In Vitro Método de Control de concentraciones de Gases halogenados en cultivos de células epiteliales alveolares

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de la investigación de lesiones pulmonares y reparación, como la prueba de ayuude halogenado como posibles terapias novedosas para el síndrome de dificultad respiratoria aguda. La principal ventaja de esta técnica es que se basa en un método muy simple para cultivar las células y exponerlas a agentes halogenados con el fin de alcanzar concentraciones precisas y controladas. Para construir la cámara hermética, utilice una caja hermética de polipropileno con una capacidad de 6,5 litros.

Taladre un agujero de 2,5 centímetros de diámetro en la parte inferior de la pared lateral de la caja. A continuación, inserte un tubo corrugado con una marca verde que servirá como el tubo de entrada de mezcla de aire de gas. Y sellarlo con silicona.

A continuación, taladre un segundo agujero con un diámetro de 2,5 centímetros en la parte superior de la pared lateral opuesta. Inserte otro tubo corrugado con una marca roja y conéctelo con un filtro de carbón que servirá como tubo de salida de mezcla de aire gas. A continuación, sellar con silicona.

Posteriormente taladre un agujero apretado con un diámetro de cuatro milímetros en el centro de la pared. Inserte el tubo de infusión corta que está conectado en un colector con un bloqueo de señuelo macho giratorio. Enchúfalo a un analizador de gas y séllalo con silicona.

A continuación, coloque un termómetro digital dentro de la cámara hermética. Bajo una campana extractora de laboratorio, personalice un circuito de máquina anestésica para cambiar la línea de gas de óxido nitroso por dióxido de carbono. Inserte un humidificador calentado en el tubo entre la máquina anestésica y la cámara hermética para calentar la mezcla de flujo de gas a aproximadamente 37 grados Centígrados.

Enchufe la cámara hermética con el tubo corrugado marcado en verde en el circuito de la máquina anestésica personalizada. A continuación, coloque la cámara hermética en una placa caliente ajustada a 37 grados Centígrados. Coloque una placa de seis pozos que contenga células epiteliales alveolares humanas en la cámara hermética y selle la tapa.

Regular el caudal de gas para obtener rápidamente el 5% de CO2. A continuación, abra el evaporador del agente halogenado y ajuste el porcentaje deseado. Una vez alcanzados los valores objetivo, reduzca el caudal de gas fresco a un litro por minuto.

La cámara hermética se puede mantener con este caudal de gas el tiempo que sea necesario para el experimento. Los cursos de las concentraciones de sevoflurano e isoflurano en el medio fueron similares con el tiempo. Inmediatamente después de que se estableció la concentración requerida de agente halogenado, las concentraciones aumentaron durante la primera hora.

Luego se llegó a una meseta que persistió hasta que se detuvo la administración del agente halogenado. Después de la interrupción de la administración, las concentraciones disminuyeron en una hora. Aquí se muestran las fracciones de agente halogenado a lo largo del tiempo en la cámara hermética medida por el analizador de gas.

Este procedimiento es relativamente barato y muy fácil de adoptar incluso cuando los investigadores nunca han manipulado una cámara hermética antes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cuantificación de proteínas y ARN, la inmunofluorescencia, la medición de la permeabilidad proteica y el transporte libre para responder preguntas sobre los efectos específicos de los agentes halogenados durante la lesión pulmonar epitelial y su resolución. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para la investigación en el campo del síndrome de dificultad respiratoria aguda para seguir estudiando el mecanismo implicado en la lesión pulmonar epitelial durante el SRAS y para probar nuevas terapias.