Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.

1. asignación Fastq archivos
Nota: DEEPN software, así como muchos programas de Bioinformática utilizan datos de la secuencia de ADN en el que cada secuencia de lectura se ha trazado para su posición en referencia de ADN. Una variedad de programas de mapeo puede utilizarse para esta incluyendo la interfaz MAPster aquí que utiliza el programa HISTAT2 para producir archivos .sam en pasos posteriores.
<ol><li>Asignar los datos de la secuencia a la versión correcta del genoma. Para Y2H bibliotecas de origen de ratón, utilice el genoma UCSC mm10; para aquellos con genes humanos, uso el genoma de referencia de hg38 UCSC, para Saccharomyces cerevisiae de genes, el genoma de referencia de SacCer3 de la UCSC.</li>
	<li>
Instalar a MAPster.
	<ol>
<li>Descargar MAPster software e instalar. El software se puede encontrar utilizando un navegador web en el siguiente: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 se ejecuta en sistemas basados en Unix como un Apple Macintosh. Debido a esto, el programa MAPster sólo se ejecutará en sistemas compatibles como Apple Macintosh y linux. Nota: Requisitos del sistema para un Mac de Apple son: OSX 10.10 +, > 4 Gb de RAM, > 500 Gb espacio en disco y conexión a internet para la descarga de los genomas de referencia. Los usuarios pueden necesitar consultar con un institucional persona si su empresa tiene protocolos de seguridad restringir permisos y derechos de administrador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Introduzca los archivos requeridos y parámetros a través de la pestaña "Principal" (figura 1). Seleccione el botón de "Pairwise" apropiado para introducir archivos como pares o desapareado con FASTQ como el formato de archivo predeterminado.
	<ol>
<li>Para análisis DEEPN, gire a la opción de "Pairwise" "OFF" para ejecutar en solo leer formato.</li>
		<li>Cargar archivos en MAPster simplemente arrastrar y soltar en la ventana correspondiente.</li>
		<li>Seleccione una referencia fuente de genoma ADN que corresponde a la fuente de los insertos de biblioteca Y2H presa. Indexadas genomas de varios organismos modelo se enumeran en el cuadro de "Genoma" y pueden descargarse automáticamente desde el centro de la Universidad de Johns Hopkins para la biología computacional. Genomas de referencia se almacenarán localmente para su uso posterior.</li>
		<li>Indicar el número de procesos de computadora para ser dedicado al programa de asignación en el cuadro de "Hilos", ya que HISAT2 soporta multi-threading. MAPster buscará el equipo y sugerir el número máximo de procesadores disponibles por defecto.</li>
		<li>Especifique un nombre de archivo de salida. Este nombre de archivo se utilizará durante todo el proceso DEEPN por lo que se recomienda un nombre corto pero descriptivo sin espacio o caracteres especiales. Especifique una carpeta para los archivos asignados usando el botón de "Directorio de salida abierta" de salida.</li>
		<li>Una vez que se han seleccionado los archivos correspondientes y los parámetros, agregar el trabajo de asignación a la cola de trabajos utilizando el botón "Añadir a la cola". Los nombres de archivo en la ventana principal pueden ser eliminados y reemplazados con los archivos correspondientes a una nueva muestra y pueden agregarse a la cola después de proporcionar un nombre de archivo de salida correspondiente.</li>
		<li>Haga clic en el botón "Run Queue" una vez que todos los trabajos que se introducen en la cola de trabajos. Nota: Una vez que un trabajo de mapeo se ha colocado en la cola, seleccionando ese trabajo hace que la configuración de los parámetros que se muestran en la ventana de "Parámetros de trabajo" y la instrucción de línea de comandos con todos los argumentos que se mostrará en la ventana de "Comandos de trabajo". Las opciones de salida incluyen dirigir a mantener lecturas que no alinee y especificar el número de alineamientos primarios para cada lectura. El archivo de salida predeterminado de MAPster es en formato SAM (por ejemplo, un archivo '.sam'). Contendrá todas las lecturas de la secuencia de los archivos fastq especifican para esa muestra, incluyendo aquellos que fueron (asignados) y no (asignada) con éxito asignada a los complejos especificado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bioinformática procesamiento utilizando DEEPN Software
Nota: Software DEEPN actualmente está compilado para el uso con bibliotecas de presas que contienen secuencias de cDNA de ratón, secuencias de cDNA humano o secuencias genómicas de ADN de S. cerevisiae . DEEPN acepta el formato de archivo estándar .sam y puede aceptar un archivo SAM (.sam) que contiene las lecturas asignadas y no asignadas o archivos separados para cada una de las lecturas asignadas y no asignadas.
<ol><li>Descargar software DEEPN e instalar. El software se puede encontrar utilizando un navegador web en el siguiente: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Seleccione la versión que coincide con la plataforma informática y descargar. Para instalar, abrir el paquete de instalación descargado. Nota: Las versiones de DEEPN están disponibles para PC, Mac y Linux sysrems. Sistemas Mac y PC deben tener > espacio en disco duro de 500 Gb y > 4 Gb de RAM.</li>
	<li>
Abra el software DEEPN. Desde la ventana principal (figura 2) selecciona la información correspondiente de la biblioteca de presa de la caja de selección superior. Seleccione una carpeta donde los archivos procesados pueden ir haciendo clic en el botón "Carpeta de trabajo" y navegar a la carpeta/directorio. Se puede crear un directorio nuevo si es necesario. Una vez seleccionada una "carpeta de trabajo", DEEPN creará tres subcarpetas titulado unmapped_sam_files, mapped_sam_files y sam_files.
	<ol>
<li>Si usando archivos .sam lecturas asignadas y no asignadas como las producidas con la configuración predeterminada del programa MAPster, colocarlos en la carpeta 'sam_files'. De lo contrario Coloque archivos .sam en el unmapped_sam_files y mapped_sam_files por consiguiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniciar proceso pulsando el botón "Gene cuenta + cruce hacer". Nota: El procesamiento comenzará con el módulo de Gene cuenta que posiciones de asignación cuenta Lee cuántos corresponde a cada gen. Unión hace entonces va a extraer secuencias de la ensambladura (las secuencias fundieron directamente aguas abajo del dominio de activación de Gal4) la Lee e identificarlos mediante el algoritmo de Blast. Esto crea un conjunto completo de carpetas ilustrado en la figura 3. Tiempo de procesamiento depende del tamaño y número de secuencia de archivos de datos y velocidad de procesamiento de la computadora utilizada. Lee veces típicos van desde 12, 30 h para un conjunto de datos experimental de 250 millones. El procedimiento de recuento de Gene y el procedimiento de Junction_Make se pueden iniciar individualmente haciendo clic en el botón de «Recuento de genes» o el "Hacer de la Unión".</li>
	<li>
Descargar e instalar Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Se trata de un paquete de análisis estadístico diseñado para conjuntos de datos DEEPN que actualmente sólo funciona en sistemas Unix Mac.
	<ol>
<li>Abra Stat_Maker y haga clic en el botón "Verificar la instalación" (figura 4). Si ejecuta por primera vez, Stat_Maker automáticamente instalará R, JAGS y Bioconductor tirando estos recursos de internet. Una vez que se detectan JAGS y R y Bioconductor, Stat_Maker se activo y permitir mayor entrada de usuario.</li>
		<li>Haga clic en el botón "Seleccionar carpeta" para navegar hasta la carpeta de trabajo que DEEPN procesado. Stat_Maker buscar y automáticamente los archivos para el análisis estadístico en la ventana de la lista.</li>
		<li>Arrastrar y soltar los archivos correspondientes de la ventana de lista de archivo arriba en las ventanas de archivo debajo de cada conjunto de datos vectoriales y cebo y para cada condiciones de crecimiento: no seleccionado (su + media) y seleccionado (su media). Importante, Stat_Maker requiere datos duplicados vacío vector solo, dos muestras de poblaciones no seleccionadas y seleccionaron dos muestras de. Esto da una estimación de la variabilidad dentro del experimento.</li>
		<li>Haga clic en el botón "Ejecutar". Dependiendo de la velocidad de la computadora, computación tendrá entre 5-15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revisar los resultados de la salida de Stat_Maker, que se colocan en una nueva subcarpeta en la carpeta principal del trabajo «Resultados de la Stat_Maker». Nota: Los resultados se encuentran en un archivo CSV (valores separados por comas) que puede ser abierto en común programas de hoja de cálculo. Stat_Maker se alinean hits gen que pueden enriquecerse diferencialmente en la selección con el cebo del interés sobre el pTEF-DGB vacíelo (figura 5). También tabulados es el porcentaje de lecturas para cada conjunto de datos donde el inserto del gen se encuentra aguas arriba, aguas abajo, o en el marco de lectura abierto y si el gen se encuentra también dentro del marco de lectura correcta traslación. A menudo, DEEPN podrán capturar interacciones de Y2H robustas de un cebo con las porciones de un cDNA dado que están fuera del marco de lectura apropiada de la proteína correspondiente o a una porción del cDNA que está aguas abajo de su correspondiente marco de lectura abierto. Análisis de la salida combinada de Stat_Maker optimiza la detección y eliminación de estos golpes irrelevantes.</li>
	<li>
Para revisar los datos de cada candidato potencial, abrir el software DEEPN, seleccionar la información correspondiente de la biblioteca de la presa y luego la carpeta correcta de trabajo con la "carpeta de trabajo".
	<ol>
<li>Haga clic en el botón "Consulta de explosión". Esto carga una nueva ventana (figura 6). En el cuadro de texto superior, escriba el nombre de gen o número de GenBank NM para seleccionar los genes candidatos de interés. Estos nombres gen corresponden a los nombres que figuran en el archivo de salida StatMaker. Ingresar o devolver, que inicia la recuperación del gen de interés.</li>
		<li>Seleccione que datos se utilizarán para el análisis usando el menú "Seleccionar datos". Por lo general, estos incluyen el Vector sólo y cebo muestras cultivadas bajo condiciones no-selectivo y la muestra de cebo cultivadas bajo condiciones de selección. Inicialmente, los conjuntos de datos tomará unos momentos para cargar, sin embargo, la posterior consulta de los mismo conjuntos de datos con diferentes genes irá rápidamente. Blast_Query mostrará los puntos de fusión a lo largo de la secuencia de interés y abundantes cada punto de fusión. Esto puede mostrarse en un formato de tabla usando la pestaña "Resultados" o un formato gráfico mediante la ficha "Trama". Estos resultados pueden ser exportados a un archivo .csv haciendo clic en el botón "Save CSV" en la parte superior derecha.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verificación de los candidatos identificados por DEEPN
