Este protocolo llena un vacío técnico en nuestra capacidad de generar matrices de secuencias ultralartos. Nos permite examinar la complejidad del genoma que está limitada por los enfoques actuales de lectura corta en genómica. El método es único en rendimiento, robustez, versatilidad y potencial para integrarse con nuevas y prometedoras aplicaciones.
Es aplicable a diferentes materiales y se puede modular para diferentes tamaños instantáneos. Esta técnica ha comenzado a revolucionar el paisaje clínico. Su utilidad de diagnóstico en trastornos de expansión repetidas ha superado muchas deficiencias actuales.
Algunos registros de trasplantes han utilizado la escritura de HLA de alta resolución para obtener un mejor resultado clínico. Estos métodos proporcionan información de largo alcance previamente inaccesible, como la fase y la varianza estructural compleja. Junto con la lectura epigenética en una sola prueba, permitirá la medicina de precisión.
Es un protocolo largo con muchas técnicas nuevas y es difícil saber si está funcionando hasta la secuenciación final. Recomiendo practicar la carga en celdas de flujo antiguas antes de ejecutar muestras. Los colaboradores han dicho que algunas técnicas son confusas en comparación con los enfoques de lectura corta.
Específicamente, la extracción es más suave debido al ADN de alta calidad y alto peso molecular. Para comenzar la extracción de ADN HMW, primero agregue 200 microlitros de la suspensión celular a 10 mililitros de tampón de lelisis en un tubo de 50 mililitros. Luego, vórtice a la velocidad más alta durante tres segundos.
Y incubar la solución a 37 grados centígrados durante una hora. Al final de la incubación, agregue dos microlitros de RNS-A al lisato. Gire suavemente el tubo de 50 mililitros para mezclar la muestra e incubar a 37 grados centígrados durante una hora.
Después de la incubación, añadir 10 mililitros de la capa de fenol de la mezcla de alcohol fenol-cloroformo-isoamilo al lesato. Y coloque el tubo en un rotador a 20 rpm durante 10 minutos bajo una campana de humo. Después de la centrifugación con tubos de gel, verter cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 mililitros.
Luego, agregue 25 mililitros de hielo-frío 100%etanol, y gire suavemente el tubo a mano, hasta que el ADN se precipite. Dobla una punta de 20 microlitros para hacer un gancho. Usando el gancho, saque cuidadosamente el ADN de HMW y deje que el líquido caiga.
A continuación, coloque el ADN en un tubo de 50 mililitros que contenga 40 mililitros de 70% de etanol, e invierta suavemente el tubo tres veces para lavar el ADN. Para preparar la biblioteca mecánica basada en cizallamiento, utilice primero una jeringa sin aguja de 100 mililitros para aspirar a todo el ADN. A continuación, coloque una aguja de calibre 27 en la jeringa y expulse todo el ADN en el plato suavemente y lentamente.
Repita 29 veces. A continuación, agregue 143 microlitros de las perlas magnéticas re-suspendidas y 143 microlitros de la mezcla de reacción de reparación del ADN a un tubo. Deslice el tubo seis veces para mezclar suavemente, y coloque el tubo en un rotador a 20 rpm durante 30 minutos.
Centrifugar el tubo a 1000G durante dos segundos a temperatura ambiente para girar hacia abajo la muestra, y luego colocar el tubo en un bastidor magnético durante 10 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante mientras el tubo todavía está en el bastidor. Añadir 400 microlitros del 70% de etanol recién preparado.
Espere 30 segundos. Y luego retire el etanol. Luego, centrifuga el tubo a 1000G durante dos segundos a temperatura ambiente para girar hacia abajo de la muestra.
Vuelva a colocar el tubo en el bastidor magnético y retire cualquier etanol residual. Seque al aire el pellet durante 30 segundos. A continuación, retire el tubo del bastidor magnético y agregue 103 microlitros de tampón T-E.
A continuación, deslice suavemente el tubo para asegurarse de que las perlas estén cubiertas en el tampón y coloque el tubo en el rotador a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, vuelva a colocar el tubo en el bastidor magnético durante 10 minutos para peletizar las perlas. Utilice una punta de diámetro ancho P200 para transferir 100 microlitros del eluido a un tubo de 0,2 mililitros, y proceda a reparar las reacciones de ligadura de dA y de cola de adaptador.
