Damos las gracias a C. de Hojer para la lectura crítica del manuscrito, B. Bingol (Genentech) para participar en las narraciones de script, N. Bien-Ly para compartir la experiencia de mejora de imagen vascular con inyección en la vena de la cola de tinte lectina, y M Solloway (Genentech ) para los ratones utilizados en formación de imágenes páncreas. Línea de las buenas prácticas agrarias-M fue creado por J. Sanes (Universidad de Washington en St. Louis) y los ratones CX3CR1 GFP por R. Littman (NYU). El trabajo es apoyado por Genentech, Inc.

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con IACUC (Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso) regulaciones sobre los ratones ~ 3-5 meses de edad. El autor declara no los intereses financieros de la competencia. 1. Animal de perfusión y preparación de tejido Tiempo: 30-60 min por ratón + posterior a la fijación (unas pocas horas a la noche). <ol><li> Pesar el animal y anestesiar utilizando ketamina (80-200 mg / kg) y xilazina (7-20 mg / kg) o 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g de peso corporal IP). </li><li> Espere unos minutos para que la anestesia surta efecto completo. </li><li> Pellizcar la punta y la cola del animal para asegurarse de que el animal está totalmente anestesiado. </li><li> Perfundir el animal primero a TA con tampón fosfato 0,1 M (PB) o 0,1 M tampón fosfato salino (PBS) durante 5-10 minutos hasta que la sangre se elimina por completo del tejido. </li><li> Cambie la perfusión de solución de fijación: 4% PFA en 0,1 M PB (o 0,1 M PBS) y continuar la perfusióncon 4% PFA durante 30-40 min a una velocidad de 3 ml / min. </li><li> Diseccionar el órgano / s de interés cuidadosamente sin dañar, por ejemplo, evitar perforar y apretando el tejido que está siendo diseccionado. </li><li> Retire el tejido adicional que rodea los órganos (tejido conjuntivo, las meninges o duramadre) en una placa de Petri llena de PBS. </li><li> Post-fijar los órganos en PFA al 4% para algunas horas o durante la noche a 4 º C. Evitar largo post-fijación porque PFA podría apagar la señal o aumentar el tiempo extra autofluorecense 10 especialmente para el canal de GFP (que es un problema menor en los canales rojo y rojo lejano). </li><li> Lavar los órganos 2-3x con PBS a temperatura ambiente justo antes de comenzar el procedimiento de compensación. </li></ol> 2. Compensación de Tejidos Tiempo: 2-3 horas para los pequeños órganos y 1-4 días para los grandes órganos. Notas: El etiquetado de fluorescencia de los tejidos mediante la expresión de los transgenes, transfección viral, trazado con tintas o anti-etiquetado cuerpo debe ser completado antes de borrar. Todos los pasos de limpieza y eliminación de tejido se llevan a cabo a temperatura ambiente. Las soluciones de compensación de THF, DBE, Babb (1 parte de alcohol bencílico y benzoato de bencilo parte 2) y diclorometano son tóxicos y por inhalación (llevar a cabo experimentos en campana de humos con ventilación adecuada) y el contacto directo con la piel debe ser evitado (use guantes de nitrilo). <ol><li> Preparar 50% (vol / vol), 70%, y 80% de THF diluciones en agua destilada en frascos de vidrio separados de la siguiente manera: Para 50% de THF, por ejemplo, mezclar 25 ml de THF y 25 ml de agua destilada en una botella de vidrio con un volumen de mayores de 50 ml. </li><li> Mezcle las soluciones agitando suavemente la botella para un 1-2 min. </li><li> Etiquete la botella de vidrio claro. </li><li> Cierre bien las botellas y mantener las soluciones de trabajo en un armario oscuro. Para obtener los mejores resultados, no utilice las mismas soluciones de trabajo de más de 1-2 semanas. Por lo tanto, ordenar las soluciones de compensación como el menor volumen disponible para poder utilizar los reactivos de acciones nuevas. </li><li>Llene los frascos de vidrio (por ejemplo, 2-3 ml) con la primera solución de limpieza, 50% de THF, y la transferencia de los órganos de PBS en viales de vidrio para empezar claro. </li><li> Cierre bien los frascos de cristal con sus tapas y utilizar un rotador (por ejemplo, un agitador de rueda) para agitar. </li><li> Use papel de aluminio para cubrir y mantener los viales de vidrio en la oscuridad. Iniciar el rotador para agitar las muestras en los viales de vidrio durante el tiempo indicado (Tabla 1) a una velocidad constante (~ 30 rpm). </li><li> Eliminar la solución de limpieza y agregue la siguiente en el protocolo cuando se termina el tiempo en la Tabla 1. </li><li> Recoger los residuos de compensación en los contenedores de residuos de vidrio que se mantienen en una capucha. Repita el paso anterior para cada solución de limpieza en el protocolo hasta el final. Utilice una nueva pipeta pasteur cuando se añade una nueva solución de limpieza (por ejemplo, el cambio de THF a DBE). </li><li> En la etapa de compensación final con BABB o DBE, los tiempos de incubación pueden ser extendidos o shortened hasta que las muestras se vuelven completamente transparentes a la luz visible (o amarillento / transparente si se trata de un tejido muy grande, como el cerebro). </li><li> Mantenga despejados los órganos en la solución de limpieza final, en todo momento, incluyendo los pasos de formación de imágenes. </li></ol> 3. Preparación Órganos aclarados for Imaging Tiempo: 5-15 min. Nota: La imagen de los órganos despejadas tan pronto como se logre una compensación completa. Para ello, siga los siguientes pasos para preparar las muestras para microscopía de lámina de luz (por ejemplo, ultramicroscopía) o imágenes de microscopía confocal / multi-fotón. Nota: Los órganos borrado, pierden su fuerza de fluorescencia con el tiempo (particularmente las proteínas fluorescentes por ejemplo, las buenas prácticas agrarias, el etiquetado de anticuerpos es más resistente e incluso puede dar mejores resultados con incubaciones más largas). Para formación de imágenes, diversas técnicas de microscopía de fluorescencia se pueden utilizar, siempre y cuando el manejo adecuado de los órganos en el CLEAse logra una solución anillo. <ol><li> Para microscopía hojas luz <ol><li> Coloque o monte la muestra adecuada. </li><li> Fijar el órgano autorizado girando manualmente el tornillo del soporte de la muestra 4. </li><li> Sumergir la muestra en la cámara de formación de imágenes (preferentemente de vidrio) de microscopio TheLight hojas que se llena con BABB o DBE, lo que se utilizó en el paso de compensación final. </li></ol></li><li> Para múltiples microscopía fotónica / confocal <ol><li> Montar la muestra en una diapositiva de formación de imágenes (o una cámara de imágenes) con la solución de imagen final para ser capaz de imagen con un fotón múltiples o microscopía confocal, que suelen utilizar aceite o objetivos sumergidas en agua. </li><li> Utilice cemento dental para hacer un borde alrededor del tejido. </li><li> Llenar la piscina con BABB o DBE justo antes de cemento dental se pone totalmente rígido. Nota: El cemento dental se solidifica rápidamente; practicar un par de veces para familiarizarse con él antes de tratar las muestras reales. </li><li> Coloque inmediatamentela muestra despejado en el centro de la piscina y se cubre con una cubierta de vidrio. </li><li> Pulse el vidrio de cubierta hasta que esté completamente sellado por cemento dental y toca a la superficie del órgano despejado, lo que permitirá alcanzar la profundidad máxima de formación de imágenes por microscopía confocal / multi-fotón. Notas: Esto asegura que no hay solución de compensación será derramada durante la proyección de imagen. Evite la inmersión de la lente de imagen directamente en la solución de compensación, que puede dañar la lente a menos que sea resistente a la BABB / DBE o tiene una cubierta protectora. </li></ol></li></ol> Órganos 4. Imaging aclarados Tiempo: 15-45 min. <ol><li> Se recoge una z-scan que cubre todo el tejido borrado (si la lente utilizada permite) a la mejor resolución que el microscopio puede ofrecer. </li><li> Zoom en las regiones de interés para recoger imágenes de mayor resolución. </li></ol> 5. Examen de los datos con el software Amira <ol><li> Cargue la serie de imagens de software Amira con módulo ResolveRT. </li><li> Introduzca el tamaño de voxel correctas en la ventana y pulse ok &quot;Imagen Read Parameter&quot;. </li><li> Seleccione el &quot;Multi Planer View&quot; sub-aplicación. A continuación, utilice el control deslizante &quot;Grueso&quot; para elegir el umbral óptimo para los valores de gris, el ajuste de los valores de 2D y 3D. </li><li> Visualice la muestra, navegando por las rebanadas en diferentes orientaciones 2D y utilizando el módulo de cultivos-corner en la vista 3D. Nota: Una guía detallada del protocolo de resolución de problemas se puede encontrar en Ertürk et al 4. </li></ol>

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No hay nada que revelar.

Métodos de limpieza y eliminación de tejido tienen como objetivo reducir la dispersión de la luz de imagen, haciendo coincidir los índices de refracción de las diferentes capas de tejido en los órganos de inmediata disposición. Como resultado, la luz de formación de imágenes puede penetrar profundamente en los tejidos y estimular las células marcadas / moléculas. Este viejo concepto de tejido de compensación 17 se ha ganado cada vez más atención después de la primera aplicación sofisticada de la técnica en los cerebros de ratón intactas por Dodt y colegas 2. Desde entonces, hay una creciente lista de nuevos métodos de compensación incluyendo 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY y SeeDB 3,4,7,18-20. En esencia, todos ellos tienen como objetivo hacer que los órganos transparentes para imágenes de tejidos profundos mediante la preservación de la etiqueta fluorescente. Entre ellos, 3DISCO se destaca como uno de los métodos más sencillos y reproducibles. Se compara con relativa rapidez a otros métodos de compensación mencionados anteriormente (1-5 días vs 2-3 semanas para los cerebros adultos, respectivamente) 21. Ya ha sido el éxitoplenamente aplicado a diferentes órganos, como el cerebro, la médula espinal, los ganglios linfáticos, el bazo, el pulmón, los tumores sólidos, el páncreas y las glándulas mamarias 3,4,9. Además, varias publicaciones de grupos de investigación independientes que ya utilizan este método para obtener imágenes como resultado 22,23. Sin embargo, diferentes procedimientos de compensación de tejido podrían ser ventajoso para diferentes condiciones. Por ejemplo, mientras Sca / ey SeeDB se aplican mejor en tejidos embrionarios 6,7, son los métodos de compensación a base de agua, que podrían ser más fáciles de manejar durante la exploración. En contraste, la claridad es un método de compensación complicado y costoso. Sin embargo, puede ser ventajoso en el contexto del etiquetado de anticuerpos, especialmente en las grandes tejidos tales como cerebro 8. El paso más crítico para obtener los mejores resultados de las imágenes de 3DISCO es etiquetado tejido, que se realiza antes de la limpieza del tejido. Es fundamental comenzar con la señal fluorescente fuerte posible. Esto puede be conseguirse de varias formas que incluyen la expresión transgénica de las proteínas fluorescentes, la localización por colorantes sintéticos, transfección viral o etiquetado de anticuerpos. Se debe tener en cuenta que cualquier procedimiento de compensación se reducirá la señal fluorescente de los tejidos. Por lo tanto, si la señal fluorescente no es lo suficientemente fuerte como al principio - es decir, que no es fácilmente detectable antes de que el intercambio de información de imágenes de los tejidos aclarados dará resultados pobres. Hay algunas limitaciones de los métodos que están a la espera de mejoras despejar. Una limitación importante es que, puesto que los reactivos de compensación alteran la estructura de los órganos despejadas, no pueden ser utilizados en el tejido vivo. Por lo tanto, los experimentos tales como con mEos2 fotoactivable 24 se deben realizar antes de la fijación y la limpieza. Tras la limpieza, super-resolución de imagen de la señal fluorescente de proteínas brillantes y fotoestable se hace posible. Además, debido a que el protocolo de intercambio de información disminuye elintensidad de las proteínas fluorescentes, los órganos despejadas no se pueden almacenar durante períodos prolongados. Es importante señalar que algunos órganos son más difíciles de ser limpiado. Sobre todo, si los órganos diseccionados retienen grandes cantidades de células de la sangre (por ejemplo, el bazo, el hígado), son relativamente difíciles de borrar y la imagen. También es relativamente más difícil de lograr una compensación completa para grandes tejidos, tales como roedores cerebro adulto. Tales tejidos pueden necesitar tiempos de incubación más largos, lo que podría, por otra parte, reducir la señal fluorescente. Además, el desarrollo de métodos de microscopía que puede imagen grandes órganos transparentes a la vez en una de alta resolución es una necesidad a la espera de ser tratados. Otra limitación importante de la técnica es etiquetado tejido. Mientras que una señal fluorescente fuerte a través de la expresión genética o el virus es ideal, no cada célula o molécula pueden ser etiquetados genéticamente o de forma viral. Por otro lado, el etiquetado de anticuerpos de tejidos gruesos no es un procedimiento directo o incluso no POssible en la mayoría de los casos. Se puede necesitarse protocolos permeabilización especiales y tiempos de incubación largos (varios días a unas pocas semanas) 3. También es importante tener en cuenta que los tejidos se encogen ~ 20% en cada dimensión (medida para el tejido de la médula espinal) después de limpiar debido principalmente a la deshidratación y de eliminación de lípidos. Esta contracción se produce ratiometrically y debe corregirse en los pasos de cuantificación. Como se observa en los resultados presentados, estructuras marcadas fluorescentemente permanecen intactas, que es la indicación de la integridad de la proteína en los tejidos aclarados. Debido a la naturaleza hidrófoba del tejido aclarado final, no se puede teñir con más anticuerpos o incrustado en soluciones de agua contiene, por ejemplo, Focusclear-que se utiliza en glicerol CLARITY-o 80%. Finalmente, es un desafío para analizar abrumadoras tamaños de datos de imágenes. Por ejemplo, cuando toda una cerebro murino se escanea a una resolución celular, que sería muy difícil de localizar y cuantificar str deseadauctures (por ejemplo, redes neuronales o gliales) y comparar más de diferentes muestras de una manera automatizada. En resumen, mientras que los investigadores tratan de descubrir nuevos métodos de compensación, los diversos problemas mencionados (dificultad de limpieza de diversos tejidos, imágenes en alta resolución de las zonas más grandes, y el análisis de datos complicados) deberían mejorarse en paralelo. En conclusión, las técnicas de limpieza y eliminación de tejido recientemente desarrollados, incluyendo 3DISCO, elegantemente demuestran que la alta resolución de imágenes en 3D de los órganos intactos, ahora es posible. El uso de estos métodos, los científicos pueden obtener información anatómica de las células y moléculas en el órgano intacto. Estos estudios de imagen en 3D pioneros sobre órganos transparentes inspiran un creciente número de investigadores a descifrar anatómica compleja y organizaciones moleculares de los tejidos / órganos en la salud y la enfermedad.

El examen histológico de los tejidos biológicos es un enfoque fundamental en la comprensión de la naturaleza de las moléculas / células en su contexto natural. Idealmente, imágenes de alta resolución de todo el órgano es más informativo y deseada. Debido a que la luz tiene una profundidad de penetración limitada, debido a la dispersión 1, los órganos fijos tienen que ser seccionado para realizar imágenes microscópicas de alta resolución. Por lo tanto, la mayor parte de los estudios histológicos se realizan en pocas secciones de tejido que representan sólo una pequeña parte del órgano. En algunos estudios, por ejemplo, las destinadas a trazar las conexiones neuronales en el cerebro o la médula espinal, todas las secciones de tejido de los órganos diana se recogen y se va a examinar para una reconstrucción 3D. Sin embargo, seccionar los tejidos y la posterior obtención de imágenes de secciones individuales tiene varias limitaciones. Estos incluyen ser mucho tiempo y que conduce a una reconstrucción 3D incompleta del tejido, debido a las distorsiones mecánicas y difícilIES en la alineación de las imágenes resultantes. Recientemente, de compensación y de imágenes transparentes órganos intactos se ha desarrollado como una solución importante a este defecto de 2,3. Tras la limpieza, todo el órgano se vuelve transparente permitiendo a la luz imágenes de viajar de extremo a extremo (Figura 1) para producir imágenes de alta resolución del órgano unsectioned usando un microscopio de barrido láser como un fotón o hojas luz multi microscopio ( la Figura 2). Varios grupos de investigación han desarrollado nuevos protocolos de limpieza y eliminación de tejido para ser capaz de imagen de su tejido de interés para diferentes propósitos. Estos incluyen disolvente orgánico 2-5, 6,7 agua y electroforesis basada 8 protocolos de compensación. Entre ellos, de formación de imágenes 3-dimensional de disolvente se aclaró órganos o 3DISCO es un protocolo fácilmente aplicable en una variedad de muestras biológicas incluyendo el sistema nervioso central (SNC) órganos, órganos inmunes y tumores sólidos. En adicde iones, que se puede combinar con diferentes técnicas de microscopía tales como microscopía de luz hoja de fluorescencia (LSFM), múltiples fotones y microscopía confocal de barrido láser. 3DISCO se basa en la limpieza con reactivos fácilmente disponibles y baratos tales como tetrahidrofurano (THF) y éter de dibencilo (DBE) 4. El protocolo completo puede tomar tan corto como 3-4 hr. Por lo tanto, 3DISCO es una técnica robusta y rápida en comparación con los métodos histológicos tradicionales que pueden tardar semanas o meses para completar 9.

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Littman lab at NYU.</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>Used to prepare Avertin solution.</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzyl ether</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Lectin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0.388888889</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP pharmaceuticals</td><td>504001</td><td>Used in perfusion.</td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rotator</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Media Storage Bottles</td><td>Kimax Media Bottles</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head</td><td>Gilson, Inc</td><td>F110701 and F117606</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy slide</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix Peroxide Test Strips</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira with RT resolve microscopy module</td><td>Visage Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Las neuronas están altamente polarizadas células con morfología extremadamente larga. Su función depende de las conexiones que se forman entre sí y con otros tejidos. Por lo tanto, la cartografía de la organización estructural de las neuronas es muy importante para entender cómo funcionan en la salud y la enfermedad. Sin embargo, el paradero de tales enormes conexiones neuronales a lo largo de todo el sistema nervioso conectómica-recientemente nombrados 11 - sigue siendo uno de los retos más difíciles de la neurociencia. Con este fin, tanto en la UE 12 y EE.UU. 13 han puesto en marcha grandes proyectos para mapear el cerebro humano. Mientras 3DISCO se puede emplear en diversos órganos, que ha sido particularmente útil para rastrear conexiones neuronales largos en la médula espinal y el cerebro. Por ejemplo, utilizando exploraciones ultramicroscopía de grandes segmentos de la médula espinal despejadas, las conexiones axonales pueden seguirse durante centímetros en el roedor de la médula espinal (La Figura 2). En forma similar, todo el cerebro aclarado de ratón (Figura 3a) y el hipocampo (Figura 3b) se pueden obtener imágenes a seguir conexiones neuronales en el cerebro. Cuando se utiliza la microscopía confocal de fotón o múltiples en órganos despejadas, la resolución de formación de imágenes se puede mejorar de manera significativa, especialmente en dimensión z. Por ejemplo, múltiples de formación de imágenes de fotones de las médulas espinales de ratones de línea despejadas GFP-M (Figura 4A) logra una imagen sin fisuras a través de toda la profundidad (~ 1,5-2 mm) de la médula espinal. Microscopia confocal en la médula espinal despejado ofrece una mejor resolución de una forma similar (Figuras 4b y c). Múltiples imágenes de microscopía de fotones de cerebros despejadas proporciona imágenes de muy alta resolución para visualizar los detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo las espinas dendríticas (Figura 5). Las muestras para 3DISCO pueden ser etiquetados de varias maneras, incluyendo la expresión del transgen, virAl transfección, el trazado de colorante y el etiquetado de anticuerpos. Por ejemplo, es posible marcar toda la vasculatura del cerebro (figuras 6a y b) y la médula espinal (Figuras 6c y d) el uso de lectina conjugada trazadores fluorescentes 4, que se puede utilizar para estudiar la barrera hematoencefálica (BBB ) en la salud y la enfermedad. Ambos astrocitos y microglia son altamente implicados en la patología de la neurodegeneración, incluyendo las enfermedades de Alzheimer y lesiones traumáticas 14,15. Uso de 3DISCO, su densidad y la distribución en la médula espinal (Figura 7) o el cerebro pueden ser estudiados. Tejidos no neuronales también se pueden obtener imágenes. Por ejemplo, células de Clara en la totalidad de los pulmones de roedores pueden ser immunolabeled con anticuerpos y la imagen sin seccionar en un solo nivel de célula (Figura 8). Del mismo modo, es posible borrar y celdas de imagen, por ejemplo,células alfa en el tejido pancreático unsectioned (Figura 9). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. 3DISCO compensación tejido hace que los tejidos unsectioned transparentes para obtener imágenes de tejidos profundos. Sin declarar (a) y borrado (b) los tejidos de la médula espinal, como se ve por la luz visible. Tras la limpieza, el tejido de la microscopia de escaneo láser de profundidad se hace posible. (C) los tejidos de la médula espinal no liquidados y compensados ​​fueron imágenes por microscopía de 2 fotones. Las barras de escala en a, b = 0,5 mm y en c = 100 m. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3DISCO de formación de imágenes de la médula espinal a seguir extensiones axonales. La médula espinal diseccionado de Thy-1 línea de ratón transgénico GFP (GFP-M) se divide en trozos más pequeños (~4 mm). Después de seguir el protocolo de compensación para pequeños tejidos (Tabla 1) las médulas espinales transparentes se visualizaron utilizando ultramicroscopía. Reconstrucciones en 3D de un segmento de 4 mm ~ médula espinal en horizontal (a), coronal (b) y vista sagital (c). (D) Representante trazó axones (rojo) se muestran en la vista transparente en escala de grises. (E) de visión de alta magnificación de la región indicada en (d). Las barras de escala en A, B, C, D = 0,5 mm y en e = 20 micras. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. 3DISCO imágenes del cerebro y el hipocampo despejado. Ejemplos de cerebros y los hipocampos de ratones GFP-M despejadas fueron imágenes con una ultramicroscopio. Visualizaciones en 3D de todo el cerebro (a) y el hipocampo (b) que demuestran la netwo neuronalrks en los tejidos transparentes fotografiados. Las barras de escala en a = 2 mm y en b = 20 m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Aclaración del tejido mejora la resolución obtenida por múltiples fotones y microscopía confocal. Segmentos de la médula espinal de ratones transparentes GFP-M fotografiada por las múltiples fotones (a) o microscopía confocal (b, c). Tenga en cuenta que la limpieza sustancialmente mejora la resolución y la profundidad de formación de imágenes revelando la estructura fina de los axones y dendritas. Las barras de escala en un = 100 micras y en b, c = 20 micras. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. 3DISCO imágenes de las espinas dendríticas. Tejido cerebral de ratones transparente GFP-M fotografiados por múltiples fotones. Visualizaciones 3D de región de la corteza escaneada presentados en el versículoperspectivas ticos (a) y horizontales (b). (C) ~ 50 micras de proyección de los niveles indicados en (a, b). (D) de alta magnificación de la región indicada en (c) la demostración de los detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo las espinas dendríticas (puntas de flecha). Las barras de escala en a = 50 m, en b, c = 25 micras, en d = 5 micras. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. 3DISCO de la vasculatura. Para etiquetar los vasos sanguíneos en los órganos enteros, se usa un colorante de lectina-FITC durante la perfusión (antes de la compensación) como se describe 16. Vale la pena mencionar que se encontró que la inyección vena de la cola del trazador da una mejor señal sobre la perfusión cardiaca del trazador. Después de recoger los cerebros fijos y la médula espinal, se borran y imaged por ultramicroscopía. Visualización en 3D de toda la vasculatura del cerebro del ratón en el mapa de calor (a) y en escala de grises (a). (B) visualización en 3D de la vasculatura de un segmento de médula espinal de ratón en mapa de calor (C) y de escala de grises (D). Los mapas de calor se generan en función de la intensidad de la tinción de lectina; azul: baja intensidad (al fondo) y el rojo: alta intensidad (vasculatura). Las barras de escala en a = 2 mm, b = 1 mm, y en c, d = 250 m. <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. 3DISCO de células gliales en el tejido del SNC despejado. Las médulas espinales de ratones transgénicos que expresan GFP en microglia TGH (CX3CR1-EGFP) o astrocitos TgN (hGFAP-ECFP) fueron despejados y imágenes de microscopía de fotones múltiples. Representación 3D de microglia se muestra como el volumen de la visualización de la superficie (a) y la visión transparente ( <strong&gt; b). (C) Una proyección óptica (~ 50 m) se presenta para mostrar los detalles de la microglia en la médula espinal. Representación 3D de astrocitos se muestra como la visualización de volumen de superficie (a) y la visión transparente (b). (F) Una proyección óptica (~ 50 m) se presenta para mostrar los detalles de los astrocitos en la médula espinal. Las barras de escala en a, b, d, e = 100 micras y en C, F = 50 micras. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. 3DISCO de un lóbulo de todo el montaje de pulmón con la tinción de anticuerpos de las células Clara. Para la tinción de anticuerpos todo el montaje de los lóbulos pulmonares, 10 semanas de edad, los ratones Balb / c hembras fueron perfundidos a través del ventrículo derecho con PBS con el fin de eliminar la sangre de los pulmones. Los pulmones fueron posteriormente se inflaron con PFA al 4% y se fijaron O / N a temperatura ambiente en un fijador al menos tres veces el volumen de the tejido. Al día siguiente, los pulmones se enjuagaron brevemente en PBS y el lóbulo derecho fue puesto en 5 ml de 1% de Triton X-100 en PBS durante la permeabilización durante 48 horas o hasta que el tejido se hundió. Todas las tinciones se realizaron en 0,2% de Triton X-100 en PBS que contenía FBS al 5% y 2% de BSA y enjuagues estaban en 0,2% de Triton X-100 en PBS. La tinción con anti-CC10 fue durante 72 horas a 4 ° C, seguido de lavados extensivos para aproximadamente 6 horas. Etiquetado fluorescente del anticuerpo primario se logró con anti-cabra-Alexa Fluor-594 anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C, seguido de lavados extensivos durante 6 horas a durante la noche. El día siguiente, lóbulos teñidas se aclaró a través de 50%, 70%, y 80% de THF durante 30 min cada uno seguido por tres lavados de 30 min en 100% de THF, seguido por 20 min en DCM, seguido por 30 min en DBE. Las barras de escala en a y b = 1 mm y en c = 100 m. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Figura<html> 9. 3DISCO de páncreas. Después de la perfusión de los ratones como se describió anteriormente en el protocolo, el páncreas se disecó y se aclaró con el protocolo corto. La fluorescencia se deriva de ROSA26 LSL tdTomato recombinación inducida por el tratamiento con tamoxifeno de ratones que portan un transgén de BAC 200 kb que abarca el locus de ratón glucagón endógeno con CreERT2 insertados en el ATG de glucagón. Las puntas de flecha señalan algunas de las células alfa marcados con fluorescencia en el islote. Las barras de escala en a, b y c = 1 mm, y en d = 500 m. <img alt="Tabla 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabla 1. Protocolos de limpieza y eliminación de tejido para diversos tejidos. Ejemplos de protocolos de limpieza y eliminación de tejido para diferentes tejidos. Tenga en cuenta que el tiempo de compensación para cada paso se puede reducir o ampliar, según sea necesario para mejorar el rendimiento de compensación. El peso aproximado de los tejidos pequeños es de ~ 20 a 100 mg y el cerebro es ~ 300-500 mg.TTP :/ / jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

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Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K vistas.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

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Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Investigación

Neurociencias

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and its associated LNs. The CNS-associated lymphatic system is involved in the drainage of CSF macromolecules and meningeal immune cells toward CNS-draining LNs, thereby regulating waste clearance and immune surveillance within CNS tissues. Presented is a novel approach to obtain three-dimensional (3D) and cellular resolution images of CNS-associated lymphatics while preserving the integrity of their circuits within surrounding tissues. The iDISCO+ protocol is used to immunolabel lymphatic vessels in decalcified and cleared whole mount preparations of the vertebral column that are subsequently imaged with light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The technique reveals the 3D structure of the lymphatic network connecting the meningeal and epidural spaces around the spinal cord to extravertebral lymphatic vessels. Provided are 3D images of the drainage circuits of molecular tracers previously injected into either the CSF via the cisterna magna or the thoracolumbar spinal parenchyma. The iDISCO+/LSFM approach brings unprecedented opportunities to explore the structure and function of the CNS-associated lymphatic system in neurovascular biology, neuroimmunology, brain and vertebral cancer, or vertebral bone and joint biology.

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

A protocol is presented combining tissue clearing with light sheet fluorescence microscopy (LSFM) to obtain three-dimensional and cellular resolution images of the lymphatic vessels and lymph nodes (LNs) collecting the cerebrospinal fluid (CSF) and spinal epidural fluid.

Imágenes tridimensionales de la vasculatura y el drenaje linfáticos vertebrales utilizando iDISCO+ y microscopía de fluorescencia de láminas de luz

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and ...

Inmunología e Infección

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO: Aclaración del tejido biológico y métodos para immunolabeling Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Biología

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...

3D Visualization of Immune Cell Populations in HIV-Infected Tissues via Clearing, Immunostaining, Confocal, and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 million individuals infected worldwide and no widely accessible cure. Despite intensive efforts, a detailed understanding of virus and host cell interactions in tissues during infection and in response to therapy remains incomplete. To address these limitations, water-based tissue clearing techniques CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) and CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) are applied to visualize complex virus host-cell interactions in HIV-infected tissues from animal models and humans using confocal and light sheet fluorescence microscopy. Optical sectioning of intact tissues and image analysis allows rapid reconstruction of spatial information contained within whole tissues and quantification of immune cell populations during infection. These methods are applicable to most tissue sources and diverse biological questions, including infectious disease and cancer.

Tissue clearing, combined with immunofluorescence microscopy, allows spatial visualization and quantification of immune-cell populations and virus proteins within intact tissues. Optical sectioning of cleared tissues with confocal and light sheet fluorescence microscopy can generate 3D models of complex tissue environments and reveal spatial heterogeneity exhibited during HIV infection.

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolos optimizados de limpieza de tejidos para la obtención de imágenes en 3D de la aorta murina

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial wall, including the intima plaque, the media, and the adventitia, which forms the outer connective tissue coat of arteries. Our recent studies have suggested that the adventitia is used by the peripheral nervous system as a conduit for reaching all tissue cells. We also found that the peripheral nervous system, that is, the sensory and sympathetic nervous system, undergoes major remodeling processes involving the neogenesis of axon networks adjacent to atherosclerotic plaques. In this context, understanding the structure of the neural network and its interactions with vascular components of diseased arteries holds major promises for a better understanding of cardiovascular disease pathogenesis. To achieve these objectives, methods to visualize the subcellular architecture of the intact healthy and diseased arteries together with their surrounding perivascular compartments are needed. Tissue clearing allows intact deep-tissue imaging of larger tissue compartments that are otherwise inaccessible. It allows volumetric imaging of intact arteries through the integration of labeling, clearing, advanced microscopic imaging, and image processing tools. Here, we describe two distinct but complementary passive tissue clearing approaches, that is, aqueous-based 2, 2-thiodiethanol (TDE) clearing and solvent-based immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organ (iDISCO) clearing to image isolated aortic segments or whole aorta in-situ in the whole mouse.

<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes tridimensionales de los tejidos aórticos en la aterosclerosis

Here, we present optimized tissue-clearing protocols to image the murine aorta in three dimensions (3D). We delineate state-of-the-art procedures for immunostaining, optical clearing, and imaging with the intent to define the anatomical proximity of the peripheral nervous system with atherosclerotic plaques and the adventitia in atherosclerosis.

Imágenes tridimensionales de los tejidos aórticos en la aterosclerosis

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial ...