Este protocolo utiliza un flujo de trabajo de edición de genes CRISPR de alto rendimiento para diseccionar molecularmente genes de micro ARN organizados y unidades agrupadas. Y para determinar cómo estas redes de ARN no codificantes coordinan las vías de progresión del cáncer. Este procedimiento de edición de genes CRISPR permite al investigador generar rápidamente un panel completo de líneas celulares que llevan combinaciones únicas de deleción de grupos de micro ARN, evitando al mismo tiempo la subclonación de vectores de ADN.
Este método proporcionará una comprensión más clara de cómo los micro ARN agrupados funcionan cooperativamente para regular el crecimiento tumoral, la agresividad y la resistencia a los medicamentos antes de traducir los micro ARN a la clínica como herramientas terapéuticas y de diagnóstico. Demostrando el procedimiento estará Grace Yi, una asistente de investigación en mi laboratorio. Para comenzar, cree un archivo de ADN que contenga la secuencia genómica completa de la región de micro clúster de ARN de interés en al menos un kilobytes de regiones genómicas circundantes utilizando un programa de software de anotación de secuencias de ADN.
A continuación, diseñe cuatro ARN CRISPR únicos para cada locus de micro ARN objetivo. Dos diseñaron ARN CRISPR para apuntar inmediatamente a secuencias de ADN complementarias de cinco primos del grupo de horquilla de micro ARN y dos diseñaron ARN CRISPR para apuntar inmediatamente a secuencias de ADN complementarias de tres primos del grupo de horquilla de micro ARN. Utilice una herramienta de edición de características en el archivo de ADN creado para marcar la secuencia objetivo de ADN para cada ARN CRISPR diseñado que se va a sintetizar.
Diseño y síntesis de cebadores de PCR que flanquean las regiones de micro grupos de ARN objetivo para genotipar líneas celulares CRISPR. Realizar una curva de concentración de doxiciclina en líneas celulares Cas9 inducibles por lenti recién generadas para determinar las condiciones óptimas para la inducción de proteínas Cas9. Placa cinco veces 10 de las cuartas células por pocillo de cada placa de seis pozos y crecer a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, en el medio preferido durante 24 horas.
Diluir dox en el medio preferido con una curva de concentración final de dox que oscila entre 0 5100, 150, 250 a 500 nanogramos por mililitro. Etiquete los pocillos de cada placa de seis pozos sentados de uno a seis. Retire el medio y reemplácelo con las concentraciones de dox adecuadas.
Cultive placas de una a cuatro hasta 24 horas, 48 horas y 72 horas de inducción de dox y 120 horas después de la retirada de dox. Coseche los pozos de la placa en cada punto de tiempo. Procese los gránulos celulares y el tampón ripa para el aislamiento de lisados.
Realice un análisis de Western blot con 40 microgramos de proteína para medir la inducción de proteína Cas9 y determinar la concentración óptima de Cas9. Sobre el papel, mapee las cinco combinaciones de pares de ARN CRISPR primos y tres primos que se transectarán en cada pocillo de una placa de 24 pocillos dirigida a todo el grupo de micro ARN, varias combinaciones de genes de micro ARN agrupados, así como miembros individuales del grupo de micro ARN. Placa el lenti inducible fundido nueve líneas celulares a cinco veces 10 a la cuarta células por pocillo de una placa de 24 pocillos en el medio preferido que contiene la concentración optimizada de dox.
Cultive las células durante 24 a 48 horas a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono para inducir la expresión de la proteína Cas9. Transfectar las células Cas9 inducibles por lenti con un ARN guía preparado de cinco primos y tres primarios. Etiquete cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros por locus de micro ARN objetivo.
En cada tubo, mezcle una proporción molar de uno a uno de ARN trazador y ARN CRISPR únicos para formar el complejo de ARN guía de dos micromolares. Agregue 2,5 microlitros de ARN trazador, 1,25 microlitros de los cinco ARN CRISPR posicionados principalmente, 1,25 microlitros de los tres ARN CRISPR posicionados en el primer nivel y cinco microlitros de tampón de 10 milimolares tris hcl pH 7,5 a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Micro centrífuga durante 30 segundos a 16, 000 veces G para mezclar.
Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A cada tubo a 40 microlitros de medio sérico reducido a los 10 microlitros de reacción del complejo de ARN guía. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
En un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros, mezcle dos microlitros del reactivo de transfección y 48 microlitros de medio sérico reducido suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A cada tubo que contenga los 50 microlitros de mezcla de ARN guía, agregue los 50 microlitros del reactivo de transfección diluido.
