يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنمية بعد الولادة حول الطريقة التي يؤثر بها مص الحليب على الإجهاد الذي يشير إلى الدماغ. ويمكن استخدام هذه التقنية لالتقاط مناطق محددة في الدماغ خلال فترة المجاعة الطبيعية الأولى ومقارنتها بالمناطق المعنية بعد وقت قصير من تغذية اللبأة الطبيعية الأولى. فهم كيف يؤثر الرضاعة الفسيولوجية للسلوك والعاطفة تمكن من استخدام خصم لمختلف المستقبلات خلال السابق vivo تحليل أنسجة الدماغ.
للحصول على اللكمات نوكلي، إزالة الجراء الفئران من ذيلهم مع اليد قفاز. بعد حصاد الدماغ، ضع العضو بأكمله بسرعة في قالب دماغ ميثيل الميثريلات في درجة حرارة الغرفة واستخدم على الفور شفرة حلاقة جديدة لصنع شرائح سميكة تبلغ 500 ميكرومتر من الأنسجة. وضع شرائح روسترال إلىcaudal في طبق بيتري كما يتم الحصول عليها للحفاظ على الاتجاه الصحيح من المقاطع.
عندما تم تقسيم الدماغ بأكمله ، بسرعة إضافة السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي دون الجلوكوز إلى الطبق واحتضان الشرائح لمدة 60 دقيقة في 28 إلى 30 درجة مئوية مع اثارة مستمرة على شاكر المدارية. استخدام أطلس الدماغ والمعالم التشريحية على كل نسيج لتحديد نواة الدماغ ليتم لكمة ووضع شريحة مع نوات الاهتمام في طبق بيتري جديد تحت مجهر تشريح. مرة واحدة تصور, استخدام أداة الكورس لكمة بسرعة من أربعة إلى ست نوات مختلفة وتزج بسرعة كل نواة لكمة في 0.06 مل من الجليد الباردة استخراج البروتين العازلة في أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المسمى بشكل مناسب تحتوي على مثبطات البروتين ومثبطات فوسفاتاز لمدة 60 دقيقة.
في نهاية الحضانة، الطرد المركزي النوى المستخرجة في جهاز طرد مركزي صغير المبردة، واستخدام ماصة صغيرة لنقل بعناية 0.055 مل من فوق كل أنبوب في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل مناسبة قبل التبريد على الجليد. قبل التخزين السلبي 20 درجة مئوية، نقل 0.012 مل من متان من كل أنبوب مخزون البروتين في أنبوب 0.5 مل مناسبة قبل تبريد على الجليد لإعداد العينة الأولى. لإعداد العينات لقياس البروتين في الشعيرات الدموية، إضافة 0.003 مل من مُكْشف المزيج الرئيسي من مجموعة بروتينية إلى كل من العينات في الأنابيب التي تحمل 0.5 مل.
بعد ذلك، أضف 0.004 مل من كاشف المزيج الرئيسي إلى محلول سلم الوزن الجزيئي الحيوي في 0.016 مل من المياه الأيونية، وتحريف عينات مسالم ومستخرج البروتين في كتلة حرارة 95 درجة مئوية، وتخزين جميع الأنابيب عند أربع درجات مئوية بعد خمس دقائق. لتحليل بروتين الإشارة، إضافة 0.01 مل من محلول بيروكسيد المضيء الطازجة المعدة إلى الآبار E-1 إلى E-25 من لوحة غربية آلية جديدة، 0.01 مل من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس إلى الآبار D-2 إلى D-25، وإضافة 0.01 مل من الفرس بيرويداوس streptavidin من مجموعة إلى D-1. إضافة 0.01 مل من الأجسام المضادة الأولية الطازجة المعدة في الآبار C-2 إلى C-25، و0.01 مل من الأجسام المضادة diluent حل اثنين إلى الآبار C-1 و B-1 إلى B-25.
اترك الصف F الآبار فارغة وملء المقصورات الخمسة من ثلاثة صفوف تحت الصف F مع 0.45 مل من العازلة الغسيل. بعد ذلك، تدور لفترة وجيزة عينات المبردة لمدة 30 ثانية وإضافة 0.03 مل من كل عينة إلى كل بئر من الصف A، بدءا من A-2. ثم، إضافة 0.005 مل من سلم الوزن الجزيئي biotinylated إلى A-1 جيدا وتغطية لوحة للطرد المركزي.
