Este protocolo permite la visualización de la infección por virus y proporciona una visión profunda de la resolución espaciotemporal del entorno de infección y su contexto celular circundante. La aplicabilidad de la inmunosumanidad a las imágenes de tejidos profundos no sólo permite la detección de virus, sino que también permite la diferenciación de varias subpoblaciones celulares utilizando sus respectivos marcadores celulares. Para fijar el tejido para la inmunosuferidad, coloque las muestras cerebrales en una proporción de uno a 10 de 4%paraformaldehído en PBS para muestrear el volumen del tejido durante al menos 48 horas a cuatro grados centígrados.
Al final del período de fijación, lave las muestras de tejido tres veces en PBS durante al menos 30 minutos por lavado antes de transferir las muestras al 02% de azida sódica en PBS a cuatro grados centígrados. Luego usa un vibratome establecido en una velocidad de alimentación de cuchilla de 0.3 a 0.5 milímetros por segundo para secuescionar los tejidos en secciones de un milímetro de espesor. Almacene las secciones en azida sódica fresca al 02% en PBS a cuatro grados centígrados.
Para el pretratamiento del metanol sumerja las muestras en una serie ascendente de metanol como se indica durante una hora por incubación a temperatura ambiente con una oscilación suave. Después de la última incubación, enfríe las muestras a cuatro grados centígrados. Sustituya el metanol 100% por cuatro mililitros de solución de blanqueo pre-refrigerado para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados.
A la mañana siguiente reemplace la solución de blanqueo por cuatro mililitros de metanol fresco al 80% durante una hora de incubación a temperatura ambiente. A continuación, sumerja las muestras en una serie descendente de metanol en reversa de lo que se acaba de demostrar, lavando las muestras una vez durante una hora en cuatro mililitros de PBS después de la inmersión de 20%metanol. Para la inmunostaining de las secciones del tejido cerebral lavar las muestras dos veces durante una hora en cuatro mililitros de 0.2%Tritón X-100 en PBS, seguido de permeabilización durante dos días a 37 grados Celsius en cuatro mililitros de 0.2%Tritón X-100, 20%dimetil sulfóxido, y 0.3 molarlina en PBS.
Bloquee cualquier unión inespecífica con cuatro mililitros de 0,2%Tritón X-100, 10% sulfóxido de dimetil y 6% suero normal en PBS durante dos días a 37 grados centígrados. Al final de la incubación de bloqueo etiqueta las muestras con dos mililitros de solución primaria de anticuerpos durante cinco días a 37 grados Celsius, refrescando la solución de anticuerpos después de dos días y 1/2 días. A continuación, lave las muestras durante un día en cuatro mililitros de 0,2%Tween 20 y 10 microgramos por mililitro en PBS intercambiando el tampón de lavado al menos de cuatro a cinco veces durante el transcurso del día y dejando el lavado final durante la noche.
Al día siguiente, incubar las muestras en dos mililitros de solución secundaria de anticuerpos durante cinco días a 37 grados centígrados. A continuación, lave las muestras en cuatro mililitros de 0,2% Tween 20 y 10 microgramos por mililitro de heparina en PBS como se ha demostrado. Para la tinción nuclear de las muestras incubar las muestras en cuatro mililitros de la mancha de ácido nucleico TO-PRO-3 durante cinco horas protegidas de la luz.
Al final de la incubación lavar las muestras en 0.2%Tween 20 y 10 microgramos por mililitro de heparina en PBS como se demuestra, seguido de deshidratación en una serie de tert-butanol ascendente durante dos horas por inmersión. Después de la inmersión del 90% transfiera las muestras a una solución de 96%tert-butanol durante la noche. A la mañana siguiente, deshidrate las muestras más en 100%tert-butanol durante dos horas antes de limpiar las secciones tisulares en BABB-D15 recién preparados durante dos a seis horas hasta que sean ópticamente transparentes.
Las muestras se pueden almacenar en BABB-D15 protegido de la luz hasta su montaje e imágenes. Para el montaje de muestras, utilice una impresora 3D para imprimir una cámara de imágenes y una tapa. Monte un cubreobjetos de 30 milímetros de diámetro en la cámara de imágenes con caucho de silicona vulcanizante a temperatura ambiente de un componente.
Del mismo modo, monte un cubreobjetos de 22 milímetros en la tapa. Utilice un hisopo de algodón humedejado en agua para eliminar el exceso de goma de silicona en ambos anillos antes de permitir que el caucho se cure durante la noche. Al día siguiente, coloque una muestra en la cámara de imágenes y agregue un pequeño volumen de BABB-D15 a la cámara antes de insertar la tapa.
Usando una aguja hipodérmica llenar la cámara con BABB-D15 a través de la entrada y tapar la entrada antes de sellar la cámara de imagen con goma de silicona. Para configurar la adquisición de imágenes, seleccione las líneas láser adecuadas para los fluoróforos utilizados y ajuste los rangos de detección de cada detector para evitar la superposición de señal entre canales. A continuación, establezca los parámetros de adquisición para encontrar el borde superior e inferior de la pila Z y adquirir la pila de imágenes.
Para generar proyecciones 3D de la pila de imágenes, abra los archivos de imagen en Fiji y seleccione Herramienta Canales de color de imagen Más y Dividir canales para dividir las imágenes combinadas en canales individuales. Para la corrección de lejía de las imágenes, para cada canal seleccione Corrección de lejía de ajuste de imagen y seleccione Relación simple. Utilice los controles deslizantes para ajustar el brillo y el contraste de cada canal y seleccione Color de imagen y Combinar canales.
Marque la opción Crear compuesto. Convierta la imagen a formato RGB y seleccione Pilas de imágenes y Proyecto 3D para generar una proyección 3D. Seleccione Punto más brillante como método de proyección y establezca el espaciado de sectores para que coincida con el tamaño del paso Z de la pila de imágenes adquirida.
Para obtener una calidad máxima, establezca el incremento del ángulo de rotación en uno y habilite Interpolación. Modifique la rotación total, los umbrales de transparencia y la opacidad según sea necesario. A continuación, guarde la proyección 3D como formatos de archivo tiff y AVI.
El uso de la inmunostaining de las capas complejas de fosfoproteína del virus de la rabia de las células neuronales infectadas se puede visualizar en secciones gruesas de muestras de tejido cerebral del ratón. Posteriormente, se pueden reconstruir proyecciones 3D sin costuras de las pilas de imágenes adquiridas. Debido a la alta resolución con la que se adquieren las pilas de imágenes, la infección se puede evaluar hasta un solo nivel de celda, lo que permite aserciones sobre, por ejemplo, la abundancia y distribución de antígeno dentro de una célula de interés.
Además del tejido cerebral del ratón, el protocolo se puede aplicar a muestras de tejido cerebral de otras especies animales. Por ejemplo, las secciones obtenidas de diferentes compartimentos de un cerebro de hurones infectados revelan un grado variable de infección por el virus de la rabia. Los astrocitos se pueden diferenciar mediante la expresión de proteínas de ácido fibrilado glial, mientras que las neuritas se pueden teñir específicamente para la proteína asociada a microtúbulos II.Simultáneamente, las proteínas virales se pueden teñir para evaluar la relación entre las células infectadas y la subpoblación celular resaltada.
Para la inmunosumanción es crucial la elección de anticuerpos para detectar las proteínas de interés. Mientras que las concentraciones de inmunohistoquímica estándar son a menudo un buen punto de partida, algunos anticuerpos pueden necesitar ajustes adicionales. Muchos de los productos químicos utilizados en este protocolo tienen propiedades dañinas.
Lleve a cabo el experimento respectivo en una campana de humos con el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una bata de laboratorio y guantes.
