nueve núcleo enlazado en con un DSRIP dos reportero fluorescente.
Segunda parte: Construcción del vector de destino como plantilla de recombinación homóloga. Para la expresión de la proteína de interés. Por ejemplo, el humano duró.
Desea sintetizar la secuencia de ADNc por fuente comercial y la etiqueta OST de afinidad u otro ataque comúnmente utilizado para la purificación de proteínas que se puede fusionar con la secuencia de ADNc. Recuerde incluir la secuencia de consenso kazaja antes del inicio del ADNc. Digerido por la enzima de restricción Asc1, y como obtener el CD y el inserto en la columna vertebral.
Vactor, es decir, pKhR26-IBFP IBP que produce el objetivo final concentra el contenedor, cada uno, KB de cinco brazos homólogos primos y tres primos. El conjunto de reparto de expresiones incluye un promotor de CG, el restaurante UST, si desea que la región de Koonin esté vinculada a un Iris, si vfD reporter y un poly AC financia. Finalmente, en el horizonte apuntando al vector utilizando enzimas cortadoras únicas, como EcoR1 o BamH1, los resúmenes y el producto se purifican en una tienda que menos 20 grados en notas de electroporación.
Se recomienda obtener una alta concentración de ADN vectorial linealizado. Tercera parte: La electroporación de macrófagos y líneas de células T prepara el cultivo celular después de la separación para las células geritalk. La densidad celular óptima fue de aproximadamente 0,5 millones de células por ML en el momento de la transfección.
La electroporación completa en diez formatos macro de punta de moda nuclear prepara una placa de 24 pocillos que contiene 500 microlitros de crecimiento completo, medio sin antibióticos en cada pozo. Precalencier las placas en humidificado 37 grados, cubriendo al 5% esa incubadora de fracóster. Baje los parámetros de electroporación de entrada del sistema de operación eléctrica para jet cat o Rosales.
Prepare los seguimientos de la mezcla de ADN celular o la operación de recolección de células de pollo. Curchin 25 centímetros cuadrados matraz de transferencia de células en los 15 animales. Desde que sonda, entonces Phillip las células por centrofugación a 90 veces G durante ocho minutos a temperatura ambiente, pídalo, los sobrenadantes.
Para el lavado, vuelva a colocar las células con los cinco ML PBS, luego gire la suspensión celular por centrifugación utilizando la misma condición que el paso anterior. Quite los DPP. Y resuspend las almohadas celulares usando dos ML de DBS.
Se queda micro pequeña suspensión de celdas y se mezcla con el mismo volumen de 0.2% Trepan Ballou para estimar el recuento de celdas de la muestra de carga en términos de ranura de conteo inserte la diapositiva Denie en la celda automatizada Connor y vea la imagen ellos mismos. A continuación, obtenga un resultado de recuento de celdas. Calcule 2 millones de células encontrará reputaciones de electroporación por experimento de golpeo transferir el número de células a 1.5 ML.Centrifugar dos células de pellets por centrifugación.
Para ahorrar tiempo, se puede preparar una mezcla de electroporación durante la centrifugación que agrega 2.5 microgramos de cada uno de CRISPR CAS nueve vector 2.4 microgramos de arroz Belinda, vector hablador y re suspension Buffalo. Nuestro volumen total total de 55 macro camada en un nuevo tubo centrifugado de 1,5 ML suavemente vértice y. Brevemente de pie para mezclar bien.
Deje la mezcla de presión Luxor y la temperatura ambiente antes de usar. Después de girar aspart, el DTB es esencialmente este fusible durante 30 segundos adicionales, retire la mayor cantidad posible de celdas de re-suspensión agregando la pipeta de mezcla de electroporación preparada hacia arriba y hacia abajo suavemente. La electroporación pidió el mezclador de electroporación de celda utilizando 10 micro pequeñas puntas de facción nuclear fue importante.
Evite las burbujas de aire durante las caricias pi, costará una falla en la galvanoplastia. Pulse Inicio. después de lo cual la operación transfiere la muestra en un tiempo.
El pozo de 24, las placas de pozo con una pre-advertencia del medio bruto realizan la misma presión eléctrica y los mismos procedimientos que los anteriores en las cuatro muestras replicadas restantes, sacuden suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar las células en una incubadora de 37 grados durante 48 a 72 horas. Antes de los hechos, la clasificación celular a las 24 horas después de la transfección, examinar la expresión de la interrupción dos para el reportero del restaurante utilizando la microscopía fluorescente separada del representante para nosotros mismos indica que la electroporación está funcionando correctamente.
Parte 4: clasificación de células para aislar las células putativas en cadena. Antes de preparar la clasificación celular, en 96 placas de pozo con 150 micro de medio bruto específico de tipo celular por pozo use un micro lugar inferior incorrecto para el cultivo y para sí mismo y el micro lugar de fondo plano para todas las células transfiera células a un FACS estéril para mantener el tubo en hielo y poner la caja en el camino a través de la ventana, conectándose a la sala de clasificación celular cuando corresponda, establezca el clasificador de células con boquilla de 85 micro metros y bajo caudal para la clasificación de células inmunes para lograr una evaluabilidad y supervivencia celular óptimas, tome muestras del vértice de la ventana de paso brevemente y cargue la muestra en las adquisiciones. Champer configuró el patinaje de hechos para la clasificación de células primero definió los embudos de ventas para la dispersión de Ford y la dispersión lateral, luego definió las células de vida obteniendo el conjunto de células rojas negativas.
A continuación, encuentran una sola célula viva mediante una sola apertura de singlete utilizando el FSC H frente a FSE, un bloque multivariante. Finalmente, establezca una puerta para los DSR deseados dos y B si la subpoblación positiva de Volvo, lo que indica que las células se transfectaron con éxito con el vector CRISPR y el vector de bolsillo. Así que 10 células individuales en cada pozo de la placa de pozo 96 complementada con el precalentamiento, el medio de crecimiento completo utilizando el modo de período o el modo de célula única después de la clasificación incuban las placas de 96 pozos en la incubadora de cultivo celular para la expansión celular.
Quinta parte: cribado de elevación de células knock-in positivas Después de aproximadamente dos semanas de expansión celular más allá de la supervivencia, las células en la placa de 48 pozos evalúan la expresión de BFP o citometría de flujo utilizando una pequeña proporción de células de proliferación utilizando las células tipo pared como poblaciones celulares de control negativas, que poseen un mayor porcentaje de células BFP positivas se mantienen para cumplir con la validación del extracto del ADN genómico de las células que debemos expresar. BFP pasa el ADN genómico aislado por PCR con cebadores que abarcan cada lado de los brazos homólogos, es decir, un primario localizado en la secuencia genómica, exterior al vector objetivo. El lado visto de hablar con el vector en este experimento, el tamaño predicho del producto de PCR amplificado con el primario es de 1.2 KV. Y con F dos y R dos es 1.2 KB resultados de secuenciación de Sanger. Así, los productos de PCR muestran las secuencias de cada unión de integración demostrando la posición correcta y de golpeo en el Rosa 26 Lucas.
Digo como immuno blotting permite la validación de golpes correctos a nivel de proteína parte seis resultados representativos. Como ejemplo, publicado en un estudio anterior, expresamos que se consiguen 45 moléculas de adherencia que el inter con una etiqueta OSD, y hubo un locus de 26 en las células T de checkout posteriormente USD tacto. Obtengo 45 e incidentes directores o derribados por afinidad purificación y un sujeto a espectrometría de masas.
Los datos proteómicos revelaron la interacción de las células T. Por lo tanto, este grupo de productos ha facilitado en gran medida la búsqueda de nuevos intercaladores para dilucidar la función de una proteína dada. Esta presentación técnica mostró que por expreso transitorio aumentó por línea de fundición RFP con el vector parlante co-expresado y BFP para rosa 26 locus.
Generamos líneas celulares knocking con expresión génica permanente tanto en células T como en macrófagos, que son difíciles de realizar en manipulaciones genéticas. Estos métodos y recomendaciones son aplicables a Chris permitidos en afirmaciones de gran segmento de ADN para estudios mecanicistas de células inmunes, como para la identificación de proteínas, estudio de interacción de proteínas.