Pipetear la mezcla lentamente hacia arriba y hacia abajo una vez para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Agregue 400 microlitros de medio libre de antibióticos suplementado con doxiciclina a cada tubo que contenga los 100 microlitros de la mezcla de transfección de ARN guía.
Pipetear suavemente para mezclar. Retire el medio de las células Cas9 inducibles por lenti inducidas por doxiciclina. Agregue 500 microlitros de mezcla de transformación de ARN guía de doxiciclina basada en el mapa experimental de placas de 24 pocillos.
Incubar las células transfectadas durante 48 horas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. Reemplace el medio con el medio preparado fresco sin doxiciclina. Permita que las células se recuperen durante otras 24 a 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Cosecha las células transfectadas y prepárate para el genotipado y los delirios unicelulares. Separe los 150 microlitros de células resuspendidas en tres partes. Congele un tercio de las células transfectadas en medio más 10% de DMSO en viales criogénicos para almacenamiento a largo plazo.
Transfiera un tercio de las células transfectadas a un tubo de PCR limpio de 0,2 mililitros para la genotipificación. Preparar el tercio final de las células transfectadas para el conteo y la dilución en un formato de placa de 96 pocillos para generar colonias de células individuales. Usando un pipetter múltiple de 12 canales y un depósito de reactivo estéril, agregue 100 microlitros de células diluidas por pocillo a dos filas de la placa para cada dilución.
Espere de cuatro a seis semanas para que las células crezcan a cofluencia para la expansión de colonias de células individuales. Recolectar aproximadamente de 10 a 15 colonias de células individuales para la genotipificación. Identifique al menos tres líneas de colonias unicelulares knockout independientes para cada locus de micro ARN objetivo.
Conservar líneas de celda individuales de tipo salvaje como controles. La resuspensión ha sido el pellet celular en cuatro microlitros de cinco X tampón ADN polimerasa, un microlitro de proteinasa K, un microlitro de RNasa A y agua libre de nucleasas hasta un volumen total de 20 microlitros. Piojos las celdas en el termociclador a 56 grados centígrados durante 30 minutos y 96 grados centígrados durante cinco minutos.
Almacene los lisados celulares a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para el genotipado por PCR. Realice una reacción de genotipado por PCR utilizando los cebadores de PCR diseñados que flanquean los sitios objetivo de ARN guía de cinco primos y tres de ARN guía principal. Ejecute la reacción de PCR en un termociclador utilizando el programa mencionado en el texto manuscrito.
Cargue los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% para el análisis de electroforesis. Extraer ADN de los fragmentos de PCR aislados del tamaño molecular previsto para los genotipos knockout. Preparar las muestras para la secuenciación del ADN.
Validar que la reacción CRISPR fue exitosa y realizar la secuenciación del ADN de los fragmentos de PCR aislados para identificar el sitio de escisión de Cas9 y confirmar la eliminación del locus de micro ARN. Se diseñaron ARN CRISPR únicos dirigidos a toda la región del cúmulo miR-888 de 35 kilos. Combinaciones de clústeres más pequeños dentro de la familia miR-743 o la familia miR-891, así como deleciones de micro ARN.
El análisis de electroforesis en gel de las reacciones de PCR indicó que el tamaño del fragmento de ADN predicho que representa el genotipo knockout se amplificó para cada transfección CRISPR. Las colonias unicelulares fueron genotipadas por PCR en secuencia verificada. La secuenciación del ADN de estos fragmentos aislados de PCR knockout confirmó que los ARN guía de cinco primos y tres primarios transfectados dirigieron la ligadura de escisión Cas9 aproximadamente tres nucleótidos aguas arriba de los sitios PAM y validaron la pérdida genómica del locus de micro ARN objetivo.
Los ensayos de proliferación de WST-1 que comparan miR-891a knockout y células de tipo salvaje confirman que la sobreexpresión de micro ARN imita el vector lentiviral induce el crecimiento de células de próstata y, por lo tanto, se predijo que la pérdida de miR-891 mostraría efectos recíprocos. Además del diseño cuidadoso del ARN guía, es importante generar rápidamente colonias de células individuales a través de cada línea de micro ARN knockout. Es especialmente relevante si las células knockout de micro ARN han reducido el crecimiento de la viabilidad y serían fácilmente superadas en poblaciones mixtas con células de tipo salvaje.
Se deben realizar métodos adicionales como la PCR cuantitativa en tiempo real, el northern blot y la secuenciación de ARN para confirmar que las líneas celulares knockout CRISPR no expresan microARN maduro para el locus eliminado.