Nota: El propósito de DEEPN y Stat_Maker es identificar genes candidatos que dan una positiva interacción Y2H. Verificar tales interacciones Y2H puede ser hecho usando un formato tradicional de Y2H binario utilizando el plásmido de cebo de interés junto con el plásmido de 'presa' de dominio vacío de Gal4-activación así como emparejado con el plásmido de presa lleva el fragmento de gen/ADNc de interés. No es posible aislar el plásmido real de interés dentro de la mezcla de ADN aislado de la población de levaduras sometida a selección Y2H. Sin embargo, uno puede cómputo reconstruir lo que el fragmento de gen/cDNA es que produce la interacción de Y2H diseño de cebadores para la 5' y 3' extremos de ese fragmento y amplificar ese fragmento de la DNA aislada de la población de levaduras. Esta sección describe cómo encontrar el extremo 5' y 3' del fragmento de presa del candidato.
<ol><li>Abra el software DEEPN y elija los parámetros "Parámetro Select" y la carpeta de trabajo "Seleccionar trabajo carpeta" correspondientes al proyecto. Lanzar el módulo de Blast_Query haciendo clic en el botón "Consulta de explosión".</li>
	<li>
Escriba el nombre del gen de interés o su GenBank "NM" número en el cuadro de texto superior. Seleccione en el menú desplegable conjunto de datos que corresponde a la población de levaduras seleccionadas para el cebo de interés para recuperar la tabla de posiciones de salida en la pestaña 'Resultados'. De forma predeterminada, Blast_Query ordenará las diferentes posiciones según su abundancia en el dataset, cuantificado por el ppm del total de uniones en la base de datos.
	<ol>
<li>Encontrar la posición más abundante que es "en ORF" y "en el marco de la". El valor de posición corresponde a la posición del nucleótido del gen con la secuencia de referencia de NCBI (número de 'NM') encontrada en la caja de texto superior. Esta secuencia puede ser obtenida de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) o copia desde el cuadro de texto inferior de la ventana de Blast_Query. Nota: Un ejemplo puede encontrarse en la figura 6, panel central. En el centro conjunto de datos, los 'resultados' Mostrar como la ensambladura más abundante: «Posición»: 867; '#Junctions': 20033.821; 'Consulta Inicio', 1; CD: En ORF; y el 'Marco': en el marco. 867 nucleótido de la secuencia de referencia de GenBank NCBI NM_019648 es el comienzo del fragmento de presa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si el inicio de la consulta es 1, el extremo 5' del primer con el nucleótido correspondiente al número de posición de diseño y extender 25 nucleótidos corriente abajo desde esa posición (figura 7). Si iniciar la consulta es más de 1, indica que hay nucleótidos adicionales entre el dominio de activación de Gal4 y la secuencia de la presa de interés y que la cartilla debe comenzar más abajo según el valor de inicio de la consulta.</li>
	<li>Desde la ventana DEEPN haga clic en el botón "Lectura profundidad" debajo de "Analizar los datos". Una vez abierta la ventana de lectura de profundidad, tipo el NCBI secuencia (NM) número o gen nombre de referencia en el cuadro de texto superior. Utilice el menú desplegable para seleccionar el conjunto de datos relevante que contiene el gen enriquecido de interés. Utilice la tabla de la izquierda y mostrar los gráficos de la derecha para determinar cuántas lecturas se encontraron en los datos que se corresponden con el gen de interés (figura 7B).</li>
	<li>Diseño 3' final primer que capturará la secuencia del fragmento del gen computado por la profundidad de la lectura. Si la abundancia de Lee va más allá del ORF y stop codon, diseño de la cartilla que incluyen el codón de parada y la región justo aguas arriba del codón de parada. Si las secuencias del gen no se extienden al pasado el codón de parada, utilice la tabla de resultados para encontrar la más distante región 3' que se puede detectar y utiliza esta posición como el más 3' posición colocar la cartilla. Nota: El programa de lectura profundidad analiza en intervalos para encontrar secuencias que coincida con la especificada gene/ADNc de interés. Esto ayuda a predecir Dónde está el extremo 5' y 3' del fragmento de presa más abundante de ese gen en la muestra. Las fluctuaciones en la profundidad de lectura a lo largo de la longitud de la secuencia son normales, como puede verse en la figura 7. Si la profundidad leer claramente es el codón de parada, indica que el fragmento de la presa se extiende más allá del codón y así el primer 3' puede corresponder simplemente la región alrededor del codón de parada.</li>
	<li>
Llevar a cabo una reacción de PCR de 50 μL por gene. Cada reacción contiene 25 pmol de cada primer avance y retroceso que empareja el plásmido presa-biblioteca (véase tabla de materiales). Las reacciones también contienen 25 μl de alta fidelidad 2 x PCR Master Mix, 5 μg de muestra de ADN y el agua hasta 50 μl.
	<ol>
<li>Amplificar las reacciones para 25 ciclos con tiempos de extensión de 3 min a 72 ° C, recocido temperatura de 55 ° C por 30 s, desnaturalizando a 98 ° C por 10 s. Precede ciclismo por una desnaturalización s 30 a 98 ° C y seguir con una incubación de 5 min a 72 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La suite de software que se describe aquí permite procesar y analizar datos de secuenciación de ADN de alto rendimiento de un experimento DEEPN completamente. El primer programa utilizado es MAPster, que se la Lee de la secuencia de ADN en archivos estándar fastq y su posición en una referencia de ADN para procesar aguas abajo por un montón de programas informáticos, incluyendo el software DEEPN los mapas. La utilidad de la interfaz MAPster y su capacidad para múltiples puestos de trabajo, combinar archivos de ent...

