Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im postnatalen Entwicklungsbereich zu beantworten, wie Milchsäugung die Stresssignalisierung im Gehirn beeinflusst. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Hirnbereiche während der ersten natürlichen Hungerperiode zu erfassen und sie mit den jeweiligen Bereichen kurz nach dem ersten natürlichen Kolostrumfutter zu vergleichen. Das Verstehen, wie Dassäugen die Physiologie von Verhalten und Emotion beeinflusst, ermöglicht die Verwendung eines Antagonisten an verschiedenen Rezeptoren während der Ex-vivo-Gehirngewebeanalyse.
Um die Kernschläge zu erhalten, entfernen Sie die Rattenwelpen am Schwanz mit einer handgeliebten Hand. Nach der Ernte des Gehirns, legen Sie schnell das gesamte Organ in einem Polymethylmethacrylat Gehirnform bei Raumtemperatur und sofort verwenden eine neue Rasierklinge, um 500 Mikrometer dicke Scheiben des Gewebes zu machen. Legen Sie die Scheiben rostral zu kaudal in einer Petrischale, wie sie erhalten werden, um die richtige Ausrichtung der Abschnitte zu halten.
Wenn das gesamte Gehirn geschnitten wurde, fügen Sie schnell künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit ohne Glukose in die Schale und inkubieren Sie die Scheiben für 60 Minuten bei 28 bis 30 Grad Celsius unter ständigem Rühren auf einem Orbitalschüttler. Verwenden Sie einen Hirnatlas und anatomische Landmarken auf jedem Gewebe, um die zu stanzten Hirnkerne zu identifizieren und die Scheibe mit den Kernen von Interesse in eine neue Petrischale unter einem Sezierendes Mikroskop zu platzieren. Nach der Visualisierung verwenden Sie ein Koringwerkzeug, um schnell vier bis sechs verschiedene Kerne auszustechen und jeden gestanzten Kern schnell in 0,06 ml eiskalten Proteinextraktionspuffer in das entsprechend gekennzeichnete Mikrozentrifugenrohr mit Proteusinhibitoren und Phosphataseinhibitoren für 60 Minuten einzutauchen.
Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die extrahierten Kerne in einer gekühlten Minizentrifuge und übertragen Sie mit einer Mikropipette sorgfältig 0,055 ml Überstand von jedem Rohr in das entsprechende vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr auf Eis. Vor der negativen Lagerung von 20 Grad Celsius 0,012 ml Überstand aus jedem Proteinstockrohr in die entsprechende 0,5 ml vorgekühlte Röhre auf Eis für die erste Probenvorbereitung übertragen. Um die Proben für die Messung des kapillaren Proteins vorzubereiten, fügen Sie 0,003 ml Master-Mix-Reagenz aus einem Proteinlyse-Kit zu jeder der Proben in den 0,5 ml-markierten Röhrchen hinzu.
Als nächstes fügen Sie 0,004 ml Master-Mix-Reagenz zu einer biotinylierten Molekulargewichtsleiterlösung in 0,016 ml entionisiertem Wasser hinzu und denaturieren die Leiter- und Proteinextraktproben in einem 95 Grad Celsius-Wärmeblock, wodurch alle Rohre nach fünf Minuten bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für die Signalproteinanalyse 0,01 ml frisch zubereitete Luminolperoxidlösung zu den Brunnen E-1 bis E-25 einer neuen automatisierten Westernplatte, 0,01 ml sekundärem Anti-Maus-Antikörper zu den Brunnen D-2 bis D-25 hinzufügen und 0,01 ml Streptavidin-Meerrettichperoxidase vom Kit auf gut D-1 hinzufügen. Fügen Sie 0,01 ml frisch zubereiteten Primärantikörper in die Brunnen C-2 bis C-25 und 0,01 ml Antikörperverdünnungsmittel zwei Lösungen für die Bohrungen C-1 und B-1 bis B-25 hinzu.
Lassen Sie die Bohrungen der Reihe F leer und füllen Sie die fünf Fächer der drei Reihen unterhalb der F-Reihe mit 0,45 ml Waschpuffer. Als nächstes drehen Sie die gekühlten Proben 30 Sekunden lang kurz und fügen Sie 0,03 ml jeder Probe zu jedem Brunnen der Reihe A hinzu, beginnend mit A-2. Dann 0,005 ml der biotinylierten Molekulargewichtsleiter zu gut A-1 hinzufügen und die Platte für die Zentrifugation bedecken.
Während die Platte zentrifugiert ist, öffnen Sie eine neue Run-Datei in der automatisierten Western-Software und initiieren Sie einen molekularen Größentest. Geben Sie auf der Assay-Seite die Beispielnamen in jede Kapillare sowie die Namen der primären und sekundären Antikörper ein. Am Ende der Zentrifugation die Platte in das automatisierte Western-Instrument legen und die Abdeckung aus der Kapillarpatronenbox schälen.
Nach der Zentrifugation vergessen Sie nicht, Luftblasen zu untersuchen, denn Luftblasen in der Kapillare können den elektrophoretischen Strom blockieren und die ganze Runde ausfallen lassen. Setzen Sie die Patrone in die vorgesehene Position innerhalb des Geräts ein und schließen Sie die Tür. Klicken Sie auf Start.
Wenn Sie den Typ des Testes dazu auffragen, geben Sie den Namen des Experiments in das entsprechende Textfeld ein, und klicken Sie auf "OKAY". Wenn Sie vom aktivierten Ausführungsdatum und der ID-Nummer in der Ausführungsdatei aufgefordert werden, notieren Sie sich die Zeit, zu der die Ausführung endet. Entsorgen Sie am Ende des Laufs die Kapillarpatrone in die Schärfeentsorgung und die Platte in die Entsorgung biogefährlicher Stoffe.
Nach der Elektrophorese-Trennung, überprüfen Sie die Run-Dateien auf ImmunreaktivitätSpitzen von Antigenen bei 40 bis 43 Kilodalton, die für phosphorylierte eukaryotische Translation Initiationsfaktor 2A stehen. Wenn Molekulargewichtsspitzen dieser Größe fehlen, klicken Sie mit der rechten Maustaste unter die Kurve, und wählen Sie Molekulargewicht hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Größen und beliebigen Größen unterhalb der Kurve aufgezeichnet werden. Innerhalb der unprimeds Gewebeproben sind die bindungden Aminoglobulinproteinspiegel in den Kernen der Einsittbahn im Vergleich zu allen anderen Regionen signifikant höher.
Die Primierung des Darmgewebes mit Kolostrum verringert den bindungden Aminoglobulin-Proteinspiegel in den Kernen der Einsit-Track und hat keinen Einfluss auf paraventrikuläre Kerne und superoptische Kerne. Umgekehrt erhöht die Grundierung den Bindungs-Aminoglobulin-Proteinspiegel innerhalb der Kortex, der Striationskerne und der medialen präoptischen Kerne relativ zum nicht grundierten Gewebe, was bedeutet, dass die bindungden Aminoglobulin-Proteinspiegel in den verschiedenen getesteten Hirnkernen unterschiedlich auf Darmgrundierung reagieren und es noch kein nachgewiesenes Übersprechen zwischen den verschiedenen getesteten Kernen gibt. Eukaryotische Translation Initiationfaktor 2A und phosphorylierte eukaryotische Translation InitiationFaktor 2A Ebenen sind in der unprimed Zustand im Vergleich zu anderen Kernen erhöht.
Nach der Grundierung werden die Konzentrationen sowohl des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2A als auch des phosphorylierten eukaryotischen Translationinitiationsfaktors 2A im Vergleich zu Denkernen der einsamen Spur im Vergleich zu nicht grundiertem Gewebe reduziert. In allen anderen getesteten Kernen erhöht die Grundierung den Eukaryotischen Translationinitiationsfaktor 2A und den phosphorylierten eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 2A im Verhältnis zu nicht grundiertem Gewebe. Jedoch, Ebenen der phosphorylierten Proteinkinase-Rezeptor sind niedrig in unprimed Proben relativ zu grundierten Proben in Kernen der einsamen Spur, stark darauf hindeutet, dass eine andere Kinase an der Phosphorylierung der eukaryotischen Translation Initiationfaktor 2A beteiligt ist.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der postnatalen Entwicklung, um die Signalwege zu erforschen, die an Gewebewachstum und -differenzierung beteiligt sind und ob sie durch Säugen beeinflusst oder unabhängig vom Säugen sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüchtigen Reduktionsmitteln wie z. B. Dithiothreitol gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Vorbereitung in der chemischen Haube sollten bei der Vorbereitung dieses Verfahrens immer getroffen werden.
