Wir danken C. Hojer für das kritische Lesen des Manuskripts, B. Bingöl (Genentech) für die Teilnahme an Skript Erzählungen, N. Bien-Ly zum Austausch von Erfahrungen mit verbesserten Gefäßbildgebung mit Schwanzveneninjektion von Lektin-Farbstoff und M Solloway (Genentech ) für die in Pankreas-Bildgebung verwendeten Mäuse. GFP-M-Linie wurde von J. Sanes (Washington University in St. Louis) und CX3CR1-GFP Mäusen durch R. Littman (NYU) erstellt. Die Arbeit wird von Genentech, Inc. unterstützt

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit IACUC (Institutional Animal Care und Verwenden Committee) Vorschriften an Mäusen ~ 3-5 Monate alt durchgeführt. Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen. 1. Tier Perfusion und Gewebepräparation Timing: 30-60 min pro Maus + Postfixierung (wenige Stunden bis über Nacht). <ol><li> Wiegen Sie das Tier zu betäuben und mit Ketamin (80-200 mg / kg) und Xylazin (7-20 mg / kg) oder 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g Körpergewicht IP). </li><li> Warten Sie ein paar Minuten für die Anästhesie, komplette wirksam werden. </li><li> Drücken Sie den Zehen und Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt wird. </li><li> Perfuse das Tier zuerst bei RT mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) oder 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5-10 min, bis das Blut vollständig aus dem Gewebe entfernt. </li><li> Schalten Sie die Durchblutung an Fixierungslösung: 4% PFA in 0,1 M PB (oder 0,1 M PBS) und weiter Perfusionmit 4% PFA für 30-40 min bei einer Geschwindigkeit von 3 ml / min. </li><li> Präparieren Sie die Orgel / s von Interesse sorgfältig ohne Beschädigung, z. B. Punktion zu vermeiden und Zusammendrücken des Gewebes, das seziert wird. </li><li> Entfernen Sie die umliegenden Organe (Bindegewebe, Hirnhaut-oder Dura mater) in einer Petrischale mit PBS gefüllt zusätzliche Gewebe. </li><li> Post-fix die Organe in 4% PFA für ein paar Stunden oder über Nacht bei 4 º C. Vermeiden Sie lange nach der Fixierung, weil PFA könnte das Signal zu löschen oder zu erhöhen autofluorecense 10 Überstunden vor allem für GFP-Kanal (die ein geringeres Problem in rot und rot-Kanäle weit ist). </li><li> Kurz vor dem Start der Clearing-Verfahren Waschen der Organe 2-3x mit PBS bei RT. </li></ol> 2. Tissue Clearing Timing: 2-3 Stunden für kleine Organe und 1-4 Tage für große Organe. Hinweise: Die Fluoreszenzmarkierung von den Geweben von Transgen-Expression, virale Transfektion Farbstoff Verfolgung oder AntiKörper Kennzeichnung sollte vor dem Löschen abgeschlossen sein. Alle Gewebe Clearing Schritte werden bei RT durchgeführt. Die Clearinglösungen THF, DBE, BABB (1 Teil Benzylalkohol und Benzylbenzoat Teil 2) und Dichlormethan sind giftig und Inhalation (Verhaltensexperimente in gut belüfteten Abzug) und der direkte Kontakt mit der Haut sollte vermieden werden (Verwendung Nitril-Handschuhe). <ol><li> Vorbereitung 50% (Vol / Vol), 70% und 80% THF Verdünnungen in destilliertem Wasser in getrennten Glasflaschen wie folgt: Für 50% THF, z. B. mischen 25 ml THF und 25 ml destilliertes Wasser in eine Glasflasche mit einem Volumen von mehr als 50 ml beträgt. </li><li> Mix-Lösungen durch leichtes Schütteln der Flasche für einen 1-2 min. </li><li> Beschriften Sie die Glasflasche eindeutig. </li><li> Schließen Sie die Flaschen und halten die Arbeitslösungen in einem dunklen Schrank. Für die besten Ergebnisse, die nicht die gleichen Arbeitslösungen länger als 1-2 Wochen. Daher bestellen die Clearing-Lösungen wie die kleinste zur Verfügung stehende Volumen der Lage Verwendung frischen Reagenzien. </li><li>Füllen Sie die Glasfläschchen (z. B. 2-3 ml) mit dem ersten Clearing-Lösung, 50% THF, und übertragen Sie die Organe von PBS in Glasfläschchen zu Clearing starten. </li><li> Schließen Sie die Glas-Flaschen mit ihren Deckeln und mit einem Rotator (zB ein Rad-Rührer) gerührt. </li><li> Verwenden Sie Aluminiumfolie zu bedecken und halten die Glasflaschen in der Dunkelheit. Starten des Rotors, um die Proben in den Glasfläschchen für die angegebene Zeit (Tabelle 1) mit einer konstanten Geschwindigkeit (~ 30 min) gerührt. </li><li> Entfernen Sie die Clearing-Lösung und fügen Sie den nächsten in der Protokoll, wenn die in Tabelle 1 ist abgeschlossen. </li><li> Sammeln Sie die Clearing-Abfall in Glas Abfallbehälter, die in einer Haube gehalten werden. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Clearing-Lösung in das Protokoll bis zum Ende. Verwenden Sie einen neuen Pasteur-Pipette, wenn eine neue Clearing-Lösung versetzt (zB Wechsel von THF zu DBE). </li><li> Bei der abschließenden Clearing Schritt mit BABB oder DBE, können die Inkubationszeit verlängert oder sh werdenortened, bis die Proben werden vollständig transparent im sichtbaren Licht (oder gelblich / transparent, wenn es eine sehr große Gewebe wie Gehirn). </li><li> Halten Sie die gelöscht Organe in der letzten Clearing-Lösung jederzeit einschließlich der bildgebenden Schritte. </li></ol> 3. Vorbereitung Geräumte Organe für Imaging Timing: 5-15 min. Hinweis: Bild gelöscht, die Organe, sobald eine vollständige Aufklärung erreicht. Zu diesem Zweck führen Sie die nächsten Schritte, um die Proben für die Lichtmikroskopie-Blatt (zB Ultramikroskopie) oder die konfokale / Multi-Photonen-Mikroskopie vorbereiten. Hinweis: Gelöschte Organe werden ihre Fluoreszenzstärke über die Zeit verlieren (insbesondere z. B. fluoreszierende Proteine, GFP, Antikörpermarkierung ist widerstandsfähiger und kann sogar bessere Ergebnisse mit längeren Inkubationszeiten). Für die Bildgebung, können verschiedene Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, so lange verwendet werden, wie die richtige Handhabung der Organe in der CleaRing-Lösung erreicht wird. <ol><li> Für Licht-Blatt-Mikroskopie <ol><li> Setzen oder stellen Sie die Probe entsprechend. </li><li> Befestigen Sie das gelöscht Orgel durch manuelles Drehen Sie die Schraube der Probenhalter 4. </li><li> Tauchen Sie die Probe in die Imaging-Kammer (vorzugsweise aus Glas) von Der Lichtblatt-Mikroskop, das mit BABB oder DBE, je nachdem, was in der letzten Clearing Schritt verwendet wurde gefüllt ist. </li></ol></li><li> Für Mehrphotonen / konfokale Mikroskopie <ol><li> Montieren Sie die Probe auf einem Abbildungs ​​Schieber (oder einer Imaging-Kammer) mit der endgültigen Imaging-Lösung in der Lage, mit einem Multi Photonen-oder konfokalen Mikroskopie, die in der Regel Öl oder Wasser eingetaucht Ziele sein. </li><li> Verwenden Sie Zahnzement um einen Rahmen um das Gewebe zu machen. </li><li> Füllen Sie den Pool mit BABB oder DBE kurz vor Zahnzement wird komplett starr. Hinweis: Die Zahnzement verfestigt sich schnell; üben ein paar Mal, um sich mit ihm vertraut, bevor Sie die eigentlichen Proben. </li><li> Sofort legendie gelöscht Probe in der Mitte des Pools und decken Sie es mit einem Deckglas. </li><li> Drücken Sie die Abdeckung Glas, bis es vollständig von Zahnzement abgedichtet und landet an der Oberfläche des Organs gelöscht, die es erlauben Erreichen der maximalen Bildtiefe durch konfokale / Multi-Photonen-Mikroskopie. Hinweise: Diese sorgt dafür, dass kein Clearing-Lösung wird bei der Abbildung verschüttet werden. Vermeiden Sie das Eintauchen der Abbildungslinse direkt in Clearing-Lösung, die die Linse schädigen können, es sei denn es ist resistent gegen BABB / DBE ist oder eine Schutzhülle. </li></ol></li></ol> 4. Imaging Geräumte Organe Timing: 15-45 min. <ol><li> Sammeln Sie eine z-Scan über den gesamten gelöscht Gewebe (wenn das verwendete Objektiv ermöglicht) zum besten Auflösung, die das Mikroskop liefern kann. </li><li> Zoom auf die Regionen von Interesse für Bilder mit höherer Auflösung zu sammeln. </li></ol> 5. Prüfung der Daten mit der Software Amira <ol><li> Laden Sie das Bild series Software Amira mit ResolveRT-Modul. </li><li> Geben Sie die richtigen Größen in Voxel-Fenster und drücken Sie ok &quot;Bild lesen Parameter&quot;. </li><li> Wählen Sie den &quot;Multi-Hobel View&quot; Sub-Applikation. Dann nutzen Sie die &quot;Stärke&quot;-Regler, um die optimale Schwelle für die Grauwerte wählen, die Anpassung der 2D-und 3D-Werte. </li><li> Visualisieren Sie die Probe, indem Sie die Scheiben in verschiedenen 2D-Orientierungen und mit Ernte-Ecke Modul in 3D-Ansicht. Hinweis: Eine ausführliche Anleitung zur Fehlersuche des Protokolls kann in Ertürk et al 4 gefunden werden. </li></ol>