Un método para descubrir las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que hazañas de ingeniería las células de levadura que crecen sólo cuando una proteína de interés se une a un fragmento de una interacción socio1. Detección de múltiples interacciones de Y2H ahora es posible con la ayuda de secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento. Varios formatos han sido descritos2,3,4,5 incluyendo uno que desarrollado donde las poblaciones se cultivan en lotes bajo las condiciones que seleccione para la levadura que contiene plásmidos que producen un positivos de interacción Y2H6. El flujo de trabajo desarrollado, denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), identifica la interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas que interactúan con una proteína (o dominio) vs. otra proteína o un dominio mutante conformationally distinto. Uno de los pasos principales de este flujo de trabajo es adecuado procesamiento y análisis de los datos de secuenciación de ADN. Alguna información puede ser obtenida simplemente contando el número de lecturas para cada gen antes y después de la selección de Y2H interacciones de manera análoga a un experimento de RNA-seq. Sin embargo, se puede extraer información mucho más detallada de estos conjuntos de datos con información sobre el subdominio de una determinada proteína que es capaz de producir una interacción Y2H. Además, considerando el enfoque DEEPN es valiosa, analizando muchas repeticiones de la muestra puede ser engorroso y costoso. Este problema se alivia mediante el uso de un modelo estadístico que fue desarrollado específicamente para conjuntos de datos DEEPN donde el número de repeticiones es limitado6. Realizar procesamiento y análisis de datos de secuenciación de ADN confiable, completo, robusto y accesible para investigadores sin conocimientos de bioinformática, hemos desarrollado una suite de programas que cubren todos los pasos del análisis.
Esta suite de programas de software independiente que se ejecutan en computadoras de escritorio incluye MAPster DEEPN y Stat_Maker. MAPster es una interfaz gráfica de usuario que permite a que cada fichero fastq en cola para el mapeo del genoma mediante el programa de HISAT27, produciendo un archivo .sam estándar para su uso en aplicaciones posteriores. DEEPN tiene varios módulos. Asigna y cuenta Lee correspondiente al gen particular similar a una cuantificación del tipo RNA-seq con el módulo 'Gene cuenta'. También extrae las secuencias correspondientes a la unión entre el dominio transcripcional Gal4 y la secuencia de la presa y recoge la posición de las uniones para permitir su inspección por parte de cuadros comparativos y gráficos (con el módulo 'Junction_Make') El módulo 'Blast_Query' permite fácil inspección, cuantificación y comparación de las secuencias de Unión Unión Gal4. Stat_Maker evalúa la Lee por datos de enriquecimiento gene estadísticamente como una forma de priorizar probable Y2H hits. Aquí, describimos cómo usar estos programas de software y analizar completamente la secuencia de la DNA datos de un Y2H DEEPN experimentan. DEEPN están disponibles para su ejecución en sistemas PC, Mac y Linux. Otros programas, como el programa de mapeo MAPster y el módulo de estadísticas DEEPN Stat_Maker confían en subprogramas que se ejecutan en Unix y sólo están disponibles en sistemas Mac y linux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mapster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEEPN software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statmaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum computer system</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Mac Intel Core i5 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>OS 10.10 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>Intel i5-7400 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Windows 7 or higher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de interacciones proteína transitorios y estáticos dentro de una sola pantalla utilizando la secuencia de la DNA de alto rendimiento corto-leer. Los conjuntos de datos de secuencia resultante pueden no sólo rastrear qué genes en una población que se enriquecieron durante la selección para las interacciones 2-híbrido de levadura positivos, sino también da información detallada sobre los subdominios correspondientes de proteínas suficientes para la interacción. Aquí, describimos un conjunto completo de programas de software autónomo que permite no expertos para bioinformática y estadísticas pasos para procesar y analizar archivos de fastq de secuencia de ADN de un ensayo de 2 híbrido de levadura lote. Los pasos del proceso de estos programas incluyen: 1) mapeo y cuenta Lee de la secuencia correspondiente a cada proteína candidata codificada dentro de una biblioteca de presa 2 híbrido de levadura; 2) un programa de análisis estadístico que evalúa los perfiles de enriquecimiento; y 3) herramientas para examinar la estructura traslacional y la posición dentro de la región de la codificación de cada plásmido enriquecido que codifica las proteínas interacción de interés.

Mapeo de datos fastq: el primer paso En prácticamente todas las aplicaciones de NGS incluyendo DEEPN la salida inicial es un archivo de lecturas de secuencia corta que debe asignarse por alineación a genómico, transcriptómico, u otra referencia ADN8. El programa de alineación de HISAT2 fue desarrollado recientemente, que utiliza los algoritmos de indexación de vanguardia para aumentar dramáticamente el mapeo velocidad7</...

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Secuenciación profunda de las poblaciones de levaduras seleccionadas para las interacciones 2-híbrido de levadura positivos potencialmente produce una gran cantidad de información sobre la interacción de las proteínas de socio. Aquí, describimos el funcionamiento de herramientas bioinformáticas específico y personalizado software actualizado para analizar los datos de la secuencia de estas pantallas.

Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K vistas.  University of Iowa. Secuenciación profunda de las poblaciones de levaduras seleccionadas para las interacciones 2-híbrido de levadura positivos potencialmente produce una gran cantidad de información sobre la interacción de las proteínas de socio. Aquí, describimos el funcionamiento de herramientas bioinformáticas específico y personalizado software actualizado para analizar los datos de la secuencia de estas pantallas.

Video: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Investigación

Genética

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

Análisis de transcriptómica<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; ARN secuencia de datos a través de la suite smoking en el Proyecto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Nueva secuencia descubrimiento por la genómica sustractivo

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...