Este proyecto fue apoyo en parte por la Universidad de Johns Hopkins, oficina del Rector a través de la iniciativa científica de puerta de enlace.

Nota: Metagenómica ADN es purificado de suelo (Condado de Baltimore, Maryland) con un aislamiento de genomic de suelo disponible en el mercado kit (véase Tabla de materiales). Utilizando un espectrofotómetro UV (véase Tabla de materiales), el ADN genómico purificado debe tener una proporción de 260/280 (nm) &#62; 1.8 y una proporción de 260/230 entre 2.0-2.2 para asegurar que la muestra está libre de contaminantes. La cantidad de la DNA genomic para las gamas de 200 NS ng 2 μg.
1. método de preparación de la biblioteca rápido (protocolo corto)
Nota: Este es un protocolo corto. Para el kit de secuenciación rápida Consulte la Tabla de materiales .
<ol>
	<li>De 0,2 mL tubo de paredes delgadas (véase Tabla de materiales) Añadir 200 ng de alto peso molecular ADN en una final de volumen de 7.5 μl de agua destilada.</li>
	<li>Añadir 2,5 μl de mezcla de fragmentación (FM) desde el kit de biblioteca rápida preparación y mezclar suavemente por inversión. Centrífuga de pulso a la desactivación (1.000 x g durante 5 s).</li>
	<li>Coloque la muestra en un termociclador (véase Tabla de materiales) para una ronda a 30 ° C durante 1 min seguido de 75 ° C durante 1 minuto Retire el tubo y pulso centrífuga para girar por la muestra.</li>
	<li>Añadir 1 μl de adaptador rápido y 0,2 μl de la mezcla principal de blunt/TA ligasa y luego almacenar la biblioteca adaptada y anclada en el hielo. Nota: Si utiliza el protocolo corto proceda al paso 8</li>
</ol>
2. ligadura secuencia de protocolo (protocolo largo): Fragmentación del ADN de metagenómica
Nota: Ver Tabla de materiales para el kit de secuenciación de la ligadura.
<ol>
	<li>Diluir 1 μg de ADN genómico purificado a un volumen final de 46 μl de agua desionizada.</li>
	<li>Transferencia de la muestra a una fragmentación del ADN del tubo (véase Tabla de materiales) y centrifugue durante 1 min a temperatura ambiente a 8.000 x g utilizando una microcentrífuga (véase Tabla de materiales) para producir fragmentos genomic ~ 8 kb. Asegúrese de que ha pasado todo el líquido en el tubo de colección.</li>
	<li>Invertir el tubo de la fragmentación, retorno a la centrífuga y centrifugue durante 1 minuto para recoger el ADN genómico fragmentado en la cámara baja.</li>
	<li>Transferir el ADN genómico fragmentado a un tubo de 1,5 mL estéril bajo ADN vinculante y analizar una porción en un gel de agarosa de bajo porcentaje (0,6%) para confirmar la fragmentación &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. fragmentación de ADN genómico preparación final
<ol>
	<li>Con 800 ng de ADN genómico fragmentado en 45 μl de agua desionizada, agregue 7 μl finales de preparación para la reacción (véase Tabla de materiales), mezcla de enzima de 3 μl de tampón (véase Tabla de materiales) y 5 μl de nucleasa agua libre.</li>
	<li>Mezcla por inversión y pulso centrífuga (1.000 x g durante 5 s).</li>
	<li>Transferir la muestra a un tubo de paredes delgadas de 0.2 mL e incubar la muestra durante 5 minutos a 20 ° C, seguido por la incubación a 65 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrífuga de pulso para llevar contenido a la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja ADN vinculante.</li>
	<li>Preparar bolas magnéticas (véase tabla de materiales). Agregar 60 μL de granos resuspendidos a la reacción de preparación final de paso 3.5 y mezclar mediante pipeteo.</li>
	<li>Incubar en un mezclador rotador a 100 rpm (véase Tabla de materiales) por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pulso Centrifugue la muestra a los granos de la pelotilla, luego coloque la muestra junto al imán.</li>
	<li>Una vez que los granos se adhieren al imán, pipetee sobrenadante y desechar.</li>
	<li>Retire el tubo de las perlas de imán y lavado con 200 μL de etanol al 70% recién preparada transfiriendo suavemente la muestra altibajos.</li>
	<li>Centrífuga de pulso para los granos de la pelotilla y volver al imán.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y deséchelo. Repetir el lavado con 200 μL de etanol al 70%.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de retorno al imán y quitar todo el lavado de etanol 70%.</li>
	<li>Con la tapa del tubo de microcentrífuga abierta, seque los granos al aire durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el tubo del imán y suspender el sedimento en 31 μl de agua estéril, libre de nucleasas. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Regresar el tubo al imán hasta que todos los granos han peleteado y el efluente es claro.</li>
	<li>Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Utilizando 1 μl de muestra, cuantificar el ADN preparado final utilizando un espectrofotómetro UV a 260 nm (véase Tabla de materiales). Nota: La recuperación por ciento debe ser ~ 70% (700 ng) de una concentración inicial de 1 μg de ADN genómico.</li>
</ol>
4. adaptador y correa además de fragmentos de ADN genómico preparado final
<ol>
	<li>Mezcle el ligase de la blunt/TA tubos de master mix por inversión y luego pulso centrífuga para dar contenido a la parte inferior.</li>
	<li>Añadir 20 μl de mezcla de adaptador y 50 μl de la mezcla principal de ligadura blunt/TA con 30 μl de ADN preparado final.</li>
	<li>Mezclar por inversión, centrífuga de pulso e incubar 10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>
5. magnético Bead preparación
<ol>
	<li>Vórtice de los granos y luego transfiera 50 μl de suspensión granos a una microcentrífuga de 1.5 mL del tubo.</li>
	<li>Coloque el tubo en el imán para que sedimenten los granos hasta que el eluido se borra.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y deséchelo.</li>
	<li>Añada 100 μl de tampón de unión del grano (véase Tabla de materiales para el kit de grano) para las cuentas del vórtice para suspender de nuevo los granos, los granos en el imán de la pelotilla, quite el sobrenadante y deséchelo. Repetir el lavado con 100 μl de tampón de Unión.</li>
	<li>Añada 100 μl de tampón de unión del grano a los granos lavados. Vortex para suspender de nuevo las cuentas.</li>
</ol>
6. Biblioteca depuración
<ol>
	<li>Usando una micropipeta P200, agregar 40 μl de granos del paso anterior a la DNA genomic adaptado/atado. Mezclar cuidadosamente la muestra mediante pipeteo.</li>
	<li>Incubar la muestra en un mezclador rotador a 100 rpm por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque la muestra en el imán y permitir que las cuentas resolver. Pipeta del sobrenadante y deséchelo.</li>
	<li>Resuspender los granos en 140 μl de tampón de unión del grano mediante pipeteo. Coloque la muestra contra el imán, deseche el sobrenadante y lavar nuevamente con otro 140 μl de tampón de unión de grano.</li>
	<li>Pulso el tubo de centrífuga, coloque el tubo en el imán para 2 minutos retirar el tampón de Unión restantes grano pellets.</li>
</ol>
7. elución de biblioteca a partir de granos de imán
<ol>
	<li>Resuspender las bolas magnéticas en 15 μl de tampón de elución mediante pipeteo. Incubar la muestra durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el tubo contra el imán para que sedimenten los granos.</li></ol>Cuando la solución limpia, quitar 15 μl de eluato y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y coloque la muestra en hielo.
	<li>Cuantificar la biblioteca utilizando un espectrofotómetro UV. Nota: La recuperación por ciento debe ser ~ 25% (250 ng) de una concentración inicial de 1 μg de ADN genómico.</li>

8. a partir de un gestión/Control de calidad
<ol>
	<li>Retire la célula de flujo de embalaje y coloque la celda de flujo para el secuenciador portátil y en tiempo real (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Instale el secuenciador a un ordenador mediante un cable USB y ejecute el software de secuenciación (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Haga clic en "Conectar" dispositivo a través del software de la secuencia, seleccione "NC_Platform_QC.py" y haga clic en "Inicio".</li>
	<li>El control de calidad (QC) toma aproximadamente 6-7 min para completar; buscar un 'mar verde' (grandes áreas de la producción) en la lectura del control de calidad para confirmar que hay suficientes poros activos (&#62; 800) para la secuenciación de ADN.</li>
</ol>
9. a partir de un funcionamiento de la secuencia
<ol>
	<li>Abrir el programa de secuenciación; aparecerá un cuadro de diálogo. En el cuadro ID de muestra, nombre de la muestra.</li>
	<li>Haga clic en la casilla "ID de celda de flujo" e introduzca el código que se encuentra en la etiqueta en la parte superior de la celda de flujo.</li>
	<li>Abra la tapa de la célula de flujo y luego deslice la tapa del puerto muestra a la derecha (sentido horario) para que el puerto de la muestra es visible. Una vez que el puerto está abierto, verifique para una pequeña burbuja. Quitar unos microlitros de tampón como la burbuja.</li>
	<li>Verifique para asegurarse que no hay almacenador intermediario a través de la matriz del sensor. Hacer el búfer de cebado mezclando 480 μl de funcionamiento amortiguador de combustible (RBF-1, ver la Tabla de materiales) (Asegúrese de mezclar primero) con 520 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Añadir 800 μl de la solución de cebado en el puerto de cebado. Levante la cubierta del "SpotOn" para hacerla accesible.</li>
	<li>Después de 5 min, agregar un adicional 200 μL de tampón de cebado en el puerto de cebado.</li>
</ol>
10. carga de la biblioteca
<ol>
	<li>Antes de preparar el lugar de la biblioteca los siguientes reactivos en el hielo: RBF-1 (desde el kit de secuenciación), adaptado y ató la biblioteca y biblioteca cargando granos (LLB; desde el kit de secuenciación).</li>
	<li>Añadir a un tubo de centrífuga 0.2ml, 25,5 μl de RBF y 12 μl de agua libre de nucleasa mantenerse a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mezclar la LLB transfiriendo hacia arriba y abajo. Añadir μl 26.5 de la LLB al tubo de 0,2 μl. Mezclar los reactivos mediante pipeteo arriba y abajo. Nota: La abogado tiende a instalarse fuera de la mezcla.</li>
	<li>Añadir 11 μl de la biblioteca adaptada y atada al tubo de 0,2 μl. Mezclar por inversión y vuelta por centrifugación de pulso.</li>
	<li>Añadir 75 μl de la muestra del paso 9.4 al puerto "SpotOn" gota a gota. Asegúrese de que cada gota fluye en el puerto antes de añadir el siguiente.</li>
	<li>Cuidadosamente y a colocar la tapa del puerto de muestra para que el mismo entra en el puerto y vuelva a colocar la tapa del dispositivo.</li>
</ol>
11. a partir de una secuencia de comandos de protocolo de Software de secuenciación
<ol>
	<li>Abrir el menú desplegable debajo de "Seleccionar programa" y seleccionar "secuencia de 48 horas."</li>
	<li>Haga clic en el botón "Ejecutar" para iniciar la secuencia de comandos.</li>
	<li>Compruebe los resultados de la exploración Mux registrados en la secuencia de notificación para el número de poros activos en la exploración de MUX. Nota: Este número puede diferir del número de poros en la serie de CC y una gran diferencia puede indicar un problema.<ol>
		<li>Si hay una reducción significativa de los poros activos de la carrera de control de calidad, reiniciar el software y si todavía hay una diferencia significativa, reiniciar el equipo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Compruebe que la temperatura del disipador de calor es de 34 ° C según la secuencia de comandos de software de secuenciación. Nota: Si la temperatura es no a 34 ° C entonces no habrá suficientes poros activos para la carrera.</li>
	<li>Comprobar el histograma de leerlas largos para determinar si las longitudes de la secuencia son esperados y apropiado para el diseño experimental.</li>
	<li>Cierre al agente escritorio mediante 'cerrar x.' dejar el software de secuenciación por el cierre de la web GUI. Desconecte el dispositivo del ordenador.</li>
</ol>
12. Análisis de gestión y resultados
Nota: Durante la ejecución de la secuencia, los datos pueden controlarse utilizando el programa de "Ver informe" mediante el agente de escritorio. Durante o después de la carrera completa, los archivos están disponibles en un formato de archivo en el → de datos Lee → pasar carpeta (por defecto) de FAST5. Si esta carpeta está abierta mientras la secuencia está activa, el equipo podría congelarse.
<ol>
	<li>Para ver y manipular secuencias, descargar un "HDFViewer".</li>
	<li>Para ver los archivos de la secuencia, directamente abre la HDF espectador → abierto datos carpeta → selecciona que todos los archivos tipos → seleccione C: drive (por defecto) → seleccionar datos → seleccionar lecturas → select pass.</li>
	<li>Busque y seleccione el fichero FASTQ en el menú desplegable izquierdo; los archivos se abrirán y pueden guardarse en formato FASTQ. Nota: A los efectos de la experiencia del estudiante, secuencias de 350 nucleótidos o más fueron seleccionadas para su posterior análisis. Salida de la base llamada permite al usuario ordenar Lee secuencia basado en el tamaño. Archivos FASTQ pueden analizarse mediante BLAST (NCBI) u otros programas de Bioinformática.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

Se han generado muchos métodos de secuencia de la generación siguiente y cada uno depende de secuenciación por síntesis pero las plataformas de detección para la identificación de nucleótidos difieren. NS, la adición más reciente al mercado, utiliza un método diferente, que no requiere una reacción de secuenciación o etiquetado como nucleótidos. Este método aprovecha diferencial de carga de nucleótidos ya incorporados su paso a través de un poro electrified. La identificación de cada nucleótido se produce por la modulación de la corriente eléctrica por las diferentes bases a medida que pasan a través de la nanopore. Este sistema multiplexado permite muchos fragmentos de la secuencia a la vez. Mediante la secuenciación de ambos filamentos de la DNA, se aumenta perceptiblemente la exactitud de la secuencia y el software de secuenciación, que puede ser cargado en un ordenador portátil, procesa las señales y proporciona la información de secuencia que puede ser analizada.
Pirosecuenciación, una secuenciación por el método de síntesis (SBS), detección de la específica base incorporada en la plantilla depende el ensayo de luciferasa y la generación de señal quimioluminiscente8. En secuencia de semiconductor de ion, el ion de hidrógeno liberado, que disminuye el pH es detectado por un sensor de ion9. Secuencia en tiempo real a la sola molécula depende el cero modo onda guía (ZMW)10, que se ilumina para la detección de una molécula fluorescente etiquetada para el nucleótido incorporado. SBS utiliza un método único para amplificar el ADN diana que los racimos de secuencias únicas son generados13. Detección de la nucleótido añadido se realiza cuando se registra la fluorescencia de los nucleótidos etiquetados. NS por otro lado tiene la ventaja sobre otros métodos en que requiere recursos técnicos limitados, es portable, produce la larga secuencia de lecturas, no requiere previa amplificación del ADN y puede ser operado a un costo reducido en comparación con otros métodos. Nuestros alumnos encuentran el protocolo preparación de biblioteca más nuevo, rápido sencillo y favorable a una clase de laboratorio de tres horas. Algunos de los problemas que encontramos eran burbujas en la célula de flujo que fueron difíciles de eliminar, requiere potencia de los ordenadores significativo (un terabyte de almacenamiento de información), es la corriente de salida de datos en un archivo de FAST5 y la célula de flujo de la secuencia tiene una vida útil limitada antes de que se deteriora. Además, otras desventajas del Protocolo de secuenciación NS ligadura (protocolo largo) es que requiere varios pasos de preparación de la biblioteca, requiere conocimientos en técnicas de biología molecular y genera fidelidad de secuencia reducida en comparación con algunos metodologías de la secuencia3. Sin embargo, recientes avances con el nuevo kit de preparación de biblioteca rápida requiere sólo 10 minutos para la preparación de la biblioteca y ha demostrado una tasa de error de secuencia de la reducción. El nuevo método de preparación de biblioteca era muy favorable para el uso en una clase de laboratorio.
Hay varios pasos críticos en el protocolo, especialmente en el control de calidad de la célula de flujo. Esto incluye realizar un control de calidad inicial dentro de los cinco días de la recepción de la célula de flujo y utilizando dentro de 8 semanas. Aunque hemos utilizado células de caudalómetro que estaban más allá de 8 semanas, se reduce el número de poros abiertos, activo. Es importante que los experimentos se planean para una línea de tiempo donde se logra la máxima utilización de las células de flujo. Hemos utilizado el protocolo de limpieza y volver a utilizar las células de flujo con éxito.
Investigando la metagenómica del suelo representa un reservorio genético sin explotar de la diversidad microbiana. Por ejemplo, un gramo de suelo se estima contienen entre 107 - 109 células procariotas14. Por otra parte, organismos del suelo son una fuente principal de nuevos productos naturales, enzimas y antibióticos. Así, análisis de la secuencia del DNA de suelo metagenómica representa una valiosa herramienta educacional para los estudiantes en cada nivel de enseñanza. La tecnología de NS facilidad de uso y bajo costo hacer este sistema una herramienta de enseñanza muy eficaz. Los estudiantes pueden secuencia de muestras ambientales y al terminar la secuencia utilice herramientas bioinformáticas disponibles para identificar y caracterizar secuencias de microbios y metagenómica en muestras de prueba. Usando la tecnología de NS, los estudiantes tienen experiencia práctica, que se hasta ahora de alcanzar para el uso en los cursos de laboratorio debido a los avanzados conocimientos técnicos y altos costos de reactivos, equipos y mantenimiento en otras plataformas de secuenciación. Uno de nuestros estudiantes (J. Harrison, comunicación personal) había divulgado recientemente, el uso de esta tecnología en un proyecto de monitoreo ambiental de suelos agrícolas. Esperamos que habrá muchas más aplicaciones de esta tecnología en el espacio de la educación.

El objetivo de este procedimiento es demostrar los pasos necesarios para la preparación de una biblioteca ambiental de la DNA para la secuenciación, la utilización de un dispositivo de secuencia nanopore flujo celular y realizar análisis de las secuencias de ADN generadas con software de sistema y el centro nacional para las herramientas de Bioinformática de información biotecnológica (NCBI) identificar especies microbianas en el suelo. Actualmente, la mayoría plataformas de secuenciación de ADN requieren una inversión importante en capacitación técnica y de instrumentación compleja, que no es factible en entornos pobres de recursos o en aplicaciones de campo. La plataforma de secuenciación (NS) nanopore elimina estos problemas con un costo efectivo, sencillo de usar protocolo de preparación de biblioteca y un dispositivo portátil secuenciar y analizar una variedad de diferentes tipos de ácidos nucleicos1,3. Hemos incorporado la plataforma NS en varias clases de laboratorio para estudiantes de maestría.
Nanopore tecnología de biomoléculas de secuenciación ha demostrado amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos bacterianos y virales1,2,6, biodiversidad ambiental estudios, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genómico3,5y caracterización de la resistencia bacteriana a los antibióticos4. NS es un método rápido y preciso a los ácidos nucleicos secuencia que se basa en el principio de la "secuencia del filamento" mediante la detección de perturbaciones eléctricas por las bases de nucleótidos individuales cuando la sola DNA trenzada atraviesa un nanopore insertado en un electrificado membrana de polímero sintético. Los pasos involucrados en la preparación de ADN para NS incluyen fragmentación del genoma y reparación final 3' dA-tailing de fragmentos genómicos, adaptador y correa recocido al ADN, purificación de DNA a biblioteca y cargar la biblioteca en el dispositivo de la célula de flujo nanopore. Fragmentación del genoma en tamaños de 8 kb es logrado por centrifugación a 1-2 μg de ADN genómico a través de un tubo de g de fragmentación. Los extremos genómicos fragmentados luego reparados y cola con dA poli usando un kit disponible comercialmente. Las secuencias solo adaptador trenzado, que son compatibles con la proteína motora nanopore, se agregan a los extremos de ADN que se utilizan para guiar la secuencia de ADN a través de nanopore (figura 1). Las secuencias de anclaje son necesarias para la purificación de ADN y para la localización de las moléculas de ADN a la membrana de poro. La horquilla se genera por la ligadura de un adaptador de horquilla a un extremo de la biblioteca de cola dA. Las estructuras de la horquilla en los extremos de ADN permite la lectura de las hebras sentido y antisentido del ADN paso por nanopore (figura 2). La biblioteca genomic preparada se purifica después de la reacción usando granos de estreptavidina utilizando un campo magnético, seguido por la carga de la muestra en la celda de flujo nanopore para análisis.
El ADN secuenciado se evalúa por la calidad y Lee de la secuencia que es aceptable para el análisis es luego sometido a varias herramientas de bioinformática para identificar microbios. Las secuencias se "traducen" FASTQ de un formato de FAST5. En el formato FASTQ, las secuencias pueden utilizarse luego en el análisis BLAST.

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&amp;nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

Este artículo describe los pasos para la construcción de una biblioteca de ADN de suelo, preparación y uso de la célula de flujo nanopore y análisis de las secuencias de ADN identificados usando software de computadora. Secuencia de la DNA Nanopore es una técnica flexible que permite la secuenciación del genoma microbiano rápido identificar especies bacterianas y virales, para caracterizar las cepas bacterianas y para detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los antibióticos. Las ventajas de nanopore sequencing (NS) para Ciencias de la vida son su baja complejidad, coste reducido y rápida secuencia en tiempo real del ADN genómico purificado, amplicones PCR, las muestras de cDNA o RNA. NS es un ejemplo de "secuencia de filamento", que consiste en la secuencia DNA guiando una sola molécula de DNA trenzada a través de un nanopore que se inserta en la membrana de un polímero sintético. La membrana tiene una corriente eléctrica aplicada a través de él, por lo que las bases individuales paso a través de la nanopore la corriente eléctrica se interrumpe en diversos grados por las cuatro bases de nucleótidos. La identificación de cada nucleótido se presenta detectando la modulación característica de la corriente eléctrica por las diferentes bases que pasan por el nanopore. El sistema NS consiste en un dispositivo portátil, dispositivo portátil y una celda de flujo desechable que contiene una matriz nanopore alimentado por USB. El dispositivo portátil se conecta a una computadora portátil estándar que lee y graba la secuencia del ADN utilizando el software de computadora.

La tecnología de diseño y nanopore experimental proporciona un método rápido y barato para que los estudiantes la secuencia de ADN de suelo. El funcionamiento representativo pasa los parámetros de control de calidad con más de 800 poros disponibles para la secuencia. La carrera resultó en más 125.000 lecturas disponibles para el estudio con una longitud de la secuencia media de 5,38 kb. Secuencias se dan una puntuación de calidad y luego se analizaron solamente las secuencias con resultados aceptables. Como la salida de la secuencia de la reacción es en FAST5 formato, que no es aceptado por programas tales como BLAST (NCBI), las secuencias fueron vistas en el visor de HDF que convierte las secuencias en formato FASTQ, que es compatible para el análisis de la explosión. En el futuro iteraciones del software, los datos estarán disponibles en formato FASTQ, eliminando la necesidad para el espectador HDF. Ver complementarias figuras 1, 2 y 3.
50 secuencias de más de 350 nucleótidos de longitud fueron sometidos a análisis de BLASTN (nucleótidos base de datos de nucleótidos) o BLASTX (nucleótidos traducidos en secuencia del aminoácido) (NCBI) para identificar organismos en la muestra de suelo. Dado el tiempo de las limitaciones de la clase y que el enfoque del curso es en métodos de laboratorio y no de bioinformática, tenemos a los estudiantes analizar secuencias dentro de estos parámetros. Nuestras clases de Bioinformática pueden utilizar los datos para el desarrollo de herramientas de análisis de tubería. Este nivel de análisis bioinformáticos no está cubierto en la clase de laboratorio en. Tabla 1 es una lista de los organismos que fueron identificados con los valores de e del e-04 menos de 4. En general, e-valores inferiores a 4 e-04 indican fuerte semejanza entre la secuencia de entrada (consulta) y la secuencia coincidente. Los organismos identificados por BLASTN (contra la base de datos no redundante (nr)) son de una gran variedad de especies y están disponibles para más genómica y análisis de proteínas. Esta muestra de suelo, que vino de un jardín en el Condado de Baltimore, MD nunca había sido probada, por lo que no había ningún dato anterior de que determinar cuáles podrían ser los organismos en el suelo. BLASTN (contra la base de datos de nr) el análisis también indica que hubo secuencias con ninguna similitud en la base de datos de nr. Para determinar si estas secuencias verdaderamente novedosas, es necesario un estudio más profundo. Análisis de varias secuencias por BLASTX reveló varias proteínas de organismos no representados en el análisis BLASTN. La tabla 2 enumera varias proteínas posible incluyendo endopeptidasas y ATPasas como proteínas. Usando esta biblioteca de secuencias, los estudiantes tienen la oportunidad de utilizar herramientas bioinformáticas más sofisticadas para realizar análisis adicional, si dirigida por el instructor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparación de la biblioteca genómica. Pasos para la preparación de la biblioteca genómica de ADN para secuenciación nanopore tecnología. Esta cifra ha sido modificada con los permisos necesarios. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figura 2 . Esquema de secuencia de la DNA usando un nanopore. ADN pasa a través de una membrana nanopore con identificación base y generación de señal eléctrica. Esta cifra ha sido modificada con los permisos necesarios. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismo</td>
			<td>valor de e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrativorens Hyphomicrobium</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novella</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denitrificans Hyphomicrobium</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: resultados de análisis BLASTN selectos. Secuencias de la DNA de la metagenómica de suelo sujetada a búsqueda de semejanza BLASTN contra la base de datos de nucleótidos redundante NCBI. Los datos registrados tienen valores e de 4 x e-4 o menos.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteína</td>
			<td>Organismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteína hipotética</td>
			<td>Acidobacter bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM metiltransferasa dependiente</td>
			<td>Denitrificans H.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPasa</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidasa</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteína de lisis</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: resultados de análisis BLASTX selectos. Secuencias de la DNA de la metagenómica de suelo sujetada a búsqueda de semejanza BLASTX contra la base de datos de proteínas no redundantes de NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Suplementario Figura 1: resultados de la plataforma de control de calidad. Se presentan los resultados de la plataforma de control de calidad. En la esquina superior derecha están los resultados del control de calidad para los poros activos. Cada cuadrante de la célula de flujo se prueba para los poros activos. La Página principal es dinámica y cambia a medida que se prueba cada cuadrante. En este plazo, se detectaron poros solo 1.414.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Suplementario Figura 2: FAST5 convertir archivos a archivos FASTQ. Aquí a la derecha, está la salida de los datos de la ejecución de la secuencia. Cada línea representa una secuencia individual. El lado izquierdo de la figura muestra la secuencia destacada de la derecha, en el visor de HDF que convierte la secuencia en un archivo FASTQ que puede utilizarse para su posterior análisis. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Suplementario Figura 3: secuencia de ejemplo de FASTQ en visor de HDF. Esta secuencia (leído 803) está en un fichero FASTQ que convierte los datos de FAST5 en nucleótidos. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación nanopore es demostrado.

Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K vistas.  Johns Hopkins University. Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación ...

Video: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Análisis metagenomic de ensilaje

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Investigación

Genética

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

In situ detección Molecular de fitopatógenos transmitidos por el suelo mediante un sistema PCR en tiempo real Portable

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Medio ambiente

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Química

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biología

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

Visualización de la dinámica microbiana del ciclo del metano en los humedales costeros

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Muy largo leer la secuencia para el análisis de la DNA de Genomic entero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Bioingeniería

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.