كان هذا المشروع الدعم جزئيا بجامعة جونز هوبكنز، مكتب قائد الشرطة العسكرية من خلال "بوابة مبادرة العلم".

ملاحظة: هو تنقية الحمض النووي الجينومية من التربة (مقاطعة بالتيمور، ميريلاند) باستخدام عزل الجينوم تربة متاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد). استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد)، ينبغي أن يكون تنقية الحمض النووي بنسبة (nm) 260/280 &#62; 1.8 ونسبة 260/230 بين 2.2 2.0 أؤكد أن العينة خالية من الملوثات. كمية الحمض النووي اللازمة لنطاقات NS من 200 نانوغرام إلى 2 ميكروغرام.
1. طريقة إعداد مكتبة السريع (بروتوكول قصيرة)
ملاحظة: هذا بروتوكول قصيرة. انظر الجدول للمواد الطقم التسلسل السريع.
<ol>
	<li>0.2 مل أنبوبة رقيقة الجدران (انظر الجدول للمواد) إضافة 200 نانوغرام من ارتفاع الوزن الجزيئي الدنا في نهائي لحجم 7.5 ميليلتر من الماء المقطر.</li>
	<li>إضافة 2.5 ميليلتر من تجزئة المزيج (FM) من مجموعة أدوات إعداد مكتبة السريع والمزيج بلطف بانعكاس. نبض أجهزة الطرد المركزي لزيادة ونقصان لأسفل (س 1,000 ز ل 5 ق).</li>
	<li>ضع العينة في ثيرموسيكلير (انظر الجدول للمواد) لجولة واحدة في 30 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها 75 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إزالة النابذة أنبوب ونبض تدور أسفل النموذج.</li>
	<li>إضافة 1 ميليلتر من المحول السريع و 0.2 ميليلتر بلانت/تا ليجاسى مزيج الرئيسي، وثم تخزين مكتبة تكييف والمربوطة بالثلج. ملاحظة: إذا كان استخدام بروتوكول قصيرة للانتقال إلى الخطوة 8</li>
</ol>
2-ربط تسلسل بروتوكول (طويلة): الجينومية تجزؤ الحمض النووي
ملاحظة: انظر الجدول للمواد الطقم تسلسل عملية ربط.
<ol>
	<li>تمييع 1 ميكروغرام لتنقية الحمض النووي لوحدة تخزين نهائي من 46 ميليلتر في المياه.</li>
	<li>نقل العينة إلى تفتيت الحمض النووي أنبوب (انظر الجدول للمواد) والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 8,000 س ز استخدام ميكروسينتريفوجي (انظر الجدول للمواد) لإنتاج أجزاء الجينوم ~ 8 كيلو بايت. تأكد من اجتاز جميع السائل في أنبوب جمع.</li>
	<li>عكس أنبوب التجزئة، العودة إلى أجهزة الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة جمع الحمض النووي الجينوم المجزأ إلى مجلس النواب.</li>
	<li>نقل الحمض النووي الجينوم المجزأ إلى أنبوب 1.5 مل عقيمة منخفضة-الحمض النووي ملزم، وتحليل جزء على نسبة مئوية منخفضة [اغروس] هلام (0.6 في المائة) للتأكد من التجزؤ إلى &#62; 30 كيلو بايت.</li>
</ol>
3-تجزئة الحمض النووي نهاية-إعداد
<ol>
	<li>استخدام 800 نانوغرام لتجزئة الحمض النووي في 45 ميليلتر من المياه، إضافة 7 ميليلتر الإعدادية نهاية رد المخزن المؤقت ميكس الإنزيم ميليلتر 3 (انظر الجدول للمواد)، (انظر الجدول للمواد)، و 5 ميليلتر من نوكلاس مجانية الماء.</li>
	<li>مزيج من قبل أجهزة الطرد المركزي انعكاس والنبض (ز 5 1,000 x s).</li>
	<li>نقل العينة إلى أنبوب 0.2 مل رقيقة الجدران، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية، تليها الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>نبض أجهزة الطرد المركزي جلب محتويات الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
	<li>نقل العينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي ربط الحمض النووي منخفضة 1.5 مل.</li>
	<li>إعداد حبات مغناطيسية (انظر الجدول للمواد). إضافة 60 ميليلتر من حبات حراكه إلى رد فعل الإعدادية نهاية من الخطوة 3.5 ومزيج من بيبيتينج.</li>
	<li>احتضان في خلاط المدورة 100 لفة في الدقيقة (انظر الجدول للمواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نبض الطرد المركزي عينة لبيليه الخرز، ثم وضع العينة بجوار المغناطيس.</li>
	<li>بمجرد التقيد الخرز بالمغناطيس، "الماصة؛" إيقاف المادة طافية وتجاهل.</li>
	<li>إزالة الأنبوب من الخرز المغناطيس، والمياه والصرف الصحي مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70% طازجة بلطف بيبيتينج العينة صعودا ونزولاً.</li>
	<li>نبض أجهزة الطرد المركزي بيليه الخرز والعودة إلى المغناطيس.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وتجاهل. كرر الخطوة الغسيل مرة أخرى باستخدام 200 ميليلتر من الإيثانول 70%.</li>
	<li>نبض الطرد المركزي الأنبوب، العودة إلى المغناطيس، وإزالة جميع الغسيل إيثانول 70%.</li>
	<li>فتح غطاء أنبوب ميكروسينتريفوجي، تسمح الخرز للهواء الجاف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة الأنبوب من المغناطيس وتعليق بيليه في 31 ميليلتر من المياه المعقمة، وخالية من نوكلياسي. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>العودة الأنبوب إلى المغناطيس حتى يكون القريبون كل الخرز والنذره الواضح.</li>
	<li>نقل النذرة بأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. 1 ميليلتر من نموذج، باستخدام قياس الحمض النووي هيأهم نهاية استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية في 260 نيوتن متر (انظر الجدول للمواد). ملاحظة: يجب أن يكون استرداد نسبة ~ 70% (700 نغ) من تركيز بداية من 1 ميكروغرام من الحمض النووي.</li>
</ol>
4-محول والحبل بالإضافة إلى شظايا من الحمض النووي الجينومي هيأهم نهاية
<ol>
	<li>مزج جميع ليجاسى بلانت/تا أنابيب مزيج الرئيسي بانعكاس، والنبض ثم الطرد المركزي جلب محتويات إلى الأسفل.</li>
	<li>استخدام 30 ميليلتر هيأهم نهاية الحمض النووي، إضافة 20 ميليلتر من مزيج محول، و 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط بلانت/تا.</li>
	<li>مزيج من انعكاس، نبض أجهزة الطرد المركزي، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
</ol>
5-المغناطيسية بead إعداد
<ol>
	<li>دوامة الخرز وثم نقل 50 ميليلتر من الخرز مع وقف التنفيذ 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب.</li>
	<li>ضع الأنبوب على المغناطيس بيليه الخرز حتى النذرة مسح.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وتجاهل.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر من حبة ملزمة المخزن المؤقت (انظر جدول المواد لطقم حبة) بيليه الخرز، دوامة ريسوسبيند الخرز، الخرز على المغناطيس وإزالة المادة طافية وتجاهل. تكرار الغسيل مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم حبة الخرز غسلها. الدوامة ريسوسبيند الخرز.</li>
</ol>
6-مكتبة تنقية
<ol>
	<li>استخدام ميكروبيبيتي P200، إضافة 40 ميليلتر من حبات من الخطوة السابقة إلى تكييف المربوطة المجينية الحمض النووي. خلط العينة بعناية قبل بيبيتينج.</li>
	<li>احتضان العينة في خلاط المدورة 100 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>وضع العينة على المغناطيس وتسمح الخرز تسوية. "الماصة؛" إيقاف المادة طافية وتجاهل.</li>
	<li>ريسوسبيند الخرز في ميليلتر 140 حبة ملزمة المخزن المؤقت قبل بيبيتينج. ضع العينة ضد المغناطيس وتجاهل المادة طافية وتغسل مرة أخرى مع آخر ميليلتر 140 حبة ملزمة المخزن المؤقت.</li>
	<li>نبض الطرد المركزي الأنبوب، وضع الأنبوب على المغناطيس لإزالة الحد الأدنى 2 المخزن المؤقت ملزم حبة المتبقية من بيليه.</li>
</ol>
7-شطف مكتبة من حبات مغناطيس
<ol>
	<li>ريسوسبيند الخرز المغناطيسية في 15 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف قبل بيبيتينج. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>مكان الأنبوب ضد المغناطيس لبيليه الخرز.</li></ol>عند مسح الحل، إزالة 15 ميليلتر من النذرة ونقل إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب، ووضع العينة على الجليد.
	<li>التحديد الكمي للمكتبة باستخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية. ملاحظة: يجب أن يكون استرداد نسبة ~ 25% (250 نانوغرام) من تركيز بداية من 1 ميكروغرام من الحمض النووي.</li>

8-وبدءا من عنصر تحكم تشغيل/الجودة
<ol>
	<li>إزالة الخلية تدفق من التعبئة والتغليف وإرفاقه الخلية التدفق المنظم المحمولة، في الوقت الحقيقي (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>إرفاق جهاز التسلسل إلى جهاز كمبيوتر عبر كابل USB وبدء تشغيل البرامج تسلسل (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>انقر فوق "الاتصال" الجهاز من خلال برامج التسلسل، قم بتحديد "NC_Platform_QC.py"، وانقر فوق "ابدأ".</li>
	<li>مراقبة الجودة (QC) يأخذ تقريبا 6-7 دقيقة لاستكمال؛ ابحث عن 'بحر الأخضر' (مساحات كبيرة من الإخراج) على قراءات ومراقبة الجودة للتأكد من أن هناك ما يكفي المسام النشطة (&#62; 800) لتسلسل الحمض النووي.</li>
</ol>
9-بدء تشغيل التسلسل
<ol>
	<li>افتح برنامج التسلسل؛ سوف يظهر مربع حوار. في المربع "معرف العينة"، اسم العينة.</li>
	<li>انقر فوق مربع "معرف خلية تدفق" وقم بإدخال التعليمات البرمجية الموجودة على الملصق الموجود على رأس الخلية تدفق.</li>
	<li>افتح غطاء الخلية تدفق وثم اسحب الغطاء المنفذ عينة إلى اليمين (اتجاه عقارب الساعة) حيث أن الميناء عينة مرئياً. مجرد المنفذ مفتوحاً، تحقق لفقاعة صغيرة. إزالة ميكروليتيرس عدد قليل من المخزن المؤقت بما في ذلك الفقاعة.</li>
	<li>تحقق للتأكد من أن هناك المخزن المؤقت عبر صفيف الاستشعار. جعل فتيلة المخزن المؤقت بواسطة خلط ميليلتر 480 من تشغيل المخزن المؤقت مع مزيج الوقود (المصرف-1، انظر الجدول للمواد) (تأكد من مزيج دقيق الأول) مع 520 المياه خالية من nuclease ميليلتر.</li>
	<li>إضافة 800 ميليلتر من المخزن المؤقت فتيلة إلى منفذ التفجير. أرفع غطاء "سبوتون" جعلها في متناول بعناية.</li>
	<li>بعد 5 دقائق، إضافة ميليلتر 200 إضافية من المخزن المؤقت فتيلة إلى منفذ التفجير.</li>
</ol>
10-تحميل المكتبة
<ol>
	<li>قبل إعداد مكان مكتبة الكواشف التالية على الجليد: المصرف-1 (من مجموعة التسلسل)، تكييف والمربوطة مكتبة، ومكتبة تحميل الخرز (ليسانس الحقوق؛ ومن مجموعة التسلسل).</li>
	<li>لأنبوب الطرد مركزي 0.2 مل، إضافة 25.5 ميليلتر من المصرف و 12 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس تحفظ في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>مزيج ليسانس الحقوق واسطة بيبيتينج صعودا ونزولاً. إضافة 26.5 ميليلتر من ليسانس الحقوق إلى أنبوب 0.2 ميليلتر. مزيج الكواشف واسطة بيبيتينج صعودا ونزولاً. ملاحظة: ليسانس الحقوق يميل إلى تسوية خارج الخليط.</li>
	<li>إضافة ميليلتر 11 مكتبة تكييف والمربوطة بأنبوب 0.2 ميليلتر. مزيج من انعكاس وتدور إلى أسفل بالطرد المركزي نبض.</li>
	<li>إضافة ميليلتر 75 عينة من الخطوة 9.4 إلى منفذ "سبوتون" دروبويسي. تأكد من أن كل قطره تصب في الميناء قبل إضافة التالية.</li>
	<li>عناية استبدال غطاء منفذ العينة بحيث يدخل كدر المنفذ، واستبدال غطاء الجهاز.</li>
</ol>
11-ابتداء من نصي بروتوكول برامج التسلسل
<ol>
	<li>فتح القائمة المنسدلة تحت '"حدد برنامج"' وحدد "تسلسل 48 ساعة".</li>
	<li>انقر فوق الزر "تنفيذ" لبدء تشغيل البرنامج النصي.</li>
	<li>التحقق من النتائج تفحص Mux ذكرت في تيار الإشعار لعدد المسام النشطة في مسح MUX. ملاحظة: قد يختلف هذا الرقم من عدد المسام في مراقبة الجودة تشغيل وفارق كبير قد تشير إلى وجود مشكلة.<ol>
		<li>إذا كان هناك انخفاض كبير في المسام النشطة من تشغيل مراقبة الجودة، قم بإعادة تشغيل البرنامج، وإذا كان لا يزال هناك فارق كبير، إعادة تمهيد الكمبيوتر.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تحقق من أن درجة حرارة غرفة التبريد 34 درجة مئوية كما أفاد البرنامج النصي البرنامج التسلسل. ملاحظة: إذا كانت درجة الحرارة لا في 34 درجة مئوية ثم هناك لن يكفي المسام النشطة للتشغيل.</li>
	<li>التحقق من الرسم البياني لأطوال القراءة تحديد ما إذا كانت أطوال تسلسل المتوقعة والمناسبة للتصميم التجريبي.</li>
	<li>إغلاق عميل سطح المكتب باستخدام 'إغلاق' إنهاء برامج التسلسل بإغلاق صفحة ويب واجهة المستخدم الرسومية. افصل الجهاز عن الكمبيوتر.</li>
</ol>
12-تحليل تشغيل والنتائج
ملاحظة: أثناء تشغيل التسلسل، البيانات يمكن رصدها باستخدام البرنامج "عرض التقرير" باستخدام عميل سطح المكتب. أثناء أو بعد اكتمال التشغيل الملفات المتوفرة في FAST5 تنسيق الملف في ← البيانات يقرأ ← اجتياز مجلد (افتراضي). إذا كان هذا المجلد مفتوحاً أثناء تسلسل نشطاً، يمكن تجميد الكمبيوتر.
<ol>
	<li>لعرض ومعالجة تسلسل، حمل "هدففيوير".</li>
	<li>لعرض ملفات تسلسل، مباشرة فتح المركز الثقافي الفرنسي عارض ← فتح البيانات المجلد ← تحديد كافة الملفات أنواع ← حدد c: محرك الأقراص (افتراضي) ← تحديد البيانات ← تحديد ما يلي: ← حدد تمرير.</li>
	<li>العثور على وحدد الملف فاستق في القائمة المنسدلة اليسرى؛ سيتم فتح الملفات ويمكن حفظها في تنسيق فاستق. ملاحظة: غرض التجربة الطلابية، اختيرت متواليات النيوكليوتيدات 350 أو أطول لمزيد من التحليل. الإخراج من استدعاء قاعدة تسمح للمستخدم لفرز ما يلي تسلسل استناداً إلى حجم. يمكن تحليل ملفات فاستق عن طريق الانفجار (نكبي) أو غيرها من البرامج المعلوماتية الحيوية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

الكتاب قد لا الكشف.

تم إنشاء العديد من أساليب تسلسل الجيل القادم وكل يعتمد على التسلسل بتوليف لكن تختلف مناهج الكشف عن تحديد النيوكليوتيدات. NS، أحدث إضافة إلى السوق، يستخدم أسلوباً مختلفاً تماما، التي لا تتطلب رد فعل تسلسل أو تسمى النيوكليوتيدات. هذا الأسلوب يستفيد من تهمة التفاضلية النيوكليوتيدات أدرجت فعلا أنها تمر من خلال مسام مكهرب. تحديد كل النوكليوتيدات يحدث بالتحوير للتيار الكهربائي بأسس مختلفة كما أنها تمر عبر نانوبوري. هذا نظام متعدد يسمح للمستخدم بتسلسل أجزاء كثيرة في وقت واحد. حسب تسلسلها كل خيوط من الحمض النووي، هو إلى حد كبير زيادة دقة التسلسل وبرامج التسلسل، الذي يمكن تحميله على جهاز كمبيوتر محمول، معالجة الإشارات، ويوفر المعلومات التسلسل التي يمكن تحليلها.
في بيروسيكوينسينج، تسلسل بأسلوب التوليفي (SBS)، الكشف عن قاعدة محددة إدراجها في القالب يعتمد على الفحص لوسيفراس وتوليد إشارات تشيميلومينيسسينت8. في تسلسل أشباه الموصلات أيون، الكشف عن أيون الهيدروجين المفرج عنهم، مما يقلل من درجة الحموضة بواسطة أجهزة استشعار أيون9. التسلسل في الوقت الحقيقي جزيء واحد يعتمد على صفر وضع الموجه الدليل (زمو)10، الذي ينير للكشف عن جزيء الفلورسنت معلم إلى النوكليوتيدات مدمجة. SBS يستخدم طريقة فريدة من نوعها لتضخيم الحمض النووي الهدف أن مجموعات من تسلسل فريدة من نوعها ولدت13. كشف النوكليوتيدات وأضاف يتحقق عندما يتم تسجيل الأسفار النوكليوتيدات المعلمة. من ناحية أخرى قد NS ميزة فريدة من نوعها عبر طرق أخرى حيث أنه يتطلب الموارد التقنية المحدودة، والمحمولة، وتنتج منذ فترة طويلة ما يلي تسلسل، يتطلب أي تضخيم الحمض النووي السابقة، ويمكن تشغيلها بتكلفة مخفضة مقارنة بالأساليب الأخرى. ووجد طلابنا البروتوكول الإعدادية المكتبة الجديدة والسريعة لتكون واضحة وقابلة لفئة معمل ثلاث ساعات. بعض القضايا التي واجهناها كانت فقاعات في تدفق الخلية التي كان من الصعب إزالتها وأنها تتطلب طاقة الكمبيوتر كبير (واحد تيرابايت لتخزين)، أن الإنتاج الحالي للبيانات في ملف FAST5 والخلية تدفق تسلسل له فترة صلاحية محدودة قبل ذلك تتدهور. وباﻹضافة إلى ذلك، عيوب أخرى ربط NS تسلسل بروتوكول (طويل) هو أنه يتطلب عدة خطوات إعداد مكتبة، وتتطلب خبرة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية، ويولد تسلسل انخفاض الدقة عند مقارنة ببعض تسلسل منهجيات3. بيد أن التقدم الذي أحرز مؤخرا مع مجموعة إعداد مكتبة السريع الجديدة يتطلب فقط 10 دقيقة لإعداد مكتبة وأثبت تسلسل انخفاض معدل خطأ. وكانت طريقة إعداد مكتبة جديدة جداً قابلة للاستخدام في فئة معمل.
هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول، ولا سيما في مراقبة الجودة للخلية تدفق. وهذا يشمل القيام مراقبة الجودة أولية في غضون خمسة أيام من تاريخ استلام الخلية تدفق واستخدام لهم في غضون 8 أسابيع. على الرغم من أننا استخدمنا تدفق الخلايا التي تتجاوز 8 أسابيع، هو تقلص إلى حد كبير عدد المسام المفتوحة/نشطة. من المهم أن تجارب مصممة لتناسب وضع جدول زمني حيث يتم تحقيق الاستفادة القصوى من الخلايا تدفق. لدينا تستخدم البروتوكول التنظيف وإعادة استخدام الخلايا تدفق بنجاح.
التحقيق metagenomics من التربة تمثل خزان وراثية غير مستغلة للتنوع الميكروبي. ويقدر على سبيل المثال، غرام واحد من التربة تحتوي على ما بين 107 -109 خلايا بدائية14. وعلاوة على ذلك، كائنات التربة أحد مصادر رئيسية للمنتجات الطبيعية الجديدة والأنزيمات والمضادات الحيوية. وبالتالي، يمثل تحليل تسلسل الحمض النووي ميتاجينوميكس التربة أداة تعليمية قيمة للطلاب في كل مستوى من التعليم. التكنولوجيا NS لسهولة الاستخدام ومنخفضة التكلفة جعل هذا النظام أداة تعليمية فعالة جداً. الطلاب يمكن أن تسلسل عينات بيئية، وعند انتهاء التسلسل استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة لتحديد وتوصيف تسلسل الميكروبات وميتاجينوميكس في عينات الاختبار. باستخدام تكنولوجيا NS، تتاح للطلاب الخبرة العملية الحقيقية، التي لديها حتى الآن تم الخروج من التوصل إلى لاستخدامها في دورات المختبرات بسبب الخبرة الفنية المتقدمة وارتفاع تكاليف الكاشف والمعدات والصيانة في منصات أخرى يسلسل. في الآونة الأخيرة، أفاد أحد الطلاب (ج. هاريسون، اتصال شخصي) استخدام هذه التكنولوجيا في مشروع رصد البيئي للتربة الزراعية. ونتوقع أن يكون هناك العديد من تطبيقات أكثر لهذه التكنولوجيا في مجال التعليم.

والهدف من هذا الإجراء هو لإظهار الخطوات المطلوبة لإعداد مكتبة الحمض النووي البيئية لتسلسلها، الاستفادة جهاز التسلسل خلية تدفق نانوبوري، والقيام بتحليل تسلسل الحمض النووي الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج نظام و المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي) أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد الأنواع الميكروبية في التربة. حاليا، معظم منصات تسلسل الحمض النووي تتطلب استثماراً كبيرا في التدريب التقني والأجهزة المعقدة، التي لا يمكن عمليا في بيئات فقيرة الموارد، أو في مجال التطبيقات. منهاج التسلسل (NS) نانوبوري يحل هذه المسائل مع فعالية التكلفة، بسيطة لاستخدام بروتوكول إعداد مكتبة، وجهاز محمول لتسلسل وتحليل مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الأحماض النووية1،3. ادخلنا منهاج NS في العديد من الفئات مختبر لطلاب درجة الماجستير.
تكنولوجيا نانوبوري لتسلسل الجزيئات الحيوية أثبتت تطبيقات واسعة في مجال علوم الحياة، بما في ذلك تحديد مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية1،،من26، التنوع البيئي الدراسات ومراقبة سلامة الأغذية وتحليل الجينوم3،5وتوصيف للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية4. NS هو طريقة سريعة ودقيقة لتسلسل الأحماض النووية استناداً إلى المبدأ "تسلسل حبلا" عن طريق الكشف عن انقطاع الكهرباء عن وجود قواعد النوكليوتيدات الفردية عند الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يمر عبر نانوبوري إدراجها في مكهرب غشاء البوليمر الاصطناعية. الخطوات المتبعة في إعداد الحمض النووي لتشمل NS تجزئة الجينوم والإصلاح نهاية 3 ' دا-تراجع من أجزاء الجينوم ومحول والحبل الصلب للحمض النووي، تنقية مكتبة الحمض النووي، وتحميل المكتبة إلى الجهاز خلية تدفق نانوبوري. يتم إنجاز تجزئة الجينوم إلى أحجام ~ 8 كيلو بايت من سينتريفوجينج 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي من خلال أنبوب تجزئة ز-أنبوب. ثم إصلاح نهايات الجينوم المجزأ والذيل مع دا بولي باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً. تسلسل محول واحد الذين تقطعت بهم السبل، ومتوافقة مع البروتين نانوبوري موتور، تتم إضافتها إلى نهايات الحمض النووي التي يتم استخدامها لتوجيه تسلسل الحمض النووي عن طريق نانوبوري (الشكل 1). تسلسل الحبل المطلوبة لتنقية الحمض النووي وإضفاء الطابع المحلي على جزيئات الحمض النووي للغشاء المسامية. دبوس تم إنشاؤه بواسطة ligating محول دبوس لواحدة من نهاية المكتبة دا الذيل. هياكل دبوس في نهايات الحمض النووي يسمح قراءة خيوط الشعور و antisense كالحمض النووي يمر عبر نانوبوري (الشكل 2). ثم هو تنقية مكتبة الجينوم استعداد من رد الفعل باستخدام الخرز ستريبتافيدين باستخدام حقل مغناطيسي، متبوعاً بتحميل العينة في الخلية تدفق نانوبوري للتحليل.
تسلسل الحمض النووي هو تقييم لجودة ويقرأ التسلسل المقبولة للتحليل ثم تتعرض للعديد من الأدوات المعلوماتية الحيوية للتعرف على الميكروبات. تتابع "ترجمة" إلى فاستق من تنسيق FAST5. في شكل فاستق، يمكن استخدام التسلسل ثم في تحليل الانفجار.

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&amp;nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة لبناء مكتبة الحمض النووي من التربة وإعداد واستخدام الخلية تدفق نانوبوري، وتحليل تسلسل الحمض النووي التعرف باستخدام برامج الحاسوب. تسلسل "الحمض النووي نانوبوري" هو تقنية مرنة تسمح لتسلسل الجينوم الميكروبية السريع التعرف على الأنواع البكتيرية والفيروسية، لتوصيف السلالات البكتيرية، والكشف عن الطفرات الوراثية التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية. وتشمل مزايا نانوبوري التسلسل (NS) لعلوم الحياة تعقيد منخفض وخفض التكلفة والتسلسل السريع في الوقت الحقيقي لتنقية الحمض النووي، أمبليكونس بكر، كدنا عينات أو الحمض النووي الريبي. NS هو مثال على "تسلسل حبلا" الذي ينطوي على تسلسل الحمض النووي من خلال توجيه جزيء الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحدة من خلال نانوبوري التي يتم إدراجها في غشاء بوليمر اصطناعية. الغشاء بتيار كهربائي يطبق عبرها، حيث تعطل الأسس الفردية التي تمر عبر نانوبوري التيار الكهربائي بدرجات متفاوتة من أربع قواعد النوكليوتيدات. تحديد كل النوكليوتيدات يحدث عن طريق الكشف عن تحوير المميزة للتيار الكهربائي بأسس مختلفة كما أنها تمر عبر نانوبوري. يتكون نظام NS من يده، USB بدعم الأجهزة المحمولة وخلية تدفق المتاح الذي يحتوي على مجموعة نانوبوري. يتم توصيل الجهاز المحمول كمبيوتر محمول قياسي يقرأ ويسجل تسلسل الحمض النووي باستخدام برامج الحاسوب.

وقدمت تكنولوجيا التصميم ونانوبوري التجريبية طريقة سريعة وغير مكلفة للطلبة لتسلسل التربة الحمض النووي. تشغيل الممثل تمرير المعلمات مراقبة الجودة مع أكثر من 800 المسام متاح للتسلسل. وأسفرت التشغيل يقرأ أكثر 125,000 المتاحة لدراسة تسلسل متوسط طولها 5.38 كيلو بايت. تسلسل على نقاط جودة وثم تم تحليلها فقط تلك التسلسل مع عشرات مقبولة. كإخراج التسلسل رد فعل في شكل FAST5، التي لم تقبل ببرامج مثل الانفجار (نكبي)، تسلسل التي تم عرضها في عارض المركز الثقافي الفرنسي الذي يحول في التسلسل لتنسيق فاستق، ومتوافق لتحليل الانفجار. في المستقبل تكرارات البرمجيات، البيانات سوف تكون متاحة كتنسيق فستق، مما يلغي الحاجة لعارض المركز الثقافي الفرنسي. انظر التكميلية الأرقام 1 و 2 و 3.
خمسون متواليات النيوكليوتيدات ما يزيد على 350 في طول تخضع للتحليل حسب بلاستن (النيوكليوتيدات ضد قاعدة البيانات النوكليوتيدات) أو بلاست (النيوكليوتيدات تترجم إلى تسلسل الأحماض الأمينية) (نكبي) التعرف على الكائنات الحية في عينة التربة. نظراً للوقت ضيق للفئة وأن يتم التركيز الطبع على الطرق المختبرية والمعلوماتية الحيوية لا، لدينا الطلاب تحليل تسلسل داخل هذه المعلمات. لدينا دروس المعلوماتية الحيوية يمكن استخدام البيانات لتطوير أدوات تحليل خطوط الأنابيب. لا يغطي هذا المستوى من التحليل المعلوماتية الحيوية في المختبر على أساس الفئة. هو الجدول 1 قائمة بالكائنات التي تم تحديدها مع قيم ه من e-04 أقل من 4. وبصفة عامة، ه-قيم أقل من 4 e-04 تشير إلى التشابه قوي بين تسلسل الإدخال (الاستعلام) وتسلسل المتطابقة. الكائنات حددتها بلاستن (ضد قاعدة البيانات غير مكررة (nr)) من مجموعة متنوعة واسعة من الأنواع وهي متاحة لزيادة الجينوم وتحليلات للبروتين. لم تم اختبار هذه العينة من التربة، التي جاءت من حديقة في مقاطعة بالتيمور، ماريلاند، حيث كانت هناك أية بيانات سابقة لتحديد ما قد تكون الكائنات الحية في التربة. تحليل بلاستن تحليل (ضد قاعدة nr) أشارت أيضا إلى هناك تسلسل مع لا التشابه في قاعدة nr. لتحديد ما إذا كانت هذه الرواية حقاً متواليات، هناك حاجة إلى المزيد من الدراسة. كشف تحليل لعدة سلاسل من بلاست البروتينات العديد من الكائنات الحية غير ممثلة في التحليل بلاستن. الجدول 2 يسرد عدة البروتينات الممكنة بما في ذلك اندوبيبتيداسيس، والبروتينات مثل أتباسيس. باستخدام هذه المكتبة لمتواليات، الطلاب فرصة لاستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية أكثر تطورا لإجراء مزيد من التحليل، إذا كان إخراج المدرب.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
الشكل 1 : إعداد مكتبة الجينوم. خطوات لإعداد المجينية الحمض النووي مكتبة للتسلسل باستخدام تقنية نانوبوري. وقد تم تعديل هذا الرقم مع الأذونات الضرورية. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
الشكل 2 . التخطيطي لتسلسل الحمض النووي باستخدام نانوبوري. يمر عبر غشاء نانوبوري مع الإشارة الكهربائية وتوليد وقاعدة تحديد الحمض النووي. وقد تم تعديل هذا الرقم مع الأذونات الضرورية. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>الكائن الحي</td>
			<td>قيمة ه</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>س متسلسلة.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>س نوكاردويديس.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>جوردونيا ليرة سورية.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>نيتراتيفورينس هيفوميكروبيوم</td>
			<td>1.00 E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>رواية ستاركييا</td>
			<td>1.00 E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>دينيتريفيكانس هيفوميكروبيوم</td>
			<td>1.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>س فيبوميكروبيوم.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>مارينوس رهودوثيموس</td>
			<td>1.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>حسين تورنييلا</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاي</td>
			<td>0.00 E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>س براديرهيزوبيوم.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كالامازونيسيس جيماتيروسا</td>
			<td>1.00 E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>بوركهولدريا sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>س سفينجوموناس.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>سيلوموناس sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 1: تحديد نتائج التحليل بلاستن- تسلسل الحمض النووي ميتاجينوميكس التربة يتعرض للبحث تشابه بلاستن ضد قاعدة البيانات نكبي النوكليوتيدات غير زائدة. البيانات المبلغ عنها بقيم ه من س 4 e-4 أو أقل.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>البروتين</td>
			<td>الكائن الحي</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>البروتين افتراضية</td>
			<td>بكتيريا أسيدوباكتير</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ميثيلترانسفيراسي سام التابعة</td>
			<td>دينيتريفيكانس ه.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPase</td>
			<td>جاناشيا sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>اندوبيبتيداسي</td>
			<td>سوني دوسنتاريا</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>تحلل البروتين</td>
			<td>كولاي</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 2: تحديد نتائج التحليل بلاست. تسلسل الحمض النووي ميتاجينوميكس التربة يتعرض للبحث تشابه بلاست ضد قاعدة البيانات نكبي البروتين غير زائدة.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
تكميلية الشكل 1: نتائج برنامج مراقبة الجودة- وترد نتائج برنامج مراقبة الجودة. في الزاوية العلوية اليمنى من نتائج مراقبة الجودة للمسام النشطة. يتم اختبار كل رباعي الخلية تدفق للمسام النشطة. الصفحة الرئيسية هي دينامية والتغييرات كما يتم اختبار كل رباعي. في هذا المدى، تم الكشف عن المسام واحدة 1,414.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
تكميلية الشكل 2: FAST5 تحويل الملفات إلى ملفات فاستق. هنا على الجانب الأيمن، يتم إخراج البيانات من تشغيل التسلسل. كل سطر يمثل تسلسل فردية. الجانب الأيسر من الشكل يظهر التسلسل المميز من الجانب الأيمن، في المركز الثقافي الفرنسي عارض يحول التسلسل إلى ملف فستق التي يمكن استخدامها لمزيد من التحليل. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
تكميلية الشكل 3: تسلسل "مثال فستق" في عارض HDF. هذا التسلسل (قراءة 803) في ملف فستق الذي يقوم بتحويل البيانات FAST5 إلى النيوكليوتيدات. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

تكنولوجيا نانوبوري لتسلسل الجزيئات الحيوية لها تطبيقات واسعة في مجال علوم الحياة، بما في ذلك تحديد مسببات الأمراض ورصد سلامة الأغذية، وتحليل الجينوم، ميتاجينوميك الرصد البيئي، وتوصيف للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. ويتجلى في هذه المقالة، إجراءات الجينومية التربة تسلسل الحمض النووي لتحديد الأنواع باستخدام تكنولوجيا التسلسل نانوبوري.

نانوبوري تسلسل الحمض النووي لتحليل التربة الجينومية

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K Views.  Johns Hopkins University. تكنولوجيا نانوبوري لتسلسل الجزيئات الحيوية لها تطبيقات واسعة في مجال علوم الحياة، بما في ذلك تحديد مسببات الأمراض ورصد سلامة الأغذية، وتحليل الجينوم، ميتاجينوميك الرصد البيئي، وتوصيف للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. ويتجلى في هذه المقالة، إجراءات الجين?...

Video: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

تحليل Metagenomic من السيلاج

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genetics

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

الكشف الجزيئي في الموقع من فيتوباثوجينس المنقولة بالتربة باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

عزل وتحليل المجتمعات الميكروبية في التربة، رهيزوسفيري، وجذور في تجارب الأعشاب المعمرة

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Chemistry

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biology

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

تصور الديناميكيات الميكروبية لتدوير الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Bioengineering

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.