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Es gibt nichts zu offenbaren.

Tissue Clearing-Methoden zielen darauf ab, Streuung von Abbildungslicht durch Anpassung der Brechungsindizes der verschiedenen Gewebeschichten in den Organen gelöscht reduzieren. Als Ergebnis kann die Abbildungs ​​Licht tief in das Gewebe eindringen und die markierten Zellen / Moleküle zu stimulieren. Das alte Konzept der Clearing 17 Gewebe wachsende Aufmerksamkeit nach der ersten anspruchsvolle Anwendung der Technik auf intakten Gehirn der Maus nach Dodt und Kollegen 2 gewonnen. Seitdem gibt es eine schnell wachsende Liste der neuen Clearing-Methoden, einschließlich 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY und SeeDB 3,4,7,18-20. Im Grunde wollen sie alle, die Organe für tiefe Gewebedarstellung transparent durch die Erhaltung der Fluoreszenzmarkierung zu machen. Unter ihnen steht 3DISCO als einer der am einfachsten und reproduzierbaren Verfahren. Es ist relativ schnell im Vergleich zu anderen oben genannten Clearing-Verfahren (1-5 Tage vs 2-3 Wochen für erwachsene Gehirne jeweils) 21. Es wurde bereits erfolgreichvollständig in verschiedenen Organen wie dem Gehirn, Rückenmark, Lymphknoten, Milz, Lunge, soliden Tumoren, Pankreas und Brustdrüsen 3,4,9 aufgebracht. Darüber hinaus sind mehrere Publikationen von unabhängigen Forschungsgruppen bereits diese Methode verwendet, um Bildergebnisse zu erhalten 22,23. Dennoch verschiedenen Gewebeclearingverfahren für unterschiedliche Bedingungen vorteilhaft sein könnte. Während beispielsweise Sca / e und SeeDB anwendbar sind am besten auf 6,7 embryonalen Geweben, sind sie auf Wasserbasis Clearing-Methoden, die einfacher zu handhaben sein, während der Bildgebung konnte. Im Gegensatz dazu ist CLARITY eine komplizierte und kostspielige Clearing-Verfahren. Es ist aber vorteilhaft im Rahmen der Antikörpermarkierung sein kann, vor allem in großen Geweben wie Gehirn 8. Der wichtigste Schritt, um die besten Bildergebnisse zu erhalten, ist von 3DISCO Gewebe Kennzeichnung, die vor der Gewebe Lichtung erreicht wird. Es ist wichtig, mit der stärksten Fluoreszenzsignal möglich beginnen. Dies kann be auf verschiedene Weise einschließlich der transgenen Expression von fluoreszierenden Proteinen erreicht, das Aufspüren von synthetischen Farbstoffen, virale Transfektion oder Antikörpermarkierung. Es sollte bedacht werden, dass jede Clearingverfahren wird das Fluoreszenzsignal der Gewebe zu reduzieren. Daher, wenn das Fluoreszenzsignal nicht stark genug ist zu Beginn - dh es ist nicht leicht nachweisbar vor dem Clearing-Abbildung der gelöscht Gewebe liefern schlechte Ergebnisse. Es gibt einige Einschränkungen von Beseitigungsverfahren, die für Verbesserungen warten. Eine kritische Beschränkung ist, dass, da Clearing Reagenzien verändern die Struktur der Organe gelöscht, können sie nicht auf lebendes Gewebe verwendet werden. Daher sollten Experimente wie mit photoaktivierbares mEos2 24 vor der Befestigung und Clearing durchgeführt werden. Beim Clearing, wird Super-Resolution Imaging des Fluoreszenzsignals von hell und photo Proteine ​​möglich. Darüber hinaus, weil die Clearing Protokoll verringert dieIntensität der fluoreszierenden Proteine ​​können die gelöscht Organe für längere Zeit nicht gelagert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Organe sind schwerer zu löschen. Insbesondere, wenn die Organe präpariert behalten hohe Mengen an Blutzellen (z. B. Milz, Leber), sie sind relativ schwer und Löschen. Es ist auch relativ schwieriger, eine vollständige Beseitigung großer Geweben, wie Gehirn erwachsenen Nagetieren zu erreichen. Solche Gewebe können längere Inkubationszeiten müssen, was andererseits zu verringern könnte das Fluoreszenzsignal. Darüber hinaus, das Bild große transparente Organe ist die Entwicklung von Methoden der Mikroskopie kann auf einmal bei einer hochauflösenden wartet eine Notwendigkeit, angegangen werden. Eine weitere wichtige Einschränkung der Technik ist die Kennzeichnung Gewebe. Während ein starkes Fluoreszenzsignal über genetische oder Virus-Expressions ideal ist, kann nicht jede Zelle oder Molekül genetisch oder viral gekennzeichnet werden. Auf der anderen Seite, ist Antikörpermarkierung von dicken Gewebe keine einfache Prozedur oder gar nicht possible in den meisten Fällen. Es können besondere Permeabilisierung Protokolle und lange Inkubationszeiten müssen (mehrere Tage bis zu einigen Wochen) 3. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Gewebe schrumpfen ~ 20% in jeder Dimension (für Rückenmarksgewebe gemessen) nach dem Löschen vor allem wegen Austrocknung und Entfettung. Diese Schrumpfung tritt ratiometrisch und sollte Quantifizierungsschritten korrigiert werden. Wie in den vorgestellten Ergebnisse beobachtet, fluoreszenzmarkierten Strukturen erhalten bleiben, die die Angabe des Proteinintegrität in den Geweben ist gelöscht. Aufgrund der hydrophoben Natur des endgültigen gelöscht Gewebe, kann es nicht weiter mit Antikörpern gefärbt oder in Wasser enthaltenden Lösungen eingebettet werden z. B.-Focusclear die Klarheit oder 80% Glycerin verwendet wird. Schließlich ist es eine Herausforderung, überwältigend Größen von Bilddaten zu analysieren. Zum Beispiel, wenn eine ganze Maus-Gehirn auf zellulärer Auflösung gescannt, wäre es sehr schwierig zu verfolgen und zu quantifizieren gewünschten structures (zB neuronale Netze oder Gliazellen) und vergleichen Sie über verschiedene Proben in einem automatisierten Weg. Zusammenfassend, während Forscher wollen neue Clearing-Methoden herauszufinden, die verschiedenen Herausforderungen oben (Schwierigkeit Clearing verschiedenen Geweben, Imaging mit hoher Auflösung von größeren Flächen und komplizierte Datenanalyse) sollten parallel verbessert werden. Abschließend neu entwickelte Gewebe Clearing-Techniken, einschließlich 3DISCO, elegant zeigen, dass hochauflösende 3D-Bildgebung von Organen intakt ist jetzt möglich. Mit Hilfe dieser Methoden können die Wissenschaftler anatomischen Informationen der Zellen und Moleküle im intakten Organ zu erhalten. Diese bahnbrechende 3D-Imaging-Studien auf transparenten Organen begeistern eine wachsende Zahl von Forschern, komplexe anatomische und molekulare Organisationen der Gewebe / Organe in Heide und Krankheit zu entschlüsseln.

Die histologische Untersuchung von biologischen Geweben ist ein grundlegender Ansatz für das Verständnis der Natur der Moleküle / Zellen in ihrem natürlichen Kontext. Idealerweise ist hochauflösende Bildgebung des gesamten Organs informativsten und erwünscht. Denn Licht hat eine begrenzte Eindringtiefe, durch Streuung ein, haben feste Organe, um hochauflösende mikroskopische Bildgebung durchführen geschnitten werden. Daher sind die meisten der histologischen Untersuchungen werden auf einigen Gewebeschnitten, die nur einen kleinen Teil des Organs erfolgt. In einigen Studien, zB solche, die mit dem Ziel zu verfolgen, aus neuronalen Verbindungen im Gehirn oder Rückenmark, alle Gewebeschnitte von den Zielorganen werden gesammelt und für eine 3D-Rekonstruktion abgebildet. , Gewebe-Schnitte und die anschließende Abbildung der einzelnen Abschnitte hat jedoch verschiedene Einschränkungen. Dazu gehören als zeitaufwendig und führt zu einer unvollständigen 3D-Rekonstruktion des Gewebes aufgrund mechanischer Verformungen und schwierign in der Ausrichtung der resultierenden Bilder. Vor kurzem hat Clearing-und Imaging intakte Organe transparent als eine bedeutende Lösung für dieses Manko 2,3 entwickelt. Beim Clearing wird das gesamte Organ transparent gemacht so dass die Abbildungslicht zu reisen Ende-zu-Ende (Abbildung 1), um hochauflösende Bilder der ungeschnittenen Orgel mit einem Laser-Scanning-Mikroskop wie ein Multi Photonen oder Lichtblatt-Mikroskop erzeugen ( Abbildung 2). Verschiedene Forschungsgruppen haben neue Gewebe Clearing-Protokolle entwickelt, um der Lage sein, ihre Bild Gewebe von Interesse für verschiedene Zwecke. Dazu zählen organische Lösungsmittel 2-5, Wasser 6,7 und Elektrophorese 8 Clearing-Protokolle. Unter diesen 3-dimensionalen Bildgebung von Organen oder Lösungsmittel gelöscht 3DISCO eine leicht anwendbare Protokoll auf einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich des zentralen Nervensystems (ZNS) Organe Immunorganen und soliden Tumoren. In zusätzlichIonen, kann es mit verschiedenen Mikroskopietechniken wie leichtes Blatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM), Multiphotonen und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie kombiniert werden. 3DISCO wird zum Löschen mit leicht verfügbaren und preiswerten Reagenzien, wie Tetrahydrofuran (THF) und Dibenzylether (DBE), 4 basiert. Das gesamte Protokoll kann so kurz wie 3-4 Stunden dauern. So ist 3DISCO eine robuste und schnelle Technik im Vergleich zu herkömmlichen histologischen Methoden, die Wochen bis Monate in Anspruch nehmen kann 9.

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Littman lab at NYU.</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>Used to prepare Avertin solution.</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzyl ether</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Lectin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0.388888889</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP pharmaceuticals</td><td>504001</td><td>Used in perfusion.</td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rotator</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Media Storage Bottles</td><td>Kimax Media Bottles</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head</td><td>Gilson, Inc</td><td>F110701 and F117606</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy slide</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix Peroxide Test Strips</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira with RT resolve microscopy module</td><td>Visage Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Neuronen sind stark mit extrem langen Morphologie polarisiert Zellen. Ihre Funktion hängt von den Verbindungen, die sie untereinander und mit anderen Geweben zu bilden. Daher ist die Abbildung der Aufbauorganisation der Neuronen, um extrem wichtig zu verstehen, wie sie in Gesundheit und Krankheit zu funktionieren. Allerdings Tracing solche enormen neuronalen Verbindungen während der gesamten Nervensystem vor kurzem connectomics 11 - immer noch eine der größten Herausforderungen in der Neurowissenschaft. Dazu haben sowohl die EU-12 und US 13 große Projekte initiiert, um das menschliche Gehirn abzubilden. Während 3DISCO kann auf verschiedene Organe eingesetzt werden, hat sich als besonders nützlich, um lange neuronale Verbindungen im Rückenmark und im Gehirn zu verfolgen gewesen. Zum Beispiel mit Ultramikroskopie Scans von großen gelöscht Rückenmarksegmente, die axonalen Verbindungen können über Zentimetern in der Nagetier-Rückenmark (folgenAbbildung 2). In ähnlicher Weise kann die gesamte gelöscht Mausgehirn (Abbildung 3a) und Hippocampus (Fig. 3b) dargestellt werden, um neuronale Verbindungen im Gehirn zu folgen. Wenn konfokalen oder Mehrphotonenmikroskopie auf gelöscht Organen verwendet wird, kann die Bildauflösung wesentlich verbessert werden, insbesondere in der z-Dimension. Zum Beispiel, Multi Photonen-Imaging geräumte Rückenmark von GFP-M-Linie Mäuse (Abbildung 4a) erreicht eine nahtloses Bild über die gesamte Tiefe (~ 1,5 bis 2 mm) des Rückenmarks. Konfokale Mikroskopie auf die freiRückenMark liefert eine verbesserte Auflösung in einer ähnlichen Art und Weise (Fig. 4b und c). Multiphotonenmikroskopie Bildgebung gelöscht Gehirn liefert sehr hochauflösende Bilder, feine Details der neuronalen Strukturen, einschließlich dendritischen Dornen (Abbildung 5) zu visualisieren. Die Proben für 3DISCO kann auf verschiedene Arten einschließlich Transgenexpression markiert werden, viral-Transfektion, Farbstoff Verfolgung und Antikörpermarkierung. Zum Beispiel ist es möglich, den gesamten Gefäßsystem des Gehirns (Fig. 6a und b) und Rückenmark (Fig. 6c und d) mit Lectin konjugiert fluoreszierende Tracer 4, die verwendet werden können, um die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen (BBB kenn ) in Gesundheit und Krankheit. Beide Mikroglia und Astrozyten sind hoch in der Pathologie von Neurodegeneration wie Alzheimer-Erkrankungen und Traumata 14,15 gebracht. Verwendung 3DISCO, ihre Dichte und Verteilung im Rückenmark (Fig. 7) oder des Gehirns untersucht werden. Nicht-neuronalen Geweben können auch dargestellt werden. Zum Beispiel kann Clara-Zellen im gesamten Lunge mit Nagetier-Antikörpern immun und abgebildet ohne Schneiden zu Einzelzellebene (Fig. 8) werden. Ebenso ist es möglich, zu löschen und Bildzellen beispielsAlpha-Zellen in der ungeschnittenen Pankreasgewebe (Abbildung 9). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. 3DISCO Gewebe Clearing macht ungeschnittenen Gewebe transparent für tiefe Gewebe-Bildgebung. Ungeklärten (a) und gelöscht (b) des Rückenmarkgewebes durch sichtbares Licht zu sehen. Beim Clearing, wird tiefe Gewebe-Laser-Scanning-Mikroskopie möglich. (C) Ungeklärten gelöscht und Rückenmark Gewebe wurden durch 2-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Maßstabsbalken in einem, b = 0,5 mm und c = 100 &amp;mgr; m. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. 3DISCO Bildgebung des Rückenmarks zu axonalen Erweiterungen folgen. Seziert Das Rückenmark von Thy-1-GFP-transgene Mauslinie (GFP-M) wird in kleinere Stücke geteilt (~4 mm). Nach folgenden Clearing-Protokoll für kleine Gewebe (Tabelle 1) die transparenten Rückenmark wurden mit Ultramikroskopie visualisiert. 3D-Rekonstruktionen von ~ 4 mm Rückenmark Segment in horizontaler (a), koronare (b) und sagittale Ansicht (c). (D) Vertreter zurückzuführen Axonen (rot) sind in der Graustufen transparent dargestellt. (E) Hochvergrößerungsansicht des angegebenen Bereichs in (d). Maßstabsbalken in a, b, c, d = 0,5 mm und e = 20 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. 3DISCO Bildgebung des Gehirns und gelöscht Hippocampus. Beispiele gelöscht Gehirne und Hippocampus von GFP-M-Mäuse wurden mit einem Ultramikroskop abgebildet. 3D-Visualisierungen des gesamten Gehirns (a) und Hippocampus (b) Nachweis der neuronalen Netzwrks in der abgebildeten transparente Gewebe. Maßstabsbalken in A = 2 mm und b = 20 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Tissue Clearing verbessert die durch Mehrphotonenmikroskopie und konfokaler Auflösung. Transparent Rückenmarksegmente von GFP-M Mäusen durch Multiphotonen (a) oder die konfokale Mikroskopie abgebildet (b, c). Beachten Sie, dass Clearing verbessert wesentlich die Auflösung und die Bildtiefe enthüllt die Feinstruktur von Axonen und Dendriten. Maßstabsbalken in einer = 100 pm und b, c = 20 um. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. 3DISCO Bildgebung von dendritischen Dornen. Transparent Hirngewebe von GFP-M Mäusen durch Multiphotonen abgebildet. 3D-Visualisierungen von gescannten Kortex Region in Version vorgestelltsche (a) und horizontale Perspektiven (b). (C) ~ 50 &amp;mgr; m aus den Projektions angegebenen Ebenen (a, b). (D) Hohe Vergrößerung der angegebenen Region in (c) zeigt die feinen Details der neuronalen Strukturen, einschließlich dendritischen Dornen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken in einem = 50 pm, b, c = 25 um, d = 5 um. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. 3DISCO des Gefäßsystems. Um die Blutgefäße in den ganzen Organen beschriften, wurde Lektin-FITC-Farbstoff während der Perfusion (vor dem Löschen) verwendet, wie beschrieben 16. Es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass wir fanden, dass Schwanzvenen-Injektion des Tracers gibt bessere Signal über Herzdurchblutung des Tracers. Nach dem Sammeln der Fest Gehirn und Rückenmark, werden sie gelöscht und ich wurdenvon Ultramikroskopie maged. 3D-Visualisierung des gesamten Gefäßsystems im Gehirn der Maus Heatmap (a) und Graustufen (a). (B) 3D-Visualisierung des Gefäßsystems eines Rückenmark der Maus in heatmap Segment (c) und Graustufen (d). Die Heat wurden basierend auf der Intensität der Färbung Lektin erzeugt wird; blau: niedrige Intensität (Hintergrund) und rot: hohe Intensität (Gefäßsystem). Maßstabsbalken in der a = 2 mm, b = 1 mm, und c, d = 250 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. 3DISCO von Gliazellen im ZNS-Gewebe gelöscht. Die Rückenmark von transgenen Mäusen, die GFP in Mikroglia TgH (CX3CR1-EGFP) oder Astrozyten TgN (hGFAP-ECFP) wurden gelöscht und durch Mehrphotonenmikroskopie abgebildet. 3D-Rendering von Mikroglia als Oberflächenvolumenvisualisierung (a) und transparent (gezeigt <sTrong&gt; b). (C) einem optischen Projektions (~ 50 &amp;mgr; m) dargestellt, um die Details der Mikroglia im Rückenmark zu zeigen. 3D-Rendering von Astrozyten als Oberflächenvolumenvisualisierung (a) und transparent (b) gezeigt. (F) einem optischen Projektions (~ 50 &amp;mgr; m) dargestellt, um die Details der Astrozyten im Rückenmark zu zeigen. Maßstabsbalken in a, b, d, e = 100 &amp;mgr; m und c, f = 50 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. 3DISCO einer whole-mount Lungenlappen mit Antikörperfärbung von Clara-Zellen. Für die Whole-mount-Antikörper-Färbung von Lungenlappen, 10 Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse wurden durch die rechte Herzkammer mit PBS perfundiert, um Blut aus der Lunge zu entfernen. Lungen wurden anschließend mit 4% PFA mindestens das dreifache Volumen der th aufgeblasen und fest O / N bei RT in Fixative Gewebe. Am nächsten Tag wurden die Lungen kurz in PBS gespült und der rechte Lappen wurde in 5 ml 1% Triton X-100 in PBS für Permeabilisierung für 48 Stunden oder bis das Gewebe sank setzen. Alle Färbungen wurden in 0,2% Triton X-100 in PBS durchgeführt, das 5% FBS und 2% BSA und Spülungen wurden in 0,2% Triton X-100 in PBS. Die Färbung mit anti-CC10 wurde 72 h bei 4 ° C, gefolgt von umfangreichen Wasch etwa 6 Stunden. Fluoreszenz-Markierung des primären Antikörpers wurde mit Anti-Ziege-Alexa Fluor 594-Sekundär-Antikörper über Nacht bei 4 ° C durch extensive Waschungen für 6 h bis über Nacht, gefolgt erreicht. Am folgenden Tag wurden gefärbt durch Lappen 50%, 70% und 80% THF für 30 min geklärt jeweils gefolgt von drei 30-minütigen Waschungen in 100% THF, gefolgt von 20 min in DCM, gefolgt von 30 min in DBE. Maßstabsbalken in einer und b = 1 mm und c = 100 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Abbildung<html> 9. 3DISCO der Bauchspeicheldrüse. Nach Perfusion von Mäusen, wie oben beschrieben, in das Protokoll, das Pankreas wurde präpariert und mit dem Kurzprotokoll gelöscht. Die Fluoreszenz wird von LSL ROSA26 tdTomato Rekombination durch Tamoxifen-Behandlung von Mäusen, die eine 200 kb BAC Transgens überspannt den endogenen Maus-Glucagon Ortes mit CreERT2 in die ATG von Glukagon eingesetzt induzierte abgeleitet. Die Pfeilspitzen markieren einige der fluoreszenz-markiertem alpha-Zellen in der Insel. Maßstabsbalken in a, b und c = 1 mm und d = 500 &amp;mgr; m. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabelle 1. Tissue Clearing-Protokolle für die verschiedenen Geweben. Beispiele für Gewebe Clearing-Protokolle für verschiedene Gewebe. Beachten Sie, dass die Clearingzeit für jeden Schritt kann verkürzt oder verlängert, wie nötig, um die Clearing-Leistung zu verbessern. Das ungefähre Gewicht der kleinen Geweben ~ 20-100 mg und Gehirn ist ~ 300-500 mg.TTPs :/ / jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K Aufrufe.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

Serie: Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and its associated LNs. The CNS-associated lymphatic system is involved in the drainage of CSF macromolecules and meningeal immune cells toward CNS-draining LNs, thereby regulating waste clearance and immune surveillance within CNS tissues. Presented is a novel approach to obtain three-dimensional (3D) and cellular resolution images of CNS-associated lymphatics while preserving the integrity of their circuits within surrounding tissues. The iDISCO+ protocol is used to immunolabel lymphatic vessels in decalcified and cleared whole mount preparations of the vertebral column that are subsequently imaged with light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The technique reveals the 3D structure of the lymphatic network connecting the meningeal and epidural spaces around the spinal cord to extravertebral lymphatic vessels. Provided are 3D images of the drainage circuits of molecular tracers previously injected into either the CSF via the cisterna magna or the thoracolumbar spinal parenchyma. The iDISCO+/LSFM approach brings unprecedented opportunities to explore the structure and function of the CNS-associated lymphatic system in neurovascular biology, neuroimmunology, brain and vertebral cancer, or vertebral bone and joint biology.

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

A protocol is presented combining tissue clearing with light sheet fluorescence microscopy (LSFM) to obtain three-dimensional and cellular resolution images of the lymphatic vessels and lymph nodes (LNs) collecting the cerebrospinal fluid (CSF) and spinal epidural fluid.

Dreidimensionale Bildgebung der wirbelförmigen lymphatischen Vaskulatur und Drainage mit iDISCO+ und Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and ...

Immunologie und Infektion

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Biologie

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...

3D Visualization of Immune Cell Populations in HIV-Infected Tissues via Clearing, Immunostaining, Confocal, and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 million individuals infected worldwide and no widely accessible cure. Despite intensive efforts, a detailed understanding of virus and host cell interactions in tissues during infection and in response to therapy remains incomplete. To address these limitations, water-based tissue clearing techniques CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) and CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) are applied to visualize complex virus host-cell interactions in HIV-infected tissues from animal models and humans using confocal and light sheet fluorescence microscopy. Optical sectioning of intact tissues and image analysis allows rapid reconstruction of spatial information contained within whole tissues and quantification of immune cell populations during infection. These methods are applicable to most tissue sources and diverse biological questions, including infectious disease and cancer.

Tissue clearing, combined with immunofluorescence microscopy, allows spatial visualization and quantification of immune-cell populations and virus proteins within intact tissues. Optical sectioning of cleared tissues with confocal and light sheet fluorescence microscopy can generate 3D models of complex tissue environments and reveal spatial heterogeneity exhibited during HIV infection.

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierte Gewebereinigungsprotokolle für die 3D-Bildgebung der murinen Aorta

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial wall, including the intima plaque, the media, and the adventitia, which forms the outer connective tissue coat of arteries. Our recent studies have suggested that the adventitia is used by the peripheral nervous system as a conduit for reaching all tissue cells. We also found that the peripheral nervous system, that is, the sensory and sympathetic nervous system, undergoes major remodeling processes involving the neogenesis of axon networks adjacent to atherosclerotic plaques. In this context, understanding the structure of the neural network and its interactions with vascular components of diseased arteries holds major promises for a better understanding of cardiovascular disease pathogenesis. To achieve these objectives, methods to visualize the subcellular architecture of the intact healthy and diseased arteries together with their surrounding perivascular compartments are needed. Tissue clearing allows intact deep-tissue imaging of larger tissue compartments that are otherwise inaccessible. It allows volumetric imaging of intact arteries through the integration of labeling, clearing, advanced microscopic imaging, and image processing tools. Here, we describe two distinct but complementary passive tissue clearing approaches, that is, aqueous-based 2, 2-thiodiethanol (TDE) clearing and solvent-based immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organ (iDISCO) clearing to image isolated aortic segments or whole aorta in-situ in the whole mouse.

<meta charset="utf8"></head><body>Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Here, we present optimized tissue-clearing protocols to image the murine aorta in three dimensions (3D). We delineate state-of-the-art procedures for immunostaining, optical clearing, and imaging with the intent to define the anatomical proximity of the peripheral nervous system with atherosclerotic plaques and the adventitia in atherosclerosis.

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial ...

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

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Kapitel in diesem Video

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Dreidimensionale Bildgebung der wirbelförmigen lymphatischen Vaskulatur und Drainage mit iDISCO⁺ und Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Imaging the Gut with "CLARITY"

3D Visualization of Immune Cell Populations in HIV-Infected Tissues via Clearing, Immunostaining, Confocal, and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose