الهدف من هذا البروتوكول هو تبسيط CRISPR /Cas9 بوساطة ضرب في تجربة في الضامة وخطوط الخلايا التائية ، مع مساعدة من المراسلين الفلورسنت وتؤثر على فرز الخلايا. يعرف موقع ROSA26 Locus كموقع ميناء آمن جينومي لإدراج المتحولات. ومن المعتاد للتعبير عن البروتين من الفائدة مع أو بدون هجوم في عالم الماوس من 26 مكان، أو في سجل العظام البشرية.
الجزء 1: تصميم وبناء البلازميد من sgRNAs استهداف روسا26 الجراد. أولا، تصميم sgRNAs من موقع Rosa26 الماوس، وذلك باستخدام تسلسل من المعلوماتية الجينوم الماوس، ومتصفح الجينوم الفرقة، ثم تحميل التسلسل الجينومي للجين Rosa26 الماوس. انتقل إلى أداة الويب عبر الإنترنت ، CRISPOR ، الصق 100 زوج أساسي من تسلسل الإدخال من مكان Rosa26.
ثم حدد الجينوم، على سبيل المثال، موس العضلات الماوس الجينوم المرجعي 2011. بعد ذلك، حدد نوع PAM. استخدم 20bp NGG "PAM motif، المعترف بها من قبل spCas9.
انقر فوق إرسال. اختيار دليل مع درجة عالية من التحديد ، وارتفاع درجة القيام به ، وأقل من الأهداف. وينبغي تجنب الأدلة التي يشار إليها على أنها غير فعالة.
وتجدر الإشارة إلى أنه يفضل تحديد دليلين مع تسلسل متداخل ، مما قد يزيد من كفاءة الضربة القاضية كما ورد. لتسلسل تناول الطعام الدافئ ، توليف غير قانوني إلى الأمام وعكس غير قانوني ، والذي تم صلب الفوسفور وعلى استعداد للاستنساخ إلى عامل. إعداد انخفاض خطي لكل Vactor التي يمكن أن تعبر عن هو لا بد لي من مراسل من قبل BBS هضم واحد ، مثل الحصول على نيل ، والقانونية لنواقل خطي لتوليد بناء النهائي ، والذي يعبر في وقت واحد دليل الجيش الملكي النيبالي و CAS تسع نواة مرتبطة مع DSRIP اثنين من المراسلين الفلورسنت.
الجزء الثاني: بناء موجه الاستهداف كقالب إعادة دمج متجانس. للتعبير عن البروتين من الاهتمام. على سبيل المثال، استمر الإنسان.
تريد توليف تسلسل cDNA حسب المصدر التجاري وتقارب علامة OST أو غيرها من الهجوم شائع الاستخدام لتنقية البروتين يمكن دمجها في تسلسل cDNA. تذكر أن تدرج تسلسل توافق Kazak قبل بدء cDNA. هضمها Asc1 تقييد الانزيم ، ومثل الحصول على القرص المضغوط وإدراج في العمود الفقري.
Vactor، وهي pKhR26-IBFP IBP تسفر عن الاستهداف النهائي تركيز الحاوية، كل واحد، كيلوبايت من خمسة رئيس الوزراء وثلاثة أذرع رئيسية متجانسة. مجموعة يلقي التعبير يتضمن المروج CG، ومطعم UST، إذا كنت تريد منطقة كونين مرتبطة إيريس، إذا مراسل VFD وصناديق بولي AC. وأخيرا في الأفق استهداف ناقلات باستخدام إنزيمات قطع فريدة من نوعها، مثل EcoR1 أو BamH1، يتم تنقية الهضمات والمنتج في مخزن أن ناقص 20 درجة على ملاحظات الكهربائي.
فمن المستحسن الحصول على تركيز عال من الحمض النووي ناقلات خطية. الجزء الثالث: الكهرومربوجين من خطوط الماكروفاج والخلايا التائية إعداد ثقافة الخلية يتبع فصل لخلايا جيريتوك. وكانت الكثافة المثالية للخلايا حوالي 0.5 مليون خلية لكل مل في وقت العدوى.
الكهربية الكاملة في عشرة الماكرو قليلا صيغ تلميح الموضة النووية إعداد لوحة بئر 24 تحتوي على 500 ميكرولتر من النمو الكامل، والمتوسطة دون المضادات الحيوية في كل بئر. ما قبل الحرب لوحات في الرطوبة 37 درجة، 5٪ تغطي أن حاضنة الإعداد. رفض معلمات إدخال نظام التشغيل الكهربائي للقط النفاث أو روزاليس.
إعداد خلية الحمض النووي المتابعة خليط أو عملية جمع خلايا الدجاج. Curchin 25 قارورة سنتيمتر مربع نقل الخلايا في الحيوانات 15. منذ كنت أنبوب، ثم فيليب الخلايا عن طريق القنطرة في 90 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونسأل عن ذلك، وsupernatants.
لغسل, Resuspend الخلايا مع برنامج تلفزيوني ML خمسة, ثم تدور تعليق الخلية عن طريق الطرد المركزي باستخدام نفس الشرط كما في الخطوة السابقة. إزالة DPPs. وإعادة إنفاق الوسائد الخلية باستخدام اثنين من ML من DBS.
يمكنك البقاء تعليق الخلية الصغيرة الصغيرة ومزيج مع حجم متساو من 0.2٪ تريبان بالو لتقدير عينة تحميل عدد الخلايا من حيث عد فتحة إدراج كوني الشريحة في كونور الخلية الآلي وعرض الصورة نفسها. ثم الحصول على نتيجة عدد الخلايا. حساب 2 مليون خلية سوف تجد سمعة من electroporation لكل تجربة طرق نقل عدد الخلايا إلى 1.5 ML.Centrifuge اثنين من خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي.
لتوفير الوقت، يمكن إعداد خليط الكهربوجين أثناء الطرد المركزي الذي يضيف 2.5 ميكروغرام من كل من CRISPR CAS تسعة ناقلات 2.4 ميكروغرام من أرز بليندا، ناقل ثرثار، وإعادة تعليق الجاموس. لدينا إجمالي حجم القمامة الماكرو 55 في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل جديدة بلطف والقمة. لفترة وجيزة الوقوف على مزيج جيد.
اترك خليط ضغط الأقصر ودرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد الغزل aspart، وDTB هو هذا الصمامات أساسا لمدة 30 ثانية إضافية، وإزالة أكبر قدر ممكن من الخلايا إعادة تعليق عن طريق إضافة ماصة خليط الكهربائي المعدة صعودا وهبوطا بلطف. طلب Electroporation لخلاط كهربائي الخلية باستخدام 10 صغيرة تلميح فصيل النووية الصغيرة كانت ماصة مهمة.
تجنب فقاعات الهواء أثناء pi petting سيكلف فشل الصعق بالكهرباء. اضغط على البدء. وبعد ذلك نقل العملية العينة في حين.
حسنا من 24، لوحات الآبار مع قبل تحذير المتوسط الإجمالي أداء نفس الضغط الكهربائي والإجراءات المذكورة أعلاه على العينات الأربع المتبقية المكررة، صخرة بلطف لوحة لضمان توزيع حتى من الخلايا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة لمدة 48 إلى 72 ساعة. قبل وقوعها ، وفرز الخلية في 24 ساعة بعد transfection ، ودراسة التعبير عن تعطيل اثنين لمراسل مطعم باستخدام المجهر فلوريسي منفصلة عن مندوب بالنسبة لنا أنفسهم يشير إلى أن electroporation يعمل بشكل صحيح.
الجزء 4: فرز الخلية لعزل الخلايا المفترضة. قبل فرز الخلية إعداد، في 96 لوحات بئر مع 150 ميكرو قليل من نوع الخلية المتوسطة الإجمالية محددة لكل بئر استخدام مكان خاطئ أسفل الصغرى للثقافة نفسها ومكان صغير أسفل شقة لجميع الخلايا نقل الخلايا إلى FACS عقيمة للحفاظ على أنبوب في على الجليد ووضع مربع في المسار من خلال النافذة، الاتصال غرفة فرز الخلية عند تطبيقها مجموعة فرز الخلية مع فوهة 85 متر صغير وانخفاض معدل التدفق لفرز الخلايا المناعية لتحقيق المثلى evaluability الخلية والبقاء على قيد الحياة تأخذ عينات من قمة النافذة العابرة لفترة وجيزة، وتحميل العينة في عمليات الاستحواذ. Champer إعداد التزحلق على الحقائق لفرز الخلية المحددة أولا مسارات المبيعات لتشتت فورد وتشتت الجانب، ثم تحديد خلايا الحياة عن طريق الحصول على مجموعة محادثات الخلايا السلبية الحمراء.
بعد ذلك ، يجدون خلايا واحدة حية عن طريق gating singlet واحد باستخدام FSC H مقابل FSE كتلة متعددة المتنوعة. وأخيرا تعيين بوابة لDSRs المطلوب اثنين وباء إذا كان السكان الفرعية فولفو إيجابية، مما يشير إلى الخلايا بنجاح co transfected مع ناقلات CRISPR وناقل الجيب. حتى 10 خلايا واحدة في كل بئر من 96، لوحة جيدة تكملها مع ما قبل الحرب، ومتوسط النمو الكامل باستخدام وضع الفترة أو وضع خلية واحدة بعد فرز احتضان 96، لوحات الآبار في حاضنة ثقافة الخلية لتوسيع الخلية.
الجزء الخامس: فحص ارتفاع الخلايا الإيجابية بعد أسبوعين تقريبا من توسع الخلية بعد البقاء على قيد الحياة ، تقوم الخلايا في لوحة البئر 48 بتقييم تعبير BFP أو قياس التدفق الخلوي باستخدام نسبة صغيرة من الانتشار نفسه باستخدام خلايا نوع الجدار كخلايا تحكم سلبية ، ويتم الاحتفاظ بنسبة أعلى من الخلايا الإيجابية BFP لتحقيق التحقق من صحة استخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا التي يجب أن نعبر عنها BFP تمرير الحمض النووي الجينومي معزولة من قبل PCR مع التمهيديات التي تمتد على كل جانب من الأسلحة متجانسة، وهي واحدة يحدد الأولية في تسلسل الجينوم، والخارج إلى ناقلات الاستهداف. الجانب ينظر إلى الحديث إلى المتجه في هذه التجربة، وتوقع حجم المنتج PCR تضخيمها مع الابتدائي هو 1.2 كيلو فولت. ومع F اثنين و R اثنين هو 1.2 كيلو بايت نتائج تسلسل سانجر. حتى منتجات PCR تظهر تسلسل كل تقاطع التكامل مما يدل على الموقف الصحيح وطرق في روزا 26 لوكاس.
أقول مثل النشاف المناعي تمكن من التحقق من صحة طرق الصحيح على مستوى البروتين الجزء السادس النتائج التمثيلية. على سبيل المثال ، نشرت في دراسة سابقة ، أعربنا عن أن الحصول على 45 جزيئات تك أن إنتر مع علامة OSD ، وكان هناك 26 موضعا في الخروج T -cells في وقت لاحق لباقة الدولار الأمريكي. أحصل على 45 ومديري الحوادث أو سحبت إلى أسفل عن طريق تنقية تقارب وموضوع لقياس الطيف الشامل.
وكشفت بيانات البروتيوميات التفاعل بين الخلايا التائية. ولذلك فإن هذا المجمع المنتج قد سهلت إلى حد كبير البحث عن intercalators رواية لتوضيح وظيفة بروتين معين. وأظهر هذا العرض الفني أن أعرب عابرة عن زيادة لكل خط الزهر RFP مع ناقلات الحديث أعرب المشتركة وBFP لروسا 26 الموضع.
لقد ولدنا خطوط خلايا مدقة بتعبير جيني دائم في كل من الخلايا التائية والكوابير، والتي يصعب إجراؤها في التلاعب الجيني. تنطبق هذه الطرق والتوصيات على كريس المسموح به في التأكيدات على جزء كبير من الحمض النووي للدراسات الميكانيكية للخلايا المناعية ، مثل تحديد البروتين ، دراسة التفاعل البروتيني.