في حين يتم طرد اللوحة ، افتح ملف تشغيل جديد في البرامج المرتبطة الغربية الآلية وبدء مقايسة الحجم الجزيئي. في صفحة الفحص، أدخل أسماء العينات في كل شعرية بالإضافة إلى أسماء الأجسام المضادة الأولية والثانوية. في نهاية الطرد المركزي، ضع اللوحة في الأداة الغربية الآلية وقشر الغطاء من صندوق خرطوشة الشعيرات الدموية.
بعد الطرد المركزي، لا تنسى أن تفقد لفقاعات الهواء، لأن فقاعات الهواء في الشعيرات الدموية يمكن أن تمنع التيار الكهربائي وتفشل الجولة بأكملها. أدخل الكارتريدج في الموضع المعين داخل الجهاز واغلق الباب. انقر فوق ابدأ.
عند مطالبتك بنوع الفحص، أدخل اسم التجربة في مربع النص المناسب وانقر فوق Okay. عند المطالبة من قبل تاريخ التشغيل تنشيط ورقم المعرف على ملف التشغيل، دوّن ملاحظة عن الوقت الذي ينتهي فيه التشغيل. في نهاية المدى، والتخلص من خرطوشة الشعيرات الدموية في التخلص الحادة وطبق في التخلص من المواد الحية الخطر.
بعد فصل الكهرباء، والتحقق من تشغيل الملفات لقمم التفاعل المناعي من المستضدات في 40 إلى 43 كيلودالتون التي تقف على الفوسفور eukaryotic بدء الترجمة عامل 2A. حيث ذروة الوزن الجزيئية من هذا الحجم مفقودة، انقر بزر الماوس الأيمن أدناه منحنى وحدد إضافة الوزن الجزيئي إلى الذروة لضمان أن يتم تسجيل الأحجام والكميات التعسفية تحت المنحنى. داخل عينات الأنسجة unprimeds، مستويات بروتين الجلوبيولين الأمينية ملزمة في نوى المسار الانفرادي هي أعلى بكثير بالمقارنة مع جميع المناطق الأخرى.
فتيلة من أنسجة الأمعاء مع اللبأ يقلل من مستويات بروتين الجلوبيولين الأمينية ملزمة في نوى المسار الانفرادي وليس له أي تأثير على النوى البارافينية والنوية فائقة البصرية. وعلى العكس من ذلك، يزيد فتيلة مستويات بروتين الجلوبيولين الأمينية الملزمة داخل القشرة، نواة التصدع، والنوى المسبقة الوسيطة نسبة إلى الأنسجة غير المخيّمة، مما يعني أن مستويات بروتين الجلوبيولين الأمينية الملزمة في مختلف نوى الدماغ المختبرة تستجيب بشكل مختلف لالإشاتية الأمعاء وليس هناك بعد أي حديث متقاطع واضح بين مختلف النواة التي تم اختبارها. إن عامل بدء الترجمة النيكي 2A وعامل بدء الترجمة eukaryotic الفوسفوري 2A مستويات مرتفعة في حالة غير الأولية نسبة إلى النوى الأخرى.
بعد فتيلة، يتم تخفيض مستويات كل من بداية بدء الترجمة eukaryotic عامل 2A وفسفورية مبدأ بدء الترجمة eukaryotic 2A نسبة إلى نوات المسار الانفرادي مقارنة مع الأنسجة غير الأولية. في جميع النوى المختبرة الأخرى، يزيد فتيلة مستويات بدء الترجمة eukaryotic عامل 2A وفسفوريديلي مبدأ بدء الترجمة eukaryotic 2A نسبة إلى الأنسجة غير الأولية. ومع ذلك، مستويات مستقبلات كيناز البروتين الفوسفوري منخفضة في العينات غير الأولية نسبة إلى عينات مهيأة في نوات المسار الانفرادي، مما يشير بقوة إلى أن كيناز آخر تشارك في الفوسفور من عامل بدء الترجمة eukaryotic 2A.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التنمية بعد الولادة لاستكشاف مسارات الإشارات المشاركة في نمو الأنسجة والتمايز وما إذا كانت تتأثر أو مستقلة عن الرضاعة. لا ننسى أن العمل مع وكلاء خفض متقلبة مثل, على سبيل المثال, dithiothreitol, يمكن أن تكون خطرة, وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات مثل إعداد في غطاء محرك السيارة الكيميائية عند إعداد هذا الإجراء.
