Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de desarrollo postnatal sobre la forma en que la leche materna influye en la señalización de estrés en el cerebro. Esta técnica se puede utilizar para capturar áreas cerebrales específicas durante el primer período de inanición natural y para compararlas con las áreas respectivas poco después de la primera alimentación natural del calostro. Entender cómo la lección influye en la fisiología del comportamiento y la emoción permite el uso de un antagonista a varios receptores durante el análisis del tejido cerebral ex-vivo.
Para obtener los golpes de núcleo, retire los cachorros de rata por la cola con una mano enguancha. Después de cosechar el cerebro, coloque rápidamente todo el órgano en un molde cerebral de polimetilmetacrilato a temperatura ambiente e inmediatamente use una nueva cuchilla de afeitar para hacer rodajas de 500 micrómetros de espesor del tejido. Poner las rodajas rostrales a caudal en un plato de Petri a medida que se obtienen para mantener la orientación correcta de las secciones.
Cuando todo el cerebro haya sido seccionado, agregue rápidamente líquido cefalorraquídeo artificial sin glucosa al plato e incubar las rodajas durante 60 minutos a 28 a 30 grados celsius con agitación constante en un agitador orbital. Utilice un atlas cerebral y puntos de referencia anatómicos en cada tejido para identificar los núcleos cerebrales que se van a perforar y colocar la rebanada con los núcleos de interés en una nueva placa Petri bajo un microscopio diseccionador. Una vez visualizado, utilice una herramienta de perforación para perforar rápidamente de cuatro a seis núcleos diferentes y sumergir rápidamente cada núcleo perforado en 0,06 ml de tampón de extracción de proteína helada en el tubo de micro centrífuga debidamente etiquetado que contiene inhibidores del proteo y fosfatasa durante 60 minutos.
Al final de la incubación, centrifuga los núcleos extraídos en una mini-centrífuga enfriada, y utilice una micro-pipeta para transferir cuidadosamente 0.055 mL de sobrenadante de cada tubo en el tubo de micro-centrífuga pre-enfriado apropiado de 1.5 ml sobre hielo. Antes del almacenamiento negativo de 20 grados centígrados, transfiera 0,012 ml de sobrenadante de cada tubo de stock proteico al tubo preenfriado de 0,5 ml sobre hielo adecuado para la primera preparación de la muestra. Para preparar las muestras para la medición de proteínas capilares, añada 0,003 ml de reactivo de mezcla maestra de un kit de lysis proteica a cada una de las muestras en los tubos etiquetados con 0,5 ml.
A continuación, añada 0,004 ml de reactivo de mezcla maestra a una solución de escalera de peso molecular biotinilado en 0,016 ml de agua desionizada, y desnaturalizar las muestras de la escalera y el extracto de proteína en un bloque de calor de 95 grados Celsius, almacenando todos los tubos a cuatro grados centígrados después de cinco minutos. Para el análisis de proteínas de señal, agregue 0,01 ml de solución de peróxido de luminol recién preparada a los pozos E-1 a E-25 de una nueva placa occidental automatizada, 0,01 ml de anticuerpo antiratón secundario a los pozos D-2 a D-25, y agregue 0,01 ml de peroxidasa de rábano picante estreptavidina del kit a D-1. Añadir 0,01 ml de anticuerpo primario recién preparado en los pozos C-2 a C-25, y 0,01 ml de diluyente de anticuerpos dos solución a los pozos C-1 y B-1 a B-25.
Deje los pozos de la fila F vacíos y llene los cinco compartimentos de las tres filas debajo de la fila F con 0,45 ml de búfer de lavado. A continuación, gire brevemente las muestras refrigeradas durante 30 segundos y agregue 0,03 ml de cada muestra a cada pozo de la fila A, comenzando con A-2. A continuación, agregue 0,005 ml de la escalera de peso molecular biotinilado a A-1 y cubra la placa para la centrifugación.
Mientras la placa está centrifugada, abra un nuevo archivo de ejecución en el software automatizado asociado occidental e inicie un ensayo de tamaño molecular. En la página del ensayo, introduzca los nombres de la muestra en cada capilar, así como los nombres de los anticuerpos primarios y secundarios. Al final de la centrifugación, coloque la placa en el instrumento occidental automatizado y pele la cubierta de la caja del cartucho capilar.
Después de la centrifugación, no se olvide de inspeccionar si hay burbujas de aire, ya que las burbujas de aire en el capilar pueden bloquear la corriente electroforética y fallar toda la ronda. Inserte el cartucho en la posición designada dentro del instrumento y cierre la puerta. Haga clic en Inicio.
Cuando se le solicite el tipo de ensayo, escriba el nombre del experimento en el cuadro de texto adecuado y haga clic en Aceptar. Cuando se le solicite la fecha de ejecución activada y el número de ID en el archivo de ejecución, anote la hora en que finaliza la ejecución. Al final de la carrera, deseche el cartucho capilar en la eliminación de objetos punzantes y la placa en la eliminación de materiales biopeligrosos.
Después de la separación de la electroforesis, compruebe los archivos de ejecución en busca de picos de reactividad inmune de antígenos a 40 a 43 kilodaltones que se refieren al factor de iniciación de traducción eucariota fosforilada 2A. Cuando faltan picos de peso molecular de este tamaño, haga clic con el botón derecho debajo de la curva y seleccione agregar peso molecular al pico para asegurarse de que se registran los tamaños y las cantidades arbitrarias por debajo de la curva. Dentro de las muestras de tejido sin cebar, los niveles de proteína de aminoglobulina de unión en los núcleos de la vía solitaria son significativamente más altos en comparación con todas las otras regiones.
El priming del tejido intestinal con calostro disminuye los niveles de proteína de aminoglobulina de unión en los núcleos de la vía solitaria y no tiene ningún efecto sobre los núcleos paraventriculares y los núcleos superópticos. Por el contrario, el cebado aumenta los niveles de proteína de aminoglobulina de unión dentro de la corteza, los núcleos deestura y los núcleos preópticos mediales en relación con el tejido sin cebar, lo que implica que los niveles de proteína de aminoglobulina de unión en los diversos núcleos cerebrales probados responden de manera diferente al cebado intestinal y todavía no hay ninguna conversación cruzada demostrada entre los diversos núcleos probados. Los niveles de iniciación de la traducción eucariota 2A y factor 2A de iniciación de la traducción eucariota fosforilados se elevan en la condición sin cebar en relación con otros núcleos.
Después del cebado, los niveles del factor de iniciación de la traducción eucariota 2A y del factor de iniciación de la traducción eucariota fosforilada 2A se reducen en relación con los núcleos de la vía solitaria en comparación con el tejido no cebado. En todos los demás núcleos probados, el cebado aumenta los niveles del factor de iniciación de la traducción eucariota 2A y del factor 2A de iniciación de la traducción eucariota fosforilada en relación con el tejido no cebado. Sin embargo, los niveles del receptor de proteína quinasa fosforilada son bajos en muestras sin cebar en relación con muestras cebadas en núcleos de la vía solitaria, lo que sugiere fuertemente que otra quinasa está involucrada en la fosforilación del factor 2A de iniciación de la traducción eucariota.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo postnatal exploraran las vías de señalización implicadas en el crecimiento y diferenciación de los tejidos y si están influenciadas o independientes de la succión. No olvide que trabajar con agentes reductores volátiles como, por ejemplo, ditiothreitol, puede ser peligroso, y precauciones como la preparación en la campana química siempre deben tomarse al preparar este procedimiento.