Para preparar la biblioteca basada en la fragmentación de la transposasa, primero haga una reacción de etiquetado de ADN añadiendo 22 microlitros del ADN HMW, un microlitro de 10 Triss miliamlar, pH 8, con 0.02%Triton X-100, y 1 microlitro de la mezcla de fragmentación, a un tubo de 0,2 mililitros. A continuación, utilice una punta de agujero ancho P200 para mezclar la reacción seis veces, e incubar a 30 grados centígrados durante un minuto, seguido de 80 grados centígrados durante un minuto. Aguanta a cuatro grados centígrados.
Por último, utilice una punta de orificio ancho P200 para transferir la reacción a un tubo de 1,5 mililitros y agregue rápidamente 1 microlitro de mezcla de adaptador rápido. Utilice una punta de agujero ancho P200 para mezclar la reacción seis veces. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante una hora, y proceder a la secuenciación.
Para comenzar la secuenciación, primero inserte una nueva celda de flujo en uno de los canales del dispositivo Nanopore. A continuación, en el software de control de secuenciación que lo acompaña, marque la casilla de ubicación de la celda de flujo. Seleccione el tipo de celda de flujo correcto y haga clic en el flujo de trabajo de la celda de flujo de comprobación.
Haga clic en el botón de prueba de inicio para iniciar el análisis de control de calidad de la celda de flujo. A continuación, con una pipeta P1000 establecida en 100 microlitros, extraiga menos de 30 microlitros de búfer para eliminar burbujas de la celda de flujo. Agregue 30 microlitros de la mezcla de cebado para cubrir la parte superior del puerto de cebado para evitar la introducción de burbujas.
A continuación, pipetear 800 microlitros de la mezcla de cebado en el puerto de cebado para cargar la celda de flujo. Saque la punta cuando haya alrededor de 50 microlitros de la mezcla de cebado a la izquierda, y agregue el resto de la mezcla de cebado en la parte superior del puerto de cebado. A continuación, con una pipeta P1000, agregue 200 microlitros de la mezcla de cebado en la celda de flujo.
Luego, justo antes de la carga, utilice una pipeta P200 establecida en 80 microlitros para pipetear hacia arriba y hacia abajo en la biblioteca de ADN seis veces. Por último, cargue la combinación de bibliotecas en la celda de flujo a través del puerto de muestra y proceda a la secuenciación y al análisis de datos. El análisis de QC del ADN listo para la construcción de bibliotecas basadas en cizallamiento mecánico dio como resultado una relación de pureza de 260 a 280 de aproximadamente 1,9, y la proporción de 260 a 230 de aproximadamente 2,3, mostrando una buena muestra de ADN.
El mismo resultado se vio utilizando la construcción de bibliotecas basadas en la fragmentación de ADN listo para la transposasa. El control de calidad del tamaño del ADN HMW cizallado con aguja por electroforesis de gel de campo de pulso mostró que la mayoría del ADN HMW era mayor que 50 kilobases. Los resultados de cuatro corridas utilizando la célula HG00733 mostraron que el N50 de una biblioteca mecánica basada en cizallamiento era más corto que una biblioteca basada en la fragmentación de la transposasa.
Además, las cuatro carreras tenían más de 2300 lecturas con una longitud superior a 100 kilobases. La longitud máxima era más larga en las bibliotecas basadas en la fragmentación de la transposasa con su menor tiempo de preparación, en comparación con las bibliotecas basadas en cizallamiento mecánico. Las bibliotecas mecánicas basadas en cizallamiento produjeron lecturas más totales en comparación con las bibliotecas basadas en la fragmentación de la transposasa, lo que indica un mayor rendimiento.
Ambas bibliotecas mostraron una alta calidad consistente y más del 97% de sus bases totales estaban alineadas con el genoma de referencia humano. Las distribuciones de tamaño esperadas mostraron que las cuatro corridas tenían una gran proporción de datos superiores a 50 kilobases, mientras que las bibliotecas basadas en la fragmentación de la transposasa tenían una proporción más alta de lecturas ultralaridas. El objetivo general es mantener el ADN intacto, por lo que es importante evitar cualquier manejo duro del ADN.
Un factor clave que puede maximizar el valor del método es el análisis computacional. Nuestro equipo ha desarrollado una canalización de análisis de lectura larga llamada PICKY que puede detectar una gama completa de CV con alta sensibilidad. Abrirá nuevas vías a áreas emocionantes como la detección de vehículos eléctricos complejos y reordenamientos y modificaciones graduales a nivel de molécula única.
Esto mejorará en gran medida nuestra comprensión de la arquitectura del genoma. El fenol es muy corrosivo. Debe trabajar con ella en una campana de humos con equipo de protección personal, incluyendo guantes, gafas de seguridad, un abrigo de laboratorio, pantalones largos y zapatos.
