Agradecemos a Moustafa Saleh y Jay Tourigny por la lectura crítica del manuscrito y Steven Hahn y Steven Henikoff por su mentoría y apoyo durante el desarrollo de ChEC-seq y su aplicación al complejo Mediator. SG es apoyado por las concesiones de NIH R01GM053451 y R01GM075114 y GEZ es apoyado por fondos de la puesta en marcha de la universidad de Indiana.

1. Generación de cepas de levadura <ol><li> Genere una cepa de levadura que tenga el factor de interés marcado con MNase. <ol><li> PCR amplifican el casete de marcado MNase del vector deseado ( Tabla 1 ) usando la mezcla de reacción especificada ( Tabla 2 ) y las condiciones de ciclación ( Tabla 3 ). Mezclar 5 μL de la reacción de PCR y 1 μl de colorante de carga de ADN 6X. Ejecutar cada alícuota de PCR en un gel de agarosa al 0,8% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 2.3 kb. </li><li> Transformar el casete de marcado amplificado en la cepa de elección utilizando la transformación estándar de acetato de litio 22 y realizar la selección. </li><li> Verificar la correcta integración del casete de etiquetado con PCR de colonias. <ol><li> Preparar la mezcla de reacción especificada ( Tabla 4 ) para el número de colonias que se deben tamizar. Manténgase en el hielo hasta que lo necesite. </li><li> Escoja una porción de cada colonia para ser tesEn la parte inferior de un tubo de PCR usando un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta. </li><li> Cocinar las colonias escogidas a alta potencia durante 1 min. </li><li> Añadir 50 μl de mezcla de PCR ( Tabla 4 ) a cada colonia de microondas y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Realice PCR usando las condiciones de ciclo especificadas ( Tabla 5 ). </li><li> Mezclar los 50 μL de reacción de PCR y 10 μL de colorante de carga de ADN 6X directamente en cada tubo de PCR. Ejecutar 10 μL de cada muestra en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 700 pb. NOTA: Si se desea, verifique la expresión apropiada de la proteína de fusión MNasa mediante Western blot. Se espera un desplazamiento de aproximadamente 20,6 kilodaltons en el peso molecular de la proteína marcada. </li></ol></li></ol></li><li> Generar una cepa de MNasa libre mediante clonación basada en la homología del promotor del gen de interés en pGZ136 (Tabla 1) y transformación y selección como en el paso 1.1.2. <ol><li> AlternatiVely, ensamblar el promotor del gen de interés y 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS en un vector de plásmido, transformar y seleccionar como en la etapa 1.1.2, y hacer crecer la cepa en la condición selectiva apropiada para el mantenimiento del plásmido. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> En la tarde / noche del día anterior al experimento de ChEC, inocular 3 ml de levadura-peptona-dextrosa (YPD) o medio selectivo apropiado con una única colonia de la cepa que lleva el factor marcado con MNasa. Incubar esta cultura durante la noche (agitación 180 RPM, 30ºC). </li><li> En la mañana del día del experimento de ChEC, diluir el cultivo durante la noche en 50 ml de medio a una densidad óptica a 600 nm (DO 600 ) de 0,2 - 0,3. Incubar este cultivo (agitación 180 RPM, 30 ° C) hasta que alcance una DO 600 de 0,5-0,7. A medida que el cultivo se aproxima a la DO 600 adecuada, se pone el bloque de calor o el baño de agua a 30ºC y se comienzan a descongelar aditivos de Tampón A ( TaBle 6). </li><li> Preparar 5 mL de Tampón A más aditivos ( Tabla 6 ) por cultivo. Mantenga el tampón A a temperatura ambiente durante el procedimiento. </li><li> Prepare tubos de microcentrífuga que contengan 90 μL de solución de parada ( Tabla 7 ) y 10 μL de SDS al 10% para cada punto de tiempo que se va a recoger. Para cada nuevo factor analizado, tomar las muestras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min y 10 min. </li><li> Se decanta el cultivo en un tubo cónico de 50 ml y se centrifuga a 1.500 xg ya temperatura ambiente (RT) durante 1 min. </li><li> Resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A y transferir las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s. </li><li> Aspirar sobrenadante y resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s. Repita este paso una vez. </li><li> Resuspender completamente las células en 570 μL de Tampón A. Añadir 30 μl de digitonina al 2%(0,1% de concentración final) para facilitar la permeabilización de las células, e invertir la mezcla. </li><li> Permeabilizar las células en bloque de calor o baño de agua a 30 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetar la reacción hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células. Elimine una alícuota de 100 μl de células permeabilizadas como control negativo a un tubo de microcentrífuga que contenga solución de parada y SDS (paso 2.4) y agite brevemente para mezclar. </li><li> Añadir 1,1 μ l de 1 M CaCl 2 (2 mM de concentración final) a las células permeabilizadas para activar MNase e invertir varias veces rápidamente o vórtice brevemente para mezclar. Devolver inmediatamente la reacción mezclada a 30 ° C e iniciar un temporizador. </li><li> En cada punto de tiempo a recoger, pipetear la reacción arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme de las células, luego eliminar una alícuota de 100 μL de células permeabilizadas a un tubo de microcentrífuga que contiene solución de parada y SDS y vórtice brevemente para mezclar. Para cada nuevo factor analizado, tomar 0 s (sin CaCl 2 añadido), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min, y 10 min puntos de tiempo. NOTA: Los experimentos de ChEC con factores que escinden rápidamente el ADN a 30 ° C se pueden realizar a temperaturas más bajas para disminuir la cinética de escisión de MNasa. </li><li> Una vez que todos los puntos de tiempo se han recogido, añadir 4 μ l de 20 mg / ml de proteinase K a cada muestra, vórtice brevemente para mezclar, e incubar a 55 ° C durante 30 min. </li><li> Se a~naden 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamılico 25: 24: 1 a cada muestra, se agita vigorosamente para mezclar y se centrifuga a velocidad máxima y RT en una microcentrıfuga durante 5 min. </li><li> Retirar cada fase acuosa (~ 150 μl) a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Vórtice vigorosamente para mezclar y precipitar en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa. </li><li> El gránulo precipitó ADN a velocidad máxima y 4ºC en una microcentrífuga durante 10 min. </li><li> Los sobrenadantes de decantación y los gránulos de lavado con 1 mL de etanol RT al 70%. </li><li> Decantar etanol, quitando el resto invirtiendo unD golpeando suavemente los tubos sobre una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min. </li><li> Mientras que los gránulos están secando, hacer una mezcla maestra para resuspender pellets secos en 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μl de RNasa A 10 mg / mL cada uno. Digerir el ARN a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Mezcle 1 μL de colorante de carga de ADN 6X con 5 μl de cada muestra y corríjase sobre un gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 40 min. </li></ol> 3. Selección del tamaño NOTA: El objetivo de la selección de tamaños es eliminar fragmentos de ADN genómico de múltiples muestras de la muestra a secuenciar y enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente el tamaño del ADN nucleosómico) o más pequeños. En los datos de secuenciación, los fragmentos &lt;400 pb se enriquecen, con un notable pico alrededor del tamaño del ADN nucleosómico (~ 150 pb) y una distribución pico o amplia de fragmentos subnucleosómicos. &lt;Ol <li> A cada muestra, añadir 75 μL de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) en una solución de polietilenglicol (PEG) 23 y pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar la mezcla de perlas: ADN a RT durante 5 min. </li><li> Durante la incubación de perlas SPRI, se preparan tubos de microcentrífuga que contienen 96 μl de Tris 10 mM, pH 8,0 y 4 μl de NaCl 5 M para cada muestra. </li><li> Coloque los tubos en un estante magnético para recoger bolas en el lado del tubo. Deje que las perlas se acumulen en el lado del tubo durante 2 min. </li><li> Transferir cada sobrenadante a un tubo nuevo que contenga Tris y NaCl (paso 3.2). </li><li> Añadir 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 a cada muestra, agitar a vórtice y centrifugar a velocidad máxima y RT en una microcentrífuga durante 5 min. </li><li> Retirar cada fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Precipitar el ADN en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa. </li><li> Pellet preciA la velocidad máxima y 4 ° C en una microcentrífuga durante 10 min. </li><li> Los sobrenadantes de decantación y los pellets de lavado con 1 mL de etanol al 70%. </li><li> Decanta el etanol, quitando el resto invirtiendo y tocando suavemente los tubos en una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min. </li><li> Resuspender las pastillas secas en 25 μL de Tris, pH 8,0. Determine la concentración de la muestra utilizando un ensayo de alta sensibilidad. Para TF ChEC experimentos, 10-100 ng de ADN es rutinariamente recuperado después de la selección de tamaño. </li><li> Preparar bibliotecas de secuenciación. Los protocolos de preparación de bibliotecas que no dependen de la selección de tamaños, como se describió anteriormente 24 , son deseables para permitir la secuenciación de una amplia gama de tamaños de fragmentos (25-500 pb). </li><li> Bibliotecas de secuencias en modo de extremo pareado. Un mínimo de 25 bases de secuencia en cada extremo es necesario para la lectura de alta calidadcartografía. Entre 1 y 2 millones de lecturas proporciona suficiente cobertura para una muestra de ChEC. NOTA: El análisis de los datos de Seq de ChEC es un procedimiento complejo y está fuera del alcance de este artículo. Puede encontrar información detallada sobre el análisis de datos en las publicaciones anteriores 1 , 21 , y las secuencias de comandos personalizadas utilizadas para el análisis están disponibles en GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) también se puede utilizar para el análisis de línea de comandos de datos ChEC-seq. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos demostrado que ChEC puede mapear diversas clases de proteínas de levadura en la cromatina, y anticipar que será ampliamente aplicable a diferentes familias de TFs y otros factores de unión a la cromatina en la levadura. ChEC-seq es ventajoso en que no requiere reticulación, solubilización de cromatina, o anticuerpos. Por lo tanto, ChEC evita artefactos potencialmente presentes en X-ChIP-seq, como el artefacto hiper-ChIPable 3 , 4 , y ChIP nativo, tale...

El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados ​​en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) 1 , para eludir estos inconvenientes. ChIP-seq se realiza más a menudo con un paso inicial de reticulación de formaldehído (X-ChIP-seq) para preservar las interacciones proteína-ADN. Sin embargo, una serie de estudios recientes han indicado que X-ChIP-seq capta transitorios o inespecíficos interacciones proteína-ADN 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , dando lugar a falsos sitios de unión positiva. Además, la sonicación, comúnmente utilizada para fragmentar la cromatina en experimentos X-ChIP-seq, tiende preferentemente las regiones de cromatina abierta, lo que conduce a la recuperación sesgada de los fragmentos de estas regiones [ 9 , 10] . La sonicación también produce una mezcla heterogénea de longitudes de fragmentos, limitando en última instancia la resolución del sitio de unión, aunque la adición de un paso de digestión con exonucleasa puede mejorar en gran medida la resolución 11 , 12 . Los métodos nativos de ChIP tales como regiones ocupadas de genomas de cromatina naturalmente aislada purificada por afinidad (ORGÁNICOS) 13 no usan cromatina de reticulación y fragmentos con nuclease micrococcal (MNasa), aliviando los sesgos potenciales asociados con la reticulación de formaldehído y la sonicación. Sin embargo,La solubilidad de muchas proteínas ligadas a la cromatina en las condiciones relativamente suaves requeridas para la extracción nativa de cromatina es pobre, lo que podría conducir a un rango dinámico reducido y / o falsos negativos [ 14] . Mientras que varias iteraciones de ChIP-seq son más comúnmente utilizados para el genoma de la cartografía de las interacciones entre proteínas y ADN, varias técnicas de cartografía basada en la fusión de proteínas de interés para diversas enzimas modificadoras del ADN también se han puesto en práctica. Uno de estos enfoques es la identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) 15 , en el que una proteína de unión a cromatina de interés se fusiona genéticamente con Dam y esta fusión se expresa en células o animales, dando como resultado la metilación de secuencias GATC próximas a los sitios de unión para la proteína. DamID es ventajoso porque no depende de la inmunoprecipitación y evita así la reticulación, los anticuerpos o la solubilización de la cromatina. También se realiza in vivo . sin embargo, La resolución de DamID está limitada a la escala de kilobases y la actividad de metilación de la proteína de fusión Dam es constitutiva. Un segundo método basado en la fusión enzimática es Calling Card-seq 16 , que emplea la fusión de un factor de interés para una transposasa, dirigiendo la integración de transposones específica de sitio. Al igual que DamID, Calling Card-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto tiene ventajas similares, con el beneficio añadido de una mayor resolución. Sin embargo, Calling Card-seq puede estar limitado por sesgos secuenciales de transposasas y también depende de la presencia de sitios de restricción cercanos a los sitios de inserción del transposón. Un tercer método de fusión enzimática, desarrollado en el laboratorio de Laemmli, es la cromatina endógena clivaje (ChEC) [ 17] . En ChEC, una fusión entre una proteína asociada a la cromatina y la MNasa se expresa en células, y tras la adición de calcio para activar la MNasa, el ADN se escinde proximalmente a los sitios de unión para la proteína marcada( Figura 1 ). En combinación con Southern blotting, ChEC se ha utilizado para caracterizar la estructura de la cromatina y la proteína vinculante en un número de loci individuales en la levadura 17 , 18 , y se ha combinado con análisis de microarrays de baja resolución para sondar la interacción de componentes de poros nucleares con la levadura Genoma 19 . ChEC ofrece beneficios similares a DamID y Calling Card-seq, y su resolución es casi un par de bases cuando se analiza por la extensión de cebador 19 . ChEC también es controlable: la escisión de ADN robusto por MNasa depende de la adición de calcio milimolar, asegurando que la MNasa es inactiva a las concentraciones de calcio libre bajo observado en las células de levadura vivas [ 20] . Anteriormente, se postuló que la combinación de ChEC con secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq) proporcionaría mapas de alta resolución de los sitios de unión TF. De hecho, ChEC-seq generaron mapas de alta resolución de los factores reguladores generales (GRFs) Abf1, Rap1 y Reb1 de la levadura en ciernes a través del genoma 1 . También hemos aplicado con éxito ChEC-seq al complejo modular Mediator, un coactivador transcripcional global esencial conservado 21 , ampliando la aplicabilidad de ChEC-seq a complejos de tamaño megadalton que no entran en contacto directo con el ADN y pueden ser difíciles de mapear por ChIP- Basado en los métodos. ChEC-seq es un método poderoso tanto para la validación independiente de los resultados de ChIP-seq como para la generación de nuevos conocimientos sobre la regulación de los procesos residentes en la cromatina. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la aplicación de este método en la levadura en ciernes.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, High Purity</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td></tr><tr><td>MagneSphere magnetic rack</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genoma de todo el mapa de las interacciones proteína-ADN es fundamental para la comprensión de la regulación de genes, la remodelación de la cromatina, y otros procesos de cromatina-residente. La reticulación del formaldehído seguida por la inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (X-ChIP-seq) se ha utilizado para obtener muchas ideas valiosas sobre la biología del genoma. Sin embargo, X-ChIP-seq tiene limitaciones notables ligadas a reticulación y sonicación. ChIP nativo evita estos inconvenientes omitiendo la reticulación, pero a menudo da como resultado una recuperación deficiente de las proteínas unidas a la cromatina. Además, todos los métodos basados ​​en ChIP están sujetos a consideraciones de calidad de anticuerpos. También se han utilizado métodos enzimáticos para correlacionar interacciones proteína-ADN, que implican la fusión de una proteína de interés con una enzima modificadora de ADN, para mapear interacciones proteína-ADN. Recientemente hemos combinado uno de estos métodos, la cromatina endógena escisión (ChEC), con alto rendimiento de secuenciación como ChEC-seq. ChEC-seq se basa en la fusión de una cromatina-assoc(MNase) para generar segmentación de ADN dirigida en presencia de calcio en células vivas. ChEC-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto eludir las preocupaciones potenciales con la reticulación, sonicación, solubilización de la cromatina, y la calidad de anticuerpos, mientras que la asignación de alta resolución con una mínima señal de fondo. Prevemos que ChEC-seq será una poderosa contrapartida a ChIP, proporcionando un medio independiente para validar los hallazgos de ChIP-seq y descubrir nuevos conocimientos sobre la regulación genómica.

En el caso de un experimento de ChEC exitoso, el análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa revelará un aumento dependiente de calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, tal como se indica por el desprendimiento y la digestión completa final del ADN genómico. En algunos casos, se observa una escalera de bandas similar a la observada con una digestión MNasa tradicional después de una digestión prolongada. Este es el caso de ChEC análisis de Reb1, un ...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K vistas.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa). 

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Investigación

Genética

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Bioquímica

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biología

Aislamiento de cromatina locus específico de células de levadura

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Autor destacado: Avance en la investigación de la cromatina y superación de las limitaciones con un protocolo de aislamiento de cromatina específico del locus de alto enriquecimiento 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in

Resumen

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Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

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Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

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El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae

